一个软质、抗白粉病普通小麦-簇毛麦易位系的选育、鉴定方法

技术领域

本发明专利公开一个软质、抗白粉病普通小麦-簇毛麦T5VS·5AL易位系NAU421的选育、 鉴定方法，属于植物育种技术领域。

背景技术

簇毛麦(Dasypyrum villosum(L.)Schur)(2n＝2x＝14，VV)是原产于地中海沿岸东北部和 西南亚地区的普通小麦二倍体亲缘物种，具有优良的品质性状及抗多种小麦病害，是小麦品种 改良重要的三级基因资源(见参考文献：Agnieszka Gradzielewska.The genus Dasypyrum-part 2. Dasypyrum villosum-a wild species used in wheat improvement.Euphytica,2006,152:441-454)。南 京农业大学细胞所利用从英国剑桥植物园引进的簇毛麦91C43为供体，选育了一套普通小麦- 簇毛麦异附加系(见参考文献：Zhang W,Zhang RQ,Feng YG,Bie TD,Chen PD.Distribution of  highly repeated DNA sequences in Haynaldia villosa and its application in the identification of alien  chromatin.Chin Sci Bull,2013,58:890–897)。

籽粒硬度是决定小麦加工品质的主要遗传因素，控制普通小麦的籽粒硬度基因Pina/Pinb 位于5DS末端，小麦5AS、5BS缺失籽粒硬度基因。此外，小麦近缘物种也存在控制籽粒硬 度的基因，本专利申请者已证实了簇毛麦籽粒软质基因定位于5VS的末端，基因型为 Dina-D1a/Dinb-D1a。(见参考文献：Zhang Ruiqi,Wang Xiue,Chen Peidu.Molecular and  cytogenetic characterization of a small alien-segment translocation line carrying the softness genes of  Haynaldia villosa.Genome,2012,55:639-646)。如果将5VS携带的软质基因转移到普通小麦5A 或5B染色体上，则普通小麦就同时有两个位点控制胚乳质地，从而形成超软胚乳结构的新种 质。

白粉病是小麦的主要病害，来自簇毛麦的抗白粉病基因Pm21是我国目前抗病育种的主 要抗源，已有数十个含有Pm21基因的品种在生产上利用(见参考文献：Li,G P,Chen P D, Zhang H Z,Wang X E,He Z H,Zhang Y,Zhao H,Huang,H Y,Zhou X C.Effects of the 6VS.6AL  translocation on agronomic traits and dough properties of wheat.Euphytica,2007,155,305-313)。随 着该基因的不断广泛利用，其被新病原菌生理小种克服的风险也在加大，因此，进一步从簇毛 麦中发掘新的抗病基因十分必要。另外，中国近几十年抗白粉病育种的实践表明，育种工作总 是在被动地追赶病原菌生理小种的变化，由于生理小种不断变化，致使新品种在大面积推广 3-5年后抗性就明显丧失，甚至有的品种还未审定抗性就已丧失。因此，利用成株抗性基因可 能是未来实现品种持久抗性的最佳选择。研究已证实簇毛麦5VS上携带一个白粉病成株抗性 基因，因此，将簇毛麦5VS携带的软质、抗病基因导入普通小麦，对于培育优质、抗病弱筋 品种十分必要。

本发明专利通过中国春ph1b1b突变体与簇毛麦5V异附加系DA5V杂交、回交，在后代 中利用追踪5VS特异分子标记、基因组原位杂交(GISH)及染色体C-分带鉴定，选育出1个 中国春背景的普通小麦-簇毛麦T5VS·5AL易位系NAU421。利用筛选出的共显性标记结合 GISH鉴定从扬麦15×NAU421的F₂群体和F_2：3家系分析T5VS·5AL易位染色体的遗传效应 以明确该易位系的育种利用价值。

发明内容

本发明的目的是公开一个软质、抗白粉病普通小麦-簇毛麦T5VS·5AL易位系NAU421的 选育方法以及鉴定该易位的共显性分子标记Xcinau5VS-1，并评价该易位系对籽粒胚乳质地及 白粉病抗性的效应。

一种软质、抗白粉病普通小麦-簇毛麦T5VS·5AL易位系NAU421的选育方法，将中国春 突变体CSph1bph1b与普通小麦-簇毛麦5V染色体异附加系DA5V进行杂交，再用中国春突变 体CSph1bph1b进行回交获得BC₁；种植BC₁种子，利用分子标记CINAU41的引物对苗期DNA 进行鉴定，经电泳检测，有745bp特异条带的单株表明含有5V染色体；对含有5V染色体的 单株再利用ph1b基因特异分子标记ABC302.3的引物进行ph1b隐性纯合体筛选，经电泳检测， 缺少920bp特异条带的单株表明是ph1bph1b纯合单株；将含有外源染色体5V且ph1bph1b纯 合体的植株进行花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ染色体配对观察，统计外源染色体与小麦染色体配 对频率，将含有部分同源染色体配对的植株套袋自交，获得BC₁F₁，将BC₁F₁种子在培养皿中 发芽，分单株剪取根尖进行荧光原位杂交鉴定，分单株提取DNA，利用5VS特异分子标记 CINAU41，进行PCR鉴定，对鉴定出涉及5VS的易位系单株套袋自交获得BC₁F₂种子；将 BC₁F₂种子种植于温室大棚并提取BC₁F₂单株DNA，再次应用CINAU41的引物对单株DNA 进行PCR扩增，经电泳检测，有745bp特异条带的单株表明含有5VS染色体臂,然后再利用 5AS特异分子标记Xgwm443的引物对含有5VS染色体臂的单株DNA进行PCR扩增，经电泳 检测，扩增不出245bp特异条带的单株表明缺少5AS染色体，即为纯合的T5VS·5AL易位系。

所述的方法还包含对纯合的T5VS·5AL易位系单株套袋自交，获得BC₁F_2:3；将BC₁F_2:3种 子在培养皿中发芽，分单株剪取根尖依次进行细胞学鉴定，进一步确定易位染色体的身份。

所述的分子标记CINAU41的引物为CINAU41F：SEQ ID NO.1，CINAU41R:SEQ ID NO.2； 所述的分子标记ABC302.3的引物为ABC302.3F：SEQ ID NO.3，ABC302.3R:SEQ ID NO.4； 所述的5AS特异分子标记Xgwm443的引物为：Xgwm443F:SEQ ID NO.5，Xgwm443R:SEQ ID NO.6。

所述的细胞学鉴定包括C-分带和分子原位杂交：利用荧光原位杂交对CS ph1b BC₁单株进 行花粉母细胞中期Ⅰ观察，绿色信号为簇毛麦5V染色体，红色信号为小麦染色体若形成的二 价体中既有绿色信号又有红色信号，表明簇毛麦5V染色体与小麦染色体间发生了同源染色体 配对；簇毛麦5VS染色体臂有强的末端C-分带带纹特征，小麦5AL染色体臂有强的中间C- 分带带纹特征，根据这些特征，对BC₁F_2:3代获得的易位系材料依次进行C-分带检测和荧光原 位杂交检测，若易位染色体的短臂是绿色信号且具有强的末端C-分带带纹特征，长臂为红色 信号且有强的中间C-分带带纹特征，表明该易位系为T5VS·5AL染色体易位系。

用于追踪本发明所述普通小麦-簇毛麦T5VS·5AL易位系NAU421的1个共显性分子标记 Xcinau5VS-1，该分子标记引物为XCINAU5VS-1F:SEQ ID NO.7，XCINAU5VS-1R:SEQ ID NO.8； 利用该分子标记引物对T5VS·5AL染色体易位系进行PCR扩增，能够扩增出5VS 700 bp的特 异条带，而缺少小麦5AS 750 bp的特异条带。

所述的分子标记Xcinau5VS-1在分子标记辅助选择育种中的应用。

有益效果：

1、普通小麦中国春-簇毛麦T5VS·5AL易位系NAU421是补偿性整臂易位系，农艺性状优良 且携带一个显性的小麦白粉病成株期抗性基因。

2、普通小麦中国春-簇毛麦T5VS·5AL易位系NAU421同时携带两个控制籽粒硬度的基因位 点，分别位于5VS和5DS上，该易位系能显著降低籽粒硬度值，具有超软胚乳结构。

3、本发明公开的1个共显性分子标记Xcinau5VS-1可有效地鉴定该易位染色体，并可以区分 纯合或杂合易位，用于分子标记辅助选择育种。

附图说明

图1为T5VS·5AL易位系NAU421的根尖细胞有丝分裂中期染色体基因组原位杂交 (2n＝42)(a)，花粉母细胞减数分裂中期I染色体基因组原位杂交(21Ⅱ)(b)，普通小麦中 国春5A染色体的C-分带(c)，簇毛麦5V染色体的C-分带(d)，T5VS·5AL易位染色体的C- 分带(e)和基因组原位杂交(f).a、b和c中发出绿色荧光信号的为簇毛麦易位染色体片段5VS， 发出红色或蓝色荧光信号的为小麦染色体。

图2为共显性标记Xcinau5VS-1在T5VS·5AL易位系NAU421、亲本和中国春第五群缺体 -四体系的扩增及染色体定位.从左到右依次为，泳道1:DNA Marker，DL2000；2:中国春；3:簇 毛麦；4:T5VS·5AL易位系NAU421-1；5:T5VS·5AL易位系NAU421-2；6:T5VS·5DL易位系 NAU415；7:硬粒小麦中引1286；8:中国春5A缺体-四体(N5AT5D)；9:中国春5B缺体-四体 (N5BT5D)；10:中国春5D缺体-四体(N5DT5A)。

图3为中国春和T5VS·5AL易位系NAU421的穗型，左为中国春穗型，右为NAU421穗 型。

图4为普通小麦-簇毛麦T5VS·5AL易位系NAU421成株期白粉病抗性鉴定，从左到右依 次为中国春、T5VS·5AL(NAU421)、(NAU421/扬麦15)F1、扬麦15的开花期倒二叶叶片。

图5为普通小麦-簇毛麦T5VS·5AL易位系NAU421苗期抗白粉病性鉴定，从左到右依次 为中国春、T5VS·5AL(NAU421)、抗病对照09P190(Pm21基因)的二叶期植株。

生物保藏

NAU421，分类命名为普通小麦Triticumaestivum，种子保存于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2014-9-12，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号 院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.9598。

具体实施方式

(1)利用控制同源染色体配对体系突变体，诱导簇毛麦5V染色体与普通小麦5A染色体易位

将中国春突变体CSph1bph1b(见参考文献：Gill K S and Gill B S.A DNA fragment mapped  with in the submicroscopic deletion of Ph1,a chromosome pairing regulator gene in polyploid wheat. Genetics.1991,129:251-259.王新望，赖菁茹，陈梁鸿，刘广田.中国春ph1b突变体的分子鉴 定.中国农业科学，1998,31(5):31-34)与普通小麦-簇毛麦5V异附加系DA5V(见参考文献： Zhang Wei,Zhang Ruiqi,Feng Yigao,Bie Tongde,Chen Peidu.Distribution of highly repeated DNA  sequences in Haynaldia villosa and its application in the identification of alien chromatin.Chinese  science bulletin,2013,58:890–897.)进行杂交，再用CSph1bph1b进行回交获得BC1，将BC₁种子种植于温室大棚，利用分子标记CINAU41(见参考文献：曹亚萍，曹爱忠，王秀娥，陈 佩度.基于EST-PCR的簇毛麦染色体特异分子标记筛选及应用。作物学报，2009，35(1), 1-10.)(引物序列：F：CTCCAAGAGCCCAGATAG(SEQ ID NO.1))；R: AGGGTGGGGAGAAAGTTA(SEQ ID NO.2))对苗期NDA进行鉴定，经电泳检测，有745bp 特异条带的单株表明含有5V染色体。对含有5V染色体的单株再利用ph1b基因特异分子标记 ABC302.3(见参考文献：王新望，赖菁茹，陈梁鸿，刘广田.中国春ph1b突变体的分子鉴定. 中国农业科学，1998,31(5):31-34)(引物序列：F：ATAAAGGAGAAGATTGAGTC(SEQ ID  NO.3)；R:A TAAGAAACAGGAACAGAG(SEQ ID NO.4))进行ph1b隐性纯合体筛选，经 电泳检测，缺少920bp特异条带的单株表明是ph1bph1b纯合单株。将含有外源染色体5V且 ph1bph1b纯合体的植株进行花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ染色体配对观察，共观察了380个植 株的花粉母细胞，其中5V染色体与小麦第五部分同源群染色体发生配对的仅有3个植株，配 对频率仅为0.8％左右。将含有部分同源染色体配对的植株套袋自交，获得BC₁F₁。将BC₁F₁种子在培养皿中发芽，分单株剪取根尖保存于4℃冰箱进行细胞学鉴定，利用荧光原位杂交技 术共鉴定了500粒种子，其中涉及5VS或5VL染色体臂易位的有15株，然后将这15株幼苗 移栽到温室大棚，单株提取DNA，应用5VS特异分子标记CINAU41，进行PCR鉴定，有5 株DNA扩增出了745bp的5VS特异条带，表明这5个单株是涉及5VS的易位系单株；分别 将这5个单株套袋自交，获得BC₁F₂种子；每个单株取50粒BC₁F₂种子种植到温室大棚，苗 期取叶片提取单株DNA，同时利用分子标记CINAU41进行PCR鉴定，经电泳检测，有745bp 特异条带的单株表明含有5VS染色体臂，然后再利用5AS特异分子标记Xgwm443引物(引物 序列：F:GGGTCTTCATCCGGAACTCT(SEQ ID NO.5)；R:CCATGATTTATAAATTCCACC (SEQ ID NO.6))对含有5VS染色体臂的单株DNA进行PCR扩增，经电泳检测，扩增不出 245bp特异条带的单株表明缺少5AS染色体臂，即为纯合的T5VS·5AL易位系；对纯合的易 位系单株套袋自交获得获得BC₁F_2:3；将BC₁F_2:3种子在培养皿中发芽，分单株剪取根尖进行细 胞学鉴定。簇毛麦5VS染色体臂有强的末端C-分带带纹特性，小麦5AL染色体臂有强的中间 C-分带带纹特性，根据这些特征，对BC₁F_2:3代获得的易位系材料依次进行染色体C-分带检测 和荧光原位杂交检测(绿色信号为簇毛麦5VS染色体臂，红色信号为小麦染色体)，若易位 染色体的短臂是绿色信号且具有强的末端C-分带带纹特征，长臂为红色信号且有强的中间C- 分带带纹特征，进一步确定该易位系为T5VS·5AL易位系。

(2)根据已定位于普通小麦第五部分同源群EST序列设计引物，筛选鉴定T5VS·5AL易位染 色体的共显性分子标记

利用小麦的Unigene ESTs序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene)设计PCR引物，从 中筛选出1个共显性标记Xcinau5VS-1,(XCINAU5VS-1F:GTTTATCAGGCGGTGCCATA(SEQ  ID NO.7)；XCINAU5VS-1R:GGACTTCTTGCTCCCCTTTC(SEQ ID NO.8))T5VS·5AL易位 系NAU421可以扩增出5VS 700bp的特异条带，而缺少小麦5AS 750bp的特异条带(表1， 图2)。

(3)普通小麦-簇毛麦T5VS·5AL易位系NAU421的籽粒硬度及农艺性状分析

为了了解该易位染色体对主要农艺性状的效应，揭示该易位系的利用价值，本专利于 2013-2014年度在南京农业大学江浦实验农场，对中国春，T5VS·5AL易位系的两个株系 NAU421-1和NAU421-2的籽粒硬度及主要农艺性状比较发现，易位染色体对株高、穗长没有 显著影响，但对小穗数、穗粒数和千粒重有正向效应；而易位系的籽粒硬度值显著低于背景亲 本中国春，表明携带两个软质基因位点的易位系具有超软的胚乳结构(表2)。

(4)普通小麦-簇毛麦T5VS·5AL易位系NAU421抗白粉病性效应分析

为了解T5VS·5AL易位系对白粉病的抗性，利用南京地区的白粉菌混合生理小种分别于 2013年、2014年对种植于江浦大棚的NAU421，扬麦15，扬麦15/NAU421 F₁及扬麦15/NAU421 F₂接种鉴定。分别在抽穗期、灌浆期调查白粉病抗性。所有调查材料分为两种类型，即高抗植 株(无病斑)和感病植株(有病斑)。结果表明所有含有易位染色体的单株均高抗白粉病，无 外源单株均高感白粉病(图4，表3)；同时，苗期鉴定在温室利用混合菌株对2叶期的实验 材料中国春、NAU421及抗病对照材料09P190进行了接种鉴定，中国春与NAU421均感病(图 5)。证实T5VS·5AL易位系携带一个白粉病成株抗性基因，定名为Pm5VS。

表1鉴定普通小麦-簇毛麦T5VS·5AL易位系NAU421的共显性标记

表2普通小麦-簇毛麦T5VS·5AL易位系NAU421与其背景亲本中国春籽粒硬度和农艺性状比 较

注：不同字母表示同一遗传背景内易位系后代与亲本差异达5％显著水平

表3扬麦15/NAU421 F₂群体白粉病成株鉴定