海洋真菌次级代谢产物衍生物及其作为海洋生物防污剂的应用

技术领域

本发明属于海洋防污领域，具体涉及一种可作为海洋生物防污剂的海洋真菌来源的异香豆素类化合物的衍生物及其制备方法。

背景技术

海洋生物污损是指海洋污损生物如藤壶、贻贝、苔藓虫等的幼虫在船体、鱼箱、油井等海洋设施或其它海洋生物表面附着生长而形成群落，从而对被附着物造成巨大损害，如加速金属腐蚀、降低海洋设施性能、影响水产养殖业产量和质量等。在海洋污损生物中，藤壶是分布最广、危害最大的一类。全世界每年由于海洋生物污损导致的经济损失巨大。以船舶为例，污损生物在船底附着，使船舶燃料消耗增加40%，航行代价高达77%，为此全球航运每年损失约30亿美元。目前使用的防污损材料主要是在船体等设施表面涂布含有杀虫剂或有机金属的有机涂料。这些防污损材料在发挥防污损作用的同时也严重破坏了海洋环境，如有机锡氧化物（TBTO）使许多鱼类和海洋生物的免疫系统遭到破坏，而杀虫剂对目标污损生物和非目标生物都产生毒害，并直接危害人类健康。因此，寻找高效、低毒的天然海洋生物防污剂已成为各国面临的重大课题。海洋高盐、高压、低温、寡营养、低光照等特殊条件使海洋微生物能够产生大量结构新颖、活性独特的次级代谢产物，其中有些化合物具有防污损活性，为了获得更多高效、低毒的海洋生物防污剂，对海洋天然防污剂进行结构修饰，阐明其构效关系成为当务之急。

发明内容

本发明的目的在于对中国专利（申请号：201310429588.8）中海洋真菌来源的抗污损化合物进行化学修饰，得到系列抗污损活性优异的衍生物，同时提供该类衍生物的制备方法及其作为海洋生物防污剂的应用。

本发明提供一种式I结构的异香豆素类化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于式I化合物具有如下结构：

其中R₁、R₂各自独立地为H、，且R₁、R₂中有一个为H；R₃、R₄各自独立地为H、OCH₃，且R₃、R₄中有一个为H；R₅、R₆各自独立为H、C1-C4烷基、C2-C4烷基酰基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷基磺酰基、C2-C4烯基、C3-C8环烷基、C7-C12芳基烷基，其中所述烷基、烷基酰基、卤代烷基、烷基磺酰基、烯基、环烷基、芳基烷基，任选被一个或多个羟基、巯基、氨基、卤素、C1-C4烷基取代；“-----”表示单键或不存在；前提条件是当“-----”表示单键时，R₅、R₆中至少1个不为H。

本文中所述“烷基”优选甲基、乙基、丙基、正丁基、异丁基、叔丁基；“烷基酰基”优选乙酰基、丙酰基、正丁酰基、异丁酰基；“烷基磺酰基”优选甲基磺酰基、乙基磺酰基、丙基磺酰基；“烯基”优选烯丙基；“环烷基”优选环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基、环庚烷基；“芳基烷基”优选苄基、苯基乙基；“卤素”优选氟、氯、溴、碘。

本发明中术语“药学上可接受的盐”是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成盐。可参见“Salt selection for basic drugs”, Int. J. Pharm. (1986), 33, 201–217。

式I化合物选自如下化合物：

，其立体异构体或药学上可接受的盐。

在另一优选例中，式I化合物中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆选自上述具体化合物2、4-5、7-9、11-14、16、21-27中相应位置的具体基团。

应理解，上述优选基团可相互组合以形成本发明的各种优选化合物，限于篇幅，在此不一一累述。

本发明提供一种海洋生物防污剂，其特征在于以上述式I结构的异香豆素类化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐作为有效成分，用于防治藤壶Balanus amphitrite幼虫附着引起的海洋生物污损。

本发明提供的海洋生物防污剂中还可包括其他具有海洋生物防污作用的成分。

本发明提供的海洋生物防污剂中还可包括载体、稀释剂或赋形剂。

本发明提供式I结构的异香豆素类化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐在制备海洋生物防污剂方面的应用。

本发明提供式I化合物的制备方法，包括以下几个方案：

方案一：

式II化合物在经氢化还原后得到式I-1化合物，氢化还原条件为本领域常规催化氢化条件：有机溶剂中，催化剂、H₂作用下还原反应，优选0~80^oC，0.1~10MPa H₂下还原，催化剂优选10%Pd/C、Pt/C、PtO₂还原，式II、式I-1中R₁、R₂、R₃、R₄定义的基团与式I化合物中定义的基团相同，且式I-1中的R₁或R₂中的双键与“-----”表示的单键不能同时存在。

方案二：

式II化合物或式I-1化合物（式II、I-1化合物的定义同上）经烃化反应或酰化反应式I-2化合物，烃化反应条件为本领域常规条件：有机溶剂中，在碱、烃化试剂作用下反应，其中烃化试剂优选RX，其中X为卤素，优选氯、溴、碘，R为C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C2-C4烯基、C3-C8环烷基、C7-C12芳基烷基，上述取代基任选被一个或多个羟基、巯基、氨基、卤素、C1-C4烷基取代；碱优选碱金属氢化物（如NaH、LiH）、碱金属烷基化物（BuLi、t-BuLi）、碱金属氢氧化物（如NaOH、KOH）、碱金属碳酸盐（如Na₂CO₃、K₂CO₃）、金属氧化物（如AgO）等；酰化反应条件也为本领域常规条件：有机溶剂中，在碱、酰化试剂作用下反应，其中酰化试剂优选R′COX（酰卤）、R′COOCOR′（酸酐）或R′-S(=O)₂-X（磺酰卤）,其中X为卤素，优选氯、溴、碘，R′为C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、C1-C4烷基，上述取代基任选被一个或多个羟基、巯基、氨基、卤素、C1-C4烷基取代；碱优选碱金属氢氧化物（如NaOH、KOH）、三乙胺、吡啶、醋酸钠、喹啉、咪唑、二甲基苯胺等；其中有机溶剂优选苯、甲苯、THF、乙醚、乙二醇二甲醚、DMF、二氧六环等。

上述合成方法中给出了包含在式I化合物范围内的式I-1、式I-2的合成方法，即式I为大通式化合物，式I-1、式I-2为其子集。

应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。

实施例1

称取10 mg化合物1溶于5mLCH₃OH/CH₂Cl₂(体积比1：1)中，加入催化量的10%Pd/C，在1 atm H₂作用下，室温反应10 h后，TLC检测反应完全，过滤除去Pd/C，浓缩后，得到油状物9.9 mg，产率98.4%，HPLC检测纯度在96%以上，ESI-MS m/z: 373.2 [M＋Na]^＋。

实施例2

称取20 mg化合物3溶于5 mL CH₂Cl₂中，加入催化量的PtO₂，在1 atm H₂作用下，室温反应4 h后，TLC检测反应原料几乎完全消失生成两个极性偏小的点，过滤除去PtO₂，浓缩后，经硅胶柱层析（洗脱剂为EtOAc/石油醚=10：1 ~ 8：1），得到化合物4（13.5 mg），产率67.2%，化合物5（4.8 mg），产率23.9%，HPLC检测纯度均在98%以上，ESI-MS m/z: 371.2 [M＋Na]^＋，经¹H NMR谱图比较，确定化合物4、5的结构，化合物4中不存在δ5.4左右的两个H（5'、6'位的双键氢），但在1.7左右存在两个单峰个3个H（(CH₃)₂C=C-），化合物5中恰好相反，存在δ5.4左右的两个H（5'、6'位的双键氢），两个CH₃（(CH₃)₂CH-）向高场移动。

实施例3

称取10 mg化合物6溶于5 mL THF中，加入5 mg Na₂CO₃，室温下搅拌半小时后，加入5μL EtBr，30^oC下反应5 h后，TLC检测反应原料几乎完全消失，浓缩后，经硅胶柱层析（洗脱剂为EtOAc/石油醚=15：1 ~ 10：1），得到化合物7（9 mg），产率83.3%，化合物HPLC检测纯度为98.6%，ESI-MS m/z: 397.2 [M＋Na]^＋。

实施例4

称取20 mg化合物6溶于5 mL THF中，加入5 mg NaH，室温下搅拌半小时后，加入20μL MeI，60^oC下反应12 h后，TLC检测反应原料几乎完全消失，加入饱和氯化铵终止反应后，用乙酸乙酯萃取两次，无水硫酸钠干燥有机层，浓缩后，经硅胶柱层析（洗脱剂为EtOAc/石油醚=20：1 ~ 10：1），得到化合物8（9.5 mg），产率43.9%，ESI-MS m/z: 397.2 [M＋Na]^＋，化合物9（8.6 mg）产率41.3%，ESI-MS m/z: 383.2 [M＋Na]^＋，HPLC检测纯度均在98%以上。

实施例5

称取10 mg化合物10溶于5 mL DMF中，加入5 mg Na₂CO₃，室温下搅拌半小时后，加入10μL BnBr，40^oC下反应5 h后，TLC检测反应原料几乎完全消失，浓缩后，经硅胶柱层析（洗脱剂为EtOAc/石油醚=15：1 ~ 10：1），得到化合物11（11.2 mg），产率88.9%，化合物HPLC检测纯度为98.8%，ESI-MS m/z: 459.2 [M＋Na]^＋。

实施例6

称取10 mg化合物10溶于5 mL CH₂Cl₂中，加入10μL 吡啶，10μL醋酐，室温下反应2 h后，TLC检测反应原料几乎完全消失，浓缩后，经硅胶柱层析（洗脱剂为EtOAc/石油醚=15：1 ~ 10：1），得到化合物12（10.5 mg），产率93.7%，化合物HPLC检测纯度为98.0%，ESI-MS m/z: 411.2 [M＋Na]^＋。

实施例7

称取20 mg化合物10溶于5 mL THF中，加入20μL 吡啶、催化量的DMAP，30μL ClCH₂COCl，60^oC下反应8 h后，TLC检测反应原料几乎完全消失，用乙酸乙酯萃取两次，无水硫酸钠干燥有机层，浓缩后，经硅胶柱层析（洗脱剂为EtOAc/石油醚=20：1 ~ 10：1），得到化合物13（14.5 mg），产率50.3%，ESI-MS m/z: 521.1 [M＋Na]^＋，化合物14（11.5 mg）产率47.1%，ESI-MS m/z: 445.1 [M＋Na]^＋，HPLC检测纯度均在97%以上。

实施例8

称取10 mg化合物15-1溶于5 mL CH₂Cl₂中，加入10μL 吡啶，10μL MsCl，室温下反应2 h后，TLC检测反应原料几乎完全消失，浓缩后，经硅胶柱层析（洗脱剂为EtOAc/石油醚=15：1 ~ 10：1），得到化合物16（10.0 mg），产率81.6%，化合物HPLC检测纯度为95.3%，ESI-MS m/z: 447.1 [M＋Na]^＋。

实施例9

称取10 mg化合物10溶于5 mL THF中，加入30μL 吡啶，15μL乙酰氯，60^oC下反应2 h后，TLC检测反应原料几乎完全消失，浓缩后，经硅胶柱层析（洗脱剂为EtOAc/石油醚=15：1 ~ 12：1），得到化合物21（7.7 mg），产率62%，HPLC检测纯度为98.6%，ESI-MS m/z: 453.2 [M＋Na]⁺；以及少量化合物12，产率为31%。

实施例10

称取10 mg化合物6溶于5 mL THF中，加入10 mg Na₂CO₃，30^oC下搅拌半小时后，加入15μL EtBr，60^oC下反应4 h后，TLC检测反应原料几乎完全消失，浓缩后，经硅胶柱层析（洗脱剂为EtOAc/石油醚=20：1 ~ 15：1），得到化合物22（6.1 mg），产率52.3%， HPLC检测纯度为98.5%，ESI-MS m/z: 425.2 [M＋Na]⁺；以及化合物7，产率为42.5%。

实施例11

称取5 mg化合物22溶于2mL CH₃OH/CH₂Cl₂(体积比1：1)中，加入催化量的10%Pd/C，在1 atm H₂作用下，室温反应过夜后，TLC检测反应完全，过滤除去Pd/C，浓缩后，得到化合物23（5.0 mg），产率99%，HPLC检测纯度在97.8%，ESI-MS m/z: 429.3 [M＋Na]⁺。

按照类似的方法，化合物12于适量CH₃OH/CH₂Cl₂(体积比1：1)中，在催化量的10%Pd/C，在1 atm H₂作用下以98.5%的收率得到化合物24，HPLC检测纯度在98.3%，ESI-MS m/z: 415.2 [M＋Na]⁺。

实施例12

称取10 mg化合物19溶于5 mL CH₂Cl₂中，加入20μL 吡啶，10 mg TsCl，室温下反应2 h后，TLC检测反应原料几乎完全消失，浓缩后，经硅胶柱层析（洗脱剂为EtOAc/石油醚=15：1 ~ 10：1），得到化合物25（12.3 mg），产率85%，HPLC检测纯度为96.5%，ESI-MS m/z: 523.2 [M＋Na]⁺。

实施例13

称取10 mg化合物17溶于5 mL 二氯甲烷中，加入50μL 吡啶，25μL丙酰氯，于室温下反应2.5 h后，TLC检测反应原料几乎完全消失，浓缩后，经硅胶柱层析（洗脱剂为EtOAc/石油醚=15：1 ~ 10：1），得到化合物26（9.7 mg），产率83.6%，HPLC检测纯度为98.8%，ESI-MS m/z: 427.2 [M＋Na]⁺。

实施例14

称取10 mg化合物18溶于5 mL 二氯甲烷中，加入50μL 吡啶，25μL环丙甲酰氯，于室温下反应5 h后，TLC检测反应原料几乎完全消失，浓缩后，经硅胶柱层析（洗脱剂为EtOAc/石油醚=15：1 ~ 10：1），得到化合物27（9.5 mg），产率79.4%，HPLC检测纯度为97.8%，ESI-MS m/z: 437.2 [M＋Na]⁺。

 实施例1-14中所用原料化合物1、3、6、10、15、15-1、17、18、19是按照中国专利201310429588.8、201310429589.2（或陈敏博士的《中国海洋大学博士学位论文》2013年度）中记载的方法制备得到的。

实施例15

本发明实施例化合物的抗藤壶幼虫附着活性（表1）。

本发明实施例化合物对藤壶Balanus amphitrite幼虫附着抑制活性试验按照如下文献方法测试：Thiyagarajan V.; Harder T.; Qiu J. W.; Qian P. Y. Mar Biol (Berl) 2003, 143, 543–554。通过抑制藤壶 B. amphitrite 幼虫附着活性测试，发现本发明实施例化合物的半数有效浓度（EC₅₀）均小于12.5 μg/mL，其半数致死浓度（LC₅₀）均大于50 μg/mL。这表明本发明化合物在抑制藤壶 B. amphitrite 幼虫附着方面，均表现出高效低毒的特点。

表1 本发明实施例化合物对藤壶幼虫 B. amphitrite 附着抑制活性及毒性

    表1中“A”表示化合物浓度为6.25μg/mL时对藤壶幼虫 B. amphitrite 附着抑制率在50%以上，“B”表示化合物浓度为12.5μg/mL时，对藤壶幼虫 B. amphitrite 附着抑制率在50%以上，“C”表示化合物浓度为25.0μg/mL时，对藤壶幼虫 B. amphitrite 附着抑制率在50%以上，“D”表示化合物浓度为50μg/mL时，对藤壶幼虫 B. amphitrite 的致死率在50%以下，“E”表示化合物浓度为100μg/mL时，对藤壶幼虫 B. amphitrite 的致死率在50%以下，其中化合物21-27的半数有效浓度（EC₅₀）均为B，半数致死浓度（LC₅₀）均为D。

除本发明实施例化合物2、4-5、7-9、11-14、16、21-27外的其他式I结构范围内的化合物亦可由中国专利201310429588.8、201310429589.2中记载的原料按照方案一、二或实施例1-14记载的类似方法进行合成，在抑制藤壶 B. amphitrite 幼虫附着活性测试中，本发明式I化合物的半数有效浓度（EC₅₀）均小于12.5 μg/mL，其半数致死浓度（LC₅₀）均大于50 μg/mL，限于篇幅，在此不一一累述。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考文献，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。