一种监控总RNA中线状RNA消除的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种监控总RNA中线状RNA消除 的方法。

背景技术

生物体内大部分的RNA为线性，但有少部分RNA首尾连接形成环状，被 称为环状RNA。近年来，环状RNA迅速成为RNA世界研究的热点，这是因为 高通量测序技术可以被用于检测环状RNA，这极大地加快了对环状RNA的发 现及对环状RNA功能的分析。

研究环状RNA的前提是将环状RNA从生物体内分离出来，目前还没有直 接从生物体内获取环状RNA的方法，只能从总RNA中去除线性RNA，间接达 到富集环状RNA的目的。通常，环状RNA占总RNA的比例不到1％，在高通 量测序检测环状RNA前，需要监控总RNA中线性RNA的去除程度。目前，一 个环状RNA样本高通量测序检测成本在10万元以上。若有较多的线性RNA存 在，则线性RNA会在高通量测序过程占用大量的测序资源，产生无效数据，造 成人力、物力与财力的大量浪费。然而，目前还没有监控总RNA中线性RNA 的消除的方法，导致浪费难以避免。

发明内容

为了解决现有技术中无法有效监控总RNA中线性RNA的去除程度的问题， 本发明实施例提供了一种监控总RNA中线状RNA消除的方法。所述技术方案 如下：

本发明实施例提供了一种监控总RNA中线状RNA消除的方法，所述方法 包括：

人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA；

对所述外源环状ERCC-0013-RNA进行质量控制；

将所述外源线性ERCC-0004-RNA和所述外源环状ERCC-0013-RNA按等摩 尔比混合，得到混合外源RNA；

向待检样本的总RNA中加入所述混合外源RNA，所述总RNA与所述混合 外源RNA的质量比为2000:1，得到第一混合物；

去除所述第一混合物中的核糖体RNA，得到第二混合物；

去除所述第二混合物中的线性RNA，所述线性RNA包括所述总RNA中的 内源线性RNA和所述外源线性ERCC-0004-RNA，得到第三混合物；

分别检测所述第一混合物中的所述外源线性ERCC-0004-RNA和所述外源 环状ERCC-0013-RNA的含量、以及所述第三混合物中的所述外源线性 ERCC-0004-RNA和所述外源环状ERCC-0013-RNA的含量；

根据所述含量计算所述总RNA中所述线性RNA的去除比例。

具体地，所述人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状 ERCC-0013-RNA，包括：

选择外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因，所述外源ERCC-0004 基因如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述外源ERCC-0013基因如序列表中SEQ  ID NO:2所示；

将所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因分别克隆到原核表 达载体中，分别获得克隆的外源ERCC-0004基因和克隆的外源ERCC-0013基因；

将获得的所述克隆的外源ERCC-0004基因和所述克隆的外源ERCC-0013 基因分别在体外转录，分别合成所述外源线性ERCC-0004-RNA和外源线性 ERCC-0013-RNA；

去除所述外源线性ERCC-0013-RNA的5’端的三磷酸结构，并在所述外源 线性ERCC-0013-RNA的5’端合成羟基；

对5’端为羟基的所述外源线性ERCC-0013-RNA进行磷酸化修饰，合成5’ 端经磷酸化修饰的所述外源线性ERCC-0013-RNA；

将所述5’端经磷酸化修饰的外源线性ERCC-0013-RNA的5’端和3’端连接， 合成所述外源环状ERCC-0013-RNA；

利用RNA酶R切掉未环化成功的所述外源线性ERCC-0013-RNA，得到所 述外源环状ERCC-0013-RNA。

进一步地，所述待检样本的基因中不存在与所述外源ERCC-0004基因和所 述外源ERCC-0013基因相同或同源的基因。

具体地，所述对所述外源环状ERCC-0013-RNA进行质量控制，包括：

利用随机引物对合成的所述外源环状ERCC-0013-RNA进行逆转录，合成外 源ERCC-0013-cDNA，所述外源ERCC-0013-cDNA包括外源线性 ERCC-0013-cDNA和外源环状ERCC-0013-cDNA；

利用第一引物和第二引物分别对所述外源ERCC-0013-cDNA进行实时定量 PCR扩增，所述第一引物包括如序列表中SEQ ID NO:3所示的第一正向引物和 如序列表中SEQ ID NO:4所示的第一反向引物，所述第二引物包括如序列表中 SEQ ID NO:5所示的第二正向引物和如序列表中SEQ ID NO:6所示的第二反向 引物，所述第一引物用于扩增所述外源线性ERCC-0013-cDNA和所述外源环状 ERCC-0013-cDNA，所述第二引物用于扩增所述外源环状ERCC-0013-cDNA， 通过所述第一引物扩增获得C_T1值，通过所述第二引物扩增获得C_T2值；

通过C_T1值和C_T2值以及公式计算合成的所述外源环状 ERCC-0013-RNA的环化比例，并选用环化比例超过90％时的所述外源环状 ERCC-0013-RNA。

具体地，采用RNA酶R去除所述第二混合物中的线性RNA。

具体地，所述分别检测所述第一混合物中的所述外源线性ERCC-0004-RNA 和所述外源环状ERCC-0013-RNA的含量、以及所述第三混合物中的所述外源线 性ERCC-0004-RNA和所述外源环状ERCC-0013-RNA的含量，包括：

采用逆转录引物0004和逆转录引物0013分别对所述第一混合物和所述第 三混合物进行逆转录，得到含有cDNA的所述第一混合物和含有cDNA的所述 第三混合物，所述逆转录引物0004如序列表中SEQ ID NO:7所示，所述逆转录 引物0013如序列表中SEQ ID NO:8所示；

采用第三引物0004和第四引物0013分别对所述含有cDNA的第一混合物 进行定量PCR检测，分别获得C_T3值和C_T4值，采用所述第三引物0004和所 述第四引物0013分别对所述含有cDNA的第三混合物进行定量PCR检测，分 别获得C_T5值和C_T6值，所述第三引物0004包括如序列表中SEQ ID NO:9所示 的第三正向引物0004和如序列表中SEQ ID NO:10所示的第三反向引物0004， 所述第四引物0013包括如序列表中SEQ ID NO:11所示的第四正向引物0004和 如序列表中SEQ ID NO:12所示的第四反向引物0004。

进一步地，所述逆转录的方法包括：取所述第一混合物0.5μg与下列成分 混合：5μl浓度为1μM的所述逆转录引物0004、2μl浓度为10mM的dNTP、 5μl浓度为100mM的DL-二硫苏糖醇、20U的逆转录酶和10μl 5×逆转录反 应缓冲液，用水补足50μl后混匀，于42℃保温2小时，75℃保温15分钟；

取所述第三混合物0.5μg与下列成分混合：5μl浓度为1μM的所述逆转 录引物0013、2μl浓度为10mM的dNTP、5μl浓度为100mM的DL-二硫苏 糖醇、20U的逆转录酶和10μl 5×逆转录反应缓冲液，用水补足50μl后混匀， 于42℃保温2小时，75℃保温15分钟。

进一步地，根据公式计算所述总RNA中所述线性 RNA的去除比例。

进一步地，所述实时定量PCR扩增的扩增程序为：95℃20秒；95℃3 秒，60℃20秒，共40个循环。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一 种监控总RNA中线状RNA消除的方法，该方法利用人工合成外源线性 ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA与待检样本的总RNA混合，一 同去除混合物中的线性RNA。检测去除线性RNA前的溶液中的外源线性 ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA的含量，以及去除线性RNA后 的溶液中的外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA的含量，通 过外源线性ERCC-0004-RNA相对于外源环状ERCC-0013-RNA的含量推算出总 RNA中线性RNA的去除比例，从而避免采用线性RNA去除效果不好的样本进 行高通量测序所造成的巨大人力、物力与财力的浪费。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的监控总RNA中线状RNA消除的方法流程图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明 实施方式作进一步地详细描述。

本发明实施例中的试剂均为市售试剂。

实施例

本发明实施例提供了一种监控总RNA中线状RNA消除的方法，本发明实 施例提供的待检样本为莱茵衣藻，且该莱茵衣藻的品系为CC503(购自于衣藻 资源中心，网址为：http://chlamycollection.org/)，如图1所示，具体方法包括：

步骤100：人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状 ERCC-0013-RNA。已有的RNA研究都是采用一个稳定表达的内源RNA作为参 照。为了监控线状RNA消除是否干净，可以检测并计算出稳定表达的内源线性 RNA与内源环状RNA分别在去除线性RNA前后的比例，通过这个比例来监控 线状RNA去除是否干净。然而，目前还没有发现稳定表达的内源环状RNA， 因而无法直接利用内源环状RNA进行监控。在本发明实施例中，为了监控内源 线性RNA的去除程度，人工合成了外源环状RNA与外源线状RNA，按比例加 入总RNA后作为参照，以模拟体内稳定表达的内源环状RNA与内源线状RNA， 使得监控线性RNA去除具有了现实可行性。对于本发明实施例提供的人工合成 外源RNA，需要考虑几点：所设计的外源环状RNA与外源线性RNA在体内没 有相同序列或同源性较高的序列，因为加入总RNA后，是无法将外源RNA与 内源RNA区分开的，若二者存在重叠，将导致结果不准确；此外，外源基因长 度也不宜太长，否则影响环化效率。考虑到合成的RNA量较大，且需要经常使 用，本发明实施例将RNA对应的DNA序列转入质粒中，通过质粒增殖而增加 相应的DNA的量，从而灵活获得大量DNA序列，再通过体外转录，将质粒DNA 变为RNA。为此，在DNA前端设计了体外转录启动子序列。转录成的RNA需 要纯化，为了实现这一目的，又在DNA的未端设计了寡聚T，转录后形成寡聚 A尾巴，寡聚A可用于纯化RNA。合成的外源RNA是线状，需要环化后才能 成为环状RNA。由于合成时的RNA的5’端为三磷酸基团，而连接时，需要的 是单磷酸基团，为此，去掉了外源RNA的三磷酸基团后，再加上单磷酸基团这 一步，从而合成能够环化成环的前体RNA的状态。具体操作步骤如下：

1、选择外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因，该外源ERCC-0004 基因如序列表中SEQ ID NO:1所示，该外源ERCC-0013基因如序列表中SEQ ID  NO:2所示。

上述SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及其互补链由生工生物工程(上海)股份 有限公司合成。

通过NCBI的BLAST程序检索，没有发现生物中存在与外源ERCC-0004 基因和外源ERCC-0013基因的同源基因。选择的外源ERCC-0004基因和外源 ERCC-0013基因的长度不超过1000bp。分别在外源ERCC-0004基因和外源 ERCC-0013基因的5’端和3’端分别添加了ctcgag和aagctt序列，该ctcgag和aagctt 序列分别为限制性内切酶XhoI和HindIII的酶切位点，便于将外源ERCC-0004 基因和外源ERCC-0013基因克隆进入原核表达载体，外源ERCC-0004基因和外 源ERCC-0013基因的5’端的taatacgactcactata序列为T7转录酶的启动子序列， 其余序列为可转录的序列。在taatacgactcactata序列之后连接有ggg序列，ggg 序列能够增加T7转录酶的转录效率。

2、将外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因分别克隆到原核表达载 体中，获得克隆的外源ERCC-0004基因和ERCC-0013基因，包括：

所选用的克隆载体为pBluescript II SK(+)(该克隆载体从长沙赢润生物技 术有限公司购买，货号为VKS0288)，采用内切酶XhoI(购买自NEB公司，货 号为R0146)和内切酶HindIII(购买自NEB公司，货号为R0104)对pBluescript  II SK(+)载体进行双酶切。具体地，在20μl的反应体系中，包含有10μg  pBluescript II SK(+)载体、20U的内切酶HindIII、20U的内切酶XhoI和2× 的NEBuffer 2.1(由NEB公司提供)。将上述反应体系混合均匀，经短暂离心， 于37℃保温1小时后，经80℃20分钟将酶灭活，并获得线性pBluescript II SK (+)载体，该线性pBluescript II SK(+)载体的浓度为10/20＝0.5μg/μl。

将外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因用无菌水溶解后，分别配制 成浓度为0.5μg/μl的溶液，将外源ERCC-0004基因及其互补链按体积比1：1 混合均匀，于PCR仪中依次经历94℃10分钟；65℃10分钟和37℃10分钟， 形成外源ERCC-0004-双链DNA基因；将外源ERCC-0013基因及其互补链按相 同的方法进行处理，获得外源ERCC-0013-双链DNA基因。

在20μl的反应体系中包括线性的pBluescript II SK(+)载体10μl、外源 ERCC-0004-双链DNA基因1μl、T4 DNA连接酶(购买自NEB公司，货号为 M0202)400U和1×T4 DNA连接酶缓冲液(随T4 DNA连接酶一起购买自 NEB公司)，16℃温育过夜后，65℃10分钟，T4 DNA连接酶经热失活，获 得含有外源ERCC-0004基因的pBluescript II SK(+)质粒载体。按同样的方法， 获得含有外源ERCC-0013基因的pBluescript II SK(+)质粒载体。

利用热激法将含有外源ERCC-0004基因的pBluescript II SK(+)质粒载体 转化进入大肠杆菌，具体方法如下：取50μl感受态细胞(由北京全式金生物技 术有限公司生产，目录号为CD501)在冰浴中自然解冻，加入含有外源 ERCC-0004基因的pBluescript II SK(+)质粒载体，轻轻混匀，在冰浴上孵育 30分钟，42℃热激30秒，快速转移至冰浴中冰浴3分钟，该过程中不要摇动离 心管，然后加入300μl不含抗生素的无菌LB液体培养基(LB液体培养基成份： 牛肉膏0.5g，蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，蒸馏水100mL，pH7.2～7.5)，于37℃ 200转/分钟，复苏1小时，取复苏后的菌液200μl均匀涂布于含氨苄青霉素抗性 的LB固体培养基(LB固体培养基包括：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、 氯化钠10g/L和琼脂粉15g/L)上，待菌液完全吸收后倒置于37℃恒温培养箱 中，暗培养过夜。挑取LB固体培养基上长出来的单克隆至5ml含氨苄青霉素的 LB液体培养基中，经37℃200转/分钟，摇菌扩增繁殖6-8小时，制备成感受 态细胞。

利用天根生化科技(北京)有限公司生产的快速质粒小提试剂盒(货号为 DP105)从上述感受态细胞中，提取并纯化含有外源ERCC-0004基因的 pBluescript II SK(+)质粒载体的DNA，提取与纯化的方法按照随试剂盒提供 的说明书进行。利用分光光度计(美国Quawell公司生产，型号为Q5000)中的 双链DNA程序，检测纯化后的pBluescript II SK(+)质粒的质量浓度。利用外 源ERCC-0004基因的PCR引物从纯化后的pBluescript II SK(+)质粒上扩增外 源ERCC-0004基因。具体地，20μl的扩增体系包括：纯化后的pBluescript II SK (+)质粒50ng、10μl Q5高保真扩增混合物(购自于NEB公司，货号为M0492) 和10μM的外源ERCC-0004基因的PCR引物(该PCR引物为正向引物与反向 引物的混合物)。扩增程序如下：98℃30秒；(98℃8秒，56℃20秒，72℃20 秒)×30个循环。将PCR产物利用乙醇沉淀进行纯化，纯化产物溶解于10μl 无酶水中，获得外源线性ERCC-0004基因的PCR产物，利用Q5000(美国Quawell 公司生产，型号为Q5000)中的双裢DNA定量程序对PCR产物进行定量检测， 检测结果表明：本次扩增获得的外源线性ERCC-0004基因的PCR产物浓度为 610ng/μl。扩增产物送至武汉擎科生物技术有限公司测序，确认克隆的 ERCC-0004的正确性，从而获得含有正确克隆外源ERCC-0004基因的Bluescript  II SK(+)质粒与外源线性ERCC-0004基因的PCR产物。按同样的方法，获得 含有正确克隆外源ERCC-0013基因的Bluescript II SK(+)质粒与外源线性 ERCC-0013基因的PCR产物。

其中，外源ERCC-0004基因的PCR引物的正向引物如序列表中SEQ ID  NO:13所示，外源ERCC-0004基因的PCR引物的反向引物如序列表中SEQ ID  NO:14所示；外源ERCC-0013基因的PCR引物的正向引物如序列表中SEQ ID  NO:13所示，外源ERCC-0013基因的PCR引物的反向引物如序列表中SEQ ID  NO:15所示。其中，SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:15中的多聚T序列是为了在 转录时获得多聚A，用于模拟生物RNA的多聚A尾巴，该多聚A尾巴可用于 RNA的逆转录和纯化。

3、将克隆的外源ERCC-0004基因和ERCC-0013基因通过体外转录，合成 外源线性ERCC-0004-RNA和外源线性ERCC-0013-RNA，包括：

采用T7RNA快速高效合成试剂盒(购自于NEB公司，货号为E2050)转 录合成外源ERCC-0004-RNA。该试剂盒中的成份包括：无酶水、含有NTP的 缓冲液混合物和T7RNA聚合酶混合物。反应体系中包括：1μg上述外源线性 ERCC-0004基因的PCR产物、10μl含有NTP的缓冲液混合物和2μl T7 RNA 聚合酶混合物，加水补足20μl混合均匀，并短暂离心，经37℃保温2小时后， 加入30μl无酶水和2μl DNase I(购自于NEB公司，货号为M0303)，混合均 匀后，经37℃保温15分钟，去除DNA模板。再利用Dynabeads mRNA纯化试 剂盒(由ABI公司生产，货号为61006)进行纯化，并用50μl无酶水溶解纯化 产物，获得纯化的外源线性ERCC-0004-RNA。采用同样的方法，获得纯化的外 源线性ERCC-0013-RNA。

4、去除外源线性ERCC-0013-RNA的5’端的三磷酸结构，并在外源线性 ERCC-0013-RNA的5’端合成羟基。因体外合成的外源线性ERCC-0013-RNA的 5’端为三磷酸结构，使得外源线性ERCC-0013-RNA的5’端无法与3’端连接形成 环状，所以必须去除该5’端的三磷酸结构，再在5’端加上单磷酸结构，这样才 能使得外源线性ERCC-0013-RNA的首尾相连成环状，具体步骤包括：

采用小牛肠碱性磷酸酶(购自于NEB公司，货号为M0290)去除外源线性 ERCC-0013-RNA的5’端的三磷酸结构。反应体系包括：20μg纯化的外源线性 ERCC-0013-RNA和7U的小牛肠碱性磷酸酶，用水补足20μl后混合均匀，经 短暂离心，于37℃保温1小时，获得去除5’端的三磷酸结构的外源线性 ERCC-0013-RNA。利用Dynabeads mRNA纯化试剂盒(由ABI公司生产，货号 为61006)纯化去除5’端的三磷酸结构的外源线性ERCC-0013-RNA，得到5’端 为羟基的外源线性ERCC-0013-RNA。

5、对5’端为羟基的外源线性ERCC-0013-RNA进行磷酸化修饰，合成5’端 磷酸化修饰的外源线性ERCC-0013-RNA，包括：

利用T4 PNK激酶(由NEB公司，货号为M0201)修饰该5’端为羟基的外 源线性ERCC-0013-RNA。随酶一起提供的有10×T4 PNK激酶缓冲液。在50μ l的反应体系中，包含如下成份：1×T4 PNK激酶缓冲液、1mM ATP、10U T4 PNK 激酶、以及上述获得的5’端为羟基的外源线性ERCC-0013-RNA，用水补足50 μl并混合均匀，经短暂离心，于37℃保温30分钟。利用Dynabeads mRNA纯 化试剂盒(由ABI公司生产，货号为61006)进行纯化，操作方法按该试剂盒 的说明书进行，获得5’端磷酸化修饰的外源线性ERCC-0013-RNA。

6、将5’端磷酸化修饰的外源线性ERCC-0013-RNA的5’端和3’端连接，合 成外源环状ERCC-0013-RNA，包括：

利用T4 RNA连接酶I(NEB公司生产，货号为M0204)对该5’端磷酸化 修饰的外源线性ERCC-0013-RNA的5’端与3’端进行连接。随该T4 RNA连接 酶I一起提供的成份还包括：10×T4 RNA连接酶反应缓冲液、10mM ATP、10 U/μl的RNA酶抑制剂和PEG 8000。在20μl的反体系中包含如下成份：1×T4  RNA连接酶反应缓冲液、10U/μl的T4 RNA连接酶1μl、10U/μl的RNA酶抑 制剂0.5μl、浓度为10％的PEG8000、20-50μM的ATP和上述获得的5’端磷酸 化修饰的外源线性ERCC-0013-RNA，用水补足20μl并混合均匀，经短暂离心， 于PCR仪中于16℃过夜，经95℃2分钟终止反应，得到外源环状 ERCC-0013-RNA。

纯化外源环状ERCC-0013-RNA，具体地，向得到的含有外源环状 ERCC-0013-RNA的混合物中加入以下成份：5M的醋酸铵(Ambion公司生产， 货号为AM9071)10μl、浓度为100％的乙醇200μl和水80μl，混合均匀，经短 暂离心，置于-80℃冰箱(海尔公司生产，型号为DW-86L626)中放置30分钟； 取出后经14000rpm 4℃离心25分钟，用移液器的枪头小心吸去上层清液，向沉 淀中加入300μl浓度为70％的乙醇，用于清洗沉淀，再经14000rpm 4℃离心5 分钟后吸去上层清液，于室温下，空气中干燥10分钟，用于去除残留的乙醇， 再用10μl无酶水溶解沉淀，获得纯化的外源环状ERCC-0013-RNA。

7、利用RNA酶R切掉未环化成功的外源线性ERCC-0013-RNA。具体步骤 包括：

在获得的纯化的外源环状ERCC-0013-RNA中，还有部分未环化成功的外源 线性ERCC-0013-RNA，利用RNA酶R(由Epicentre公司生产，货号为 RNR07250)切掉未环化成功的外源线性ERCC-0013-RNA。随该RNA酶R一 起提供的还有10×RNA酶R反应缓冲液，向获得的纯化的外源环状 ERCC-0013-RNA中加入2μl 10×RNA酶R反应缓冲液、1μl 20U/μl的RNA 酶R和7μl水混合均匀，经短暂离心后于40℃保温1小时，获得去除了外源线 状ERCC-0013-RNA的外源环状ERCC-0013-RNA。

8、纯化去除了外源线状ERCC-0013-RNA的外源环状ERCC-0013-RNA， 包括：

向获得的去除了外源线状ERCC-0013-RNA的外源环状ERCC-0013-RNA中 加入以下成份：5M的醋酸铵(Ambion公司生产，货号为AM9071)10μl、浓 度为100％的乙醇200μl和水80μl并混合均匀，经短暂离心，置于-80℃冰箱 (海尔公司生产，型号为DW-86L626)中放置30分钟，取出后经14000rpm 4℃ 离心25分钟，用移液器的枪头小心吸去上层清液，向沉淀中加入300μl浓度 为70％的乙醇，用于清洗沉淀，再经14000rpm 4℃离心5分钟后吸去上层清液， 于室温下，空气中干燥10分钟，用于去除残留的乙醇，用50μl无酶水溶解沉 淀，获得纯化的外源环状ERCC-0013-RNA。

步骤200：对外源环状ERCC-0013-RNA进行质量控制。即使是采用了以上 去除线性ERCC-0013-RNA的步骤，外源环状ERCC-0013-RNA中仍然可能混有 外源线状ERCC-0013-RNA，因此需要对外源环状ERCC-0013-RNA进行质量控 制。具体步骤包括：

1、利用随机引物对合成的外源环状ERCC-0013-RNA进行逆转录，合成外 源ERCC-0013-cDNA，外源ERCC-0013-cDNA包括外源线性ERCC-0013-cDNA 和外源环状ERCC-0013-cDNA，具体步骤如下：

利用分光光度计(美国Quawell公司生产，型号为Q5000)中RNA定量程 序，测定并获得上述纯化的外源环状ERCC-0013-RNA的质量浓度，本实施例提 供的外源环状ERCC-0013-RNARNA的质量浓度为8.99ng/μl。

取获得纯化的外源环状ERCC-0013-RNA 0.1μg，与下列成分混合：5μl浓度 为1μM的6碱基随机逆转录引物(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)、 2μl浓度为10mM的dNTP、20U的逆转录酶(美国Invitrigen公司生产，货号 为18064-014)、5μl浓度为100mM的DL-二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol，DTT， 随逆转录酶一起由美国Invitrigen公司提供)和10μl 5×逆转录反应缓冲液(随 逆转录酶一起由美国Invitrigen公司提供)，用水补足50μl混匀后，经42℃保温 2小时，75℃保温15分钟，使酶失活，合成外源ERCC-0013-cDNA。

2、利用第一引物和第二引物分别对外源ERCC-0013-cDNA进行实时定量 PCR扩增，第一引物包括如序列表中SEQ ID NO:3所示的第一正向引物和如序 列表中SEQ ID NO:4所示的第一反向引物，第二引物包括如序列表中SEQ ID  NO:5所示的第二正向引物和如序列表中SEQ ID NO:6所示的第二反向引物，第 一引物用于扩增外源线性ERCC-0013-cDNA和外源环状ERCC-0013-cDNA，第 二引物用于扩增外源环状ERCC-0013-cDNA，通过第一引物扩增获得C_T1值， 通过第二引物扩增获得C_T2值。

其中，第一引物的扩增产物不跨越外源环状ERCC-0013-RNA的环化连接 点，使得该第一引物可扩增外源线性ERCC-0013-cDNA，又可扩增外源环状 ERCC-0013-cDNA；第二引物或其扩增产物跨越外源环状ERCC-0013-RNA的环 化连接点，使得该第二引物只能扩增外源环状ERCC-0013-cDNA。

其中，第一引物和第二引物分别在两个反应体系中平行进行，且反应体系 和反应条件均相同，仅引物不同。具体地，取2μl外源ERCC-0013-cDNA、3 μl浓度为1μM的第一引物、10μl定量PCR混合物(由Toyobo公司生产， 货号为QPS-201)和0.4μl 50倍的ROX荧光校正染料(由Toyobo公司随QPS-201 一起提供)混合均匀后，经短暂离心，在ABI StepOne实时定量PCR仪中按如 下扩增程序进行实时定量PCR扩增：95℃20秒；95℃3秒，60℃20秒，共 40个循环，在每一次循环的最后一步收集荧光信号，该荧光信号的强弱用于衡 量表达量的多少。

3、通过C_T1值和C_T2值以及公式计算合成的外源环状 ERCC-0013-RNA的环化比例，当环化比例超过90％时，外源环状 ERCC-0013-RNA可以使用。

通过第一引物扩增获得C_T1值，该C_T1值为21.55；采用第二引物按同样的 方法进行扩增，获得C_T2值，该C_T2值为21.45。将C_T1值和C_T2值代入公式计 算外源环状ERCC-0013-RNA的环化比例为：＝93.30％。若外源环状ERCC-0013-RNA的环化比例超过90％，该外源环状 ERCC-0013-RNA可以使用，否则，该外源环状ERCC-0013-RNA不能使用，需 重新制备外源环状ERCC-0013-RNA。其中，90％的环化比例作为外源环状 ERCC-0013-RNA合格的标准是一经验值，该比例可根据具体情况作出调整。

步骤300：将外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA按摩 尔比1:1混合，得到混合外源RNA。具体操作如下：

利用Qubit RNA分析试剂盒(由Invitrigen公司生产，货号为Q32852)测 定外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA的质量浓度，测定方 法按该试剂盒的说明书进行。在本实施例中，检测获得的外源线性ERCC-0004- RNA和外源环状ERCC-0013-RNA的质量浓度分别为13393pg/μl和5298pg/μl。 利用网站工具(网址为：http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html) 计算外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA的分子量分别为1 68246.6和262445.9，通过分子量分别计算外源线性ERCC-0004-RNA和外源环 状ERCC-0013-RNA的摩尔浓度分别为79603.39pM和20187.02pM，由此计算， 若要求外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA按等摩尔比混 合，那么，二者混合的体积比应该为1：3.94。具体地，取外源线性ERCC-000 4-RNA 10μl与外源环状ERCC-0013-RNA 39.4μl混合均匀后，经短暂离心， 获得混合外源RNA。计算得到该混合外源RNA的摩尔浓度为32214.62pM，质 量浓度为6936.66pg/μl。

步骤400：向莱茵衣藻的总RNA中加入该混合外源RNA，总RNA与混合 外源RNA的质量比为2000:1，得到第一混合物。该第一混合物中既有外源环状 ERCC-0013-RNA，又有外源线性ERCC-0004-RNA，模拟了内源环状RNA与内 源线状RNA。1/2000的混合比例既保证了有足够的外源线性ERCC-0004-RNA 和外源环状ERCC-0013-RNA可以检测，又不至于添加过多外源线性 ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA，以至于浪费后期高通量测序的 检测成本。具体步骤包括：

1、提取莱茵衣藻的总RNA：

取对数生长期的莱茵衣藻5ml，且所取的莱茵衣藻的数目少于4000万个， 若超过4000万个，则相应减少取样体积。4000rpm常温离心1分钟，倒去上层 的培养液后，利用Trizol试剂(由Invirtigen公司生产，货号为15596-018)提 取莱茵衣藻的总RNA并溶解于50μl无核酸酶的水中，总RNA的提取与纯化 的方法按照Trizol试剂的操作手册进行。

利用分光光度计(分光光度计由美国Quawell公司生产，型号为Q5000)中 RNA定量程序，测定并获得上述提取的莱茵衣藻的总RNA的质量浓度。在本 实施例中，获得的莱茵衣藻的总RNA的质量浓度为1.52μg/μl。由此计算，提 取的莱茵衣藻的总RNA的量为76μg。

2、向提取的莱茵衣藻总RNA中加入混合外源RNA，包括：

总RNA与混合外源RNA的质量比为2000:1，具体地，向76μg莱茵衣藻 的总RNA中加入38ng混合外源RNA，根据混合外源RNA的质量浓度(6936.66 pg/μl)计算，应加入的混合外源RNA的体积为5.48μl，加入后混合均匀，经 短暂离心，得到第一混合物。

步骤500：去除第一混合物中的核糖体RNA，得到第二混合物。总RNA中 绝大部分都是核糖体RNA(>95％)，该核糖体RNA不是环状的RNA，因此， 需要消除。具体操作如下：

利用植物核糖体RNA去除试剂盒(由Epicentre公司生产，货号为 MRZPL116-6)去除第一混合物中的核糖体RNA。

该试剂盒包括：RNA酶抑制剂(100U/μl)、核糖体RNA去除液、反应缓 冲液、糖原(10mg/ml)、醋酸钠(3M)、无核酸酶的水、磁珠和磁珠磁浮液。

磁珠预处理：取225μl磁珠，置于磁架上，并在室温下静置1分钟，用225 μl无核酸酶的水清洗一次，重复利用225μl无核酸酶的水再清洗一次，将磁珠 振荡悬浮于60μl磁珠磁浮液中，再加入1μl糖原，得到经过预处理的磁珠。

样品预处理：在40μl的反应体系中，加入以下成分：5μg第一混合物、 8-10μl核糖体RNA去除液和4μl反应缓冲液，用水补足40μl，混匀后经短暂 离心，68℃保温10分钟，取出后室温放置5分钟，得到经过预处理的样品混合 物。

去除核糖体RNA：向经过预处理的磁珠中加入经过预处理样品混合物，用 移液器的枪头吹打几次混匀，经短暂离心，于室温下保温5分钟，进行涡旋震 荡，50℃保温5分钟，置于磁架上，于室温下静置1分钟，丢弃吸附的磁珠， 获得去除核糖体RNA的混合物。

纯化样品：向去除核糖体RNA的混合物中加入以下成份：5M的醋酸铵 (Ambion公司生产，货号为AM9071)10μl、100％的乙醇200μl和水60μl 并混合均匀，经短暂离心，置于-80℃冰箱(海尔公司生产，型号为DW-86L626) 中放置30分钟，14000rpm 4℃离心25分钟，用移液器的枪头小心吸去上层清 液，再加入300μl浓度为70％的乙醇，用于清洗沉淀，再经14000rpm 4℃离心 5分钟后去除上层清液，于室温下，空气中干燥10分钟，用于去除残留的乙醇， 用10μl无酶水溶解沉淀，获得纯化的去除了核糖体RNA的第一混合物，即第 二混合物。

其中，总RNA中的线性RNA包括：外源线性ERCC-0004-RNA和内源的 线性RNA，环状RNA包括：外源环状ERCC-0013-RNA和内源的环状RNA。

步骤600：去除第二混合物中的线性RNA，线性RNA包括总RNA中的内 源线性RNA和外源线性ERCC-0004-RNA，得到第三混合物。在第二混合物中， 总RNA中的内源线性RNA和外源线性ERCC-0004-RNA为混合物状态，因此， 对第二混合物进行去除线性RNA的处理，同时对二者进行了完全相同的处理。 因此，外源线性ERCC-0004-RNA的去除程度与总RNA中的内源线性RNA的 去除程度是相同的，通过监控外源线性ERCC-0004-RNA的去除比例，可以达到 监控内源线性RNA的去除比例的目的。此时，外源线性ERCC-0004-RNA已经 等同于内源参照基因了。具体包括：

利用RNA酶R(Epicentre公司生产，货号为RNR07250)能够酶切消化线 性RNA的特性，去除第二混合物中的线性RNA。随RNA酶R一起提供的还有 10×RNA酶R反应缓冲液。向上述第二混合物中加入2μl 10×RNA酶R反应 缓冲液、1μl 20U/μl的RNA酶R和水7μl，混合均匀，经短暂离心后40℃保 温1小时，得到了去除线性RNA的第二混合物。

纯化去除线性RNA的第二混合物：向上述去除线性RNA的第二混合物中 加入以下成份：5M的醋酸铵(Ambion公司生产，货号为AM9071)10μl、浓 度为100％的乙醇200μl和水80μl，混合均匀，经短暂离心，置于-80℃冰箱(海 尔公司生产，型号为DW-86L626)中放置30分钟，14000rpm 4℃离心25分钟， 用移液器的枪头小心吸去上层清液，加入300μl浓度为70％的乙醇，用于清洗 沉淀，再经14000rpm 4℃离心5分钟后去除上层清液，于室温下，空气中干燥 10分钟，用于去除残留的乙醇，用10μl无酶水溶解沉淀，获得了纯化的去除 了线性RNA的第二混合物，即第三混合物。

步骤700：检测第一混合物中的外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状 ERCC-0013-RNA的含量、以及第三混合物中的外源线性ERCC-0004-RNA和外 源环状ERCC-0013-RNA的含量，计算总RNA中线性RNA的去除比例。第一 混合物是去除线性RNA前的溶液，第三混合物是去除线性RNA后的溶液，而 在这两种溶液中，环状RNA的量不受线状RNA去除处理的影响，能够保持含 量恒定不变，因此可以作为线状RNA去除程度的参照。通过实时定量PCR检 测它们的量，之后先计算第三混合和第一混合物中外源线性ERCC-0004-RNA和 外源环状ERCC-0013-RNA的含量的比值，这两个比值之间的商即为线状RNA 去除比例。为了避免检测到未环化的外源线性ERCC-0013-RNA，针对外源环状 ERCC-0013-RNA所设计的实时定量PCR引物跨越了环化连接点。具体操作如 下：

1、逆转录。具体地，逆转录引物：逆转录引物0004和逆转录引物0013， 采用逆转录引物0004和逆转录引物0013分别对第一混合物和第三混合物进行 逆转录，得到含有cDNA的第一混合物和含有cDNA的第三混合物，逆转录引 物0004如序列表中SEQ ID NO:7所示，逆转录引物0013如序列表中SEQ ID  NO:8所示，且逆转录引物0013要求只能逆转录外源环化ERCC-0013-RNA，因 此，该逆转录引物0013跨越了外源环化ERCC-0013-RNA的环化连接点，逆转 录引物0004和逆转录引物0013序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司 合成。

该逆转录过程包括两类，第一类是以第一混合物为模板，并将第一混合物 通过逆转录引物0004进行逆转录，获得的产物为含有cDNA的第一混合物；第 二类是以第三混合物为模板，将第三混合物通过逆转录引物0013进行逆转录， 并获得的产物为含有cDNA的第三混合物。在两类逆转录过程中，除以上模板 与引物不同外，其它成份均完全一样，且两类反应同时并平行进行。

第一类逆转录反应过程如下：取0.5μg第一混合物作为模板，并与下列成 分混合：5μl浓度为1μM的逆转录引物0004、2μl浓度为10mM的dNTP、 20U的逆转录酶(美国Invitrigen公司生产，货号为18064-014)，5μl浓度为 100mM的DL-二硫苏糖醇(随逆转录酶一起提供)和10μl 5×逆转录反应缓冲 液(随逆转录酶一起提供)，用水补足50μl混匀后，于42℃保温2小时，75℃ 保温15分钟，使酶失活，且按照相同的方法进行第二类的逆转录，即取第三混 合物0.5μg与下列成分混合：5μl浓度为1μM的所述逆转录引物0013、2μl 浓度为10mM的dNTP、5μl浓度为100mM的DL-二硫苏糖醇、20U的逆转录 酶和10μl 5×逆转录反应缓冲液，用水补足50μl后混匀，于42℃保温2小时， 75℃保温15分钟。

2、实时定量PCR，具体地，定量PCR引物：第三引物0004和第四引物0013， 第四引物0013要求只能扩增外源环化ERCC-0013-RNA，因此，该第四引物0013 跨越了外源环化ERCC-0013-RNA的环化连接点，第三引物0004包括如序列表 中SEQ ID NO:9所示的第三正向引物0004和如序列表中SEQ ID NO:10所示的 第三反向引物0004，第四引物0013包括如序列表中SEQ ID NO:11所示的第四 正向引物0004和如序列表中SEQ ID NO:12所示的第四反向引物0004，第三引 物0004和第四引物0013均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

具体地，该实时定量PCR包括四类：第一类为第三引物0004与含有cDNA 的第一混合物的组合，扩增后获得C_T3值；第二类为第四引物0013与含有cDNA 的第一混合物之间的组合，扩增后获得C_T4值；第三类为第三引物0004与含有 cDNA的第三混合物的组合，扩增后获得C_T5值；第四类为第四引物0013与含 有cDNA的第三混合物的组合，扩增后获得C_T6值。其中含有cDNA的第一混 合物和含有cDNA的第三混合物均为模板，在四类实时定量PCR过程中，除以 上模板与引物不同外，其它成份均完全一样，且这四类反应同时并平行进行。

进一步地，第一类实时定量PCR反应：取2μl含有cDNA的第一混合物作 为模板、3μl浓度为1μM的第三引物0004(正向引物和反向引物的混合物)、 10μl定量PCR混合物(由日本Toyobo公司生产，货号为QPS-201)和0.4μl 50 倍的ROX荧光校正染料(由日本Toyobo公司生产，并且随定量PCR混合物一 起提供)。将以上混合物混合均匀，短暂离心，在ABI StepOne实时定量PCR仪 中按如下程序进行实时定量PCR检测：95℃20秒；95℃3秒，60℃20秒， 共40个循环，在每一次循环的最后一步收集荧光信号，荧光信号的强弱用于衡 量cDNA量的多少。通过以上程序，获得C_T3为24.35。

按相同的方法进行其它三类实时定量PCR反应，获得C_T5为21.20、C_T4为 24.26、C_T6为24.33。

步骤800：根据含量计算总RNA中线性RNA的去除比例：计算总RNA中 线性RNA的去除比例的公式为：

${1-2}^{[C_{T}5+C_{T}4-C_{T}6-C_{T}3]}\times 100\%={1-2}^{[21.20+24.26-24.33-24.35]}\times 100\%=89.27\%.$由此可见， 大部分外源线性RNA已经去除，由此推测，内源线性RNA也去除得较为干净， 可用于后续高通量测序分析。

进一步地，为了验证本发明提供的监控总RNA中线状RNA消除的方法是 否准确，本发明实施例将第二混合物和第三混合物按照Proton高通量测序的技 术方案建库并测序，第一混合物中含有大量的核糖体RNA，这会浪费测序数据 量，而第二混合物与第一混合物之间仅有一步去除核糖体RNA的步骤，这不会 导致外源线性RNA比例的变化，测序的总的数据量均为10M，外源线性 ERCC-0004-RNA在第二混合物与第三混合物中的Reads数分别为506和5578， 而外源环状ERCC-0013-RNA在第二混合物与第三混合物中的Reads数分别为 5946和5672，由此计算外源线性RNA的去除比例为1-(506/5946)/(5678/5672) ＝91.37％。通过该方法测得的值与本发明实施例提供的通过监控总RNA中线状 RNA消除的方法测得的89.27％的线性RNA去除比例大致相等。由此可见，本 发明获得的线性RNA的去除比例是正确的，可以在高通量测序前预测线性RNA 是否去除干净，避免了利用去除不干净的样品进行高通量测序而造成的大量人 力、物力与财力的浪费。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的 精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。