法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-06-29
授权
授权
2015-02-04
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20141013
实质审查的生效
2015-01-07
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种利用EST微卫星标记鉴别韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊幼虫的引物及方 法，属于农业生物技术领域。
背景技术
韭菜迟眼蕈蚊(Bradysia odoriphaga Yang et Zhang)属双翅目Diptera，长角亚目 Nematocera，眼蕈蚊科Sciaridae，迟眼蕈蚊属，幼虫俗称韭蛆，是韭菜的主要害虫。以幼虫 危害韭菜叶鞘、幼芽和鳞茎，引起鳞茎腐烂、叶片枯死，轻者造成倒伏枯黄，重者缺苗断垄， 严重影响韭菜产量和质量。
异迟眼蕈蚊(Bradysia difformis)幼虫俗称菌蛆，与迟眼蕈蚊同隶属于迟眼蕈蚊属。韭 蛆与菌蛆传统的区分方法是依据两者的形态特征(石宝才，路虹，宫亚军等，2010.韭菜迟 眼蕈蚊的识别与防治.中国蔬菜，11：21-22；张宏瑞，张晓云，沈登荣等，2008.食用菌异 迟眼蕈蚊的生物学特性.中国食用菌，27(6)：54-56)。
韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊在形态上相似，尤其是其幼虫，非专业人士不能区分，不利 于韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊的快速鉴定。精确区分韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊幼虫是进行 有效防控的前提和基础，这对于韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊的综合防控具有重要的理论意义 和指导价值。
本发明利用EST微卫星标记鉴别不同物种，因为EST来自转录区，其保守性较高，在家 族和种属间的通用性比来源于非表达序列的标记更高，另外还具有开发简单、快捷、费用低 等特点。EST微卫星标记已经广泛应用于植物、动物、微生物以及昆虫的物种检测与鉴定、 遗传分化鉴定等方面。
但利用EST微卫星标记构建区分韭菜迟眼蕈蚊幼虫与异迟眼蕈蚊幼虫的方法目前还未 见报道。主要技术障碍在于，目前尚未有韭菜迟眼蕈蚊幼虫与异迟眼蕈蚊幼虫的转录组文库， 因此无法进行EST微卫星标记的构建工作，且构建能够区分韭菜迟眼蕈蚊幼虫与异迟眼蕈蚊 幼虫的EST微卫星标记具有一定的偶然性。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用EST微卫星标记鉴别韭蛆与菌蛆的引物及 方法。
一种利用EST微卫星标记鉴别韭蛆与菌蛆的引物，所述引物为一对，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
一种鉴别韭蛆与菌蛆的方法，步骤如下：
(1)提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；
(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用上述的一对引物对基因组DNA进 行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
(3)对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结束后，EB染 色后在紫外凝胶成像仪上成像，当PCR扩增产物电泳图谱显示被测样品有121bp的一条条 带时，则该被检测样品为韭蛆；当PCR扩增产物电泳图谱显示被测样品无条带时，则为菌 蛆。
所述步骤(2)中PCR扩增的扩增体系为：
基因组DNA溶液2μl，20μM引物0.26μl，5U/μl Taq酶0.13μl，10×Taq Buffer(缓 冲液)1.3μl，10mM dNTP 0.26μl，ddH2O补至13μl；
所述步骤(2)中PCR扩增的扩增条件如下：
94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环； 72℃延伸7分钟。
上述步骤(1)中提取韭菜迟眼蕈蚊基因组DNA和步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳分析均 按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第三版 (北京：科学出版社，2002)。
有益效果
1、本发明所述鉴别韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊的引物能够扩增韭菜迟眼蕈蚊基因组 DNA中的核基因，为鉴定韭菜迟眼蕈蚊与其他蕈蚊提供了简便稳定的分子标记，解决了区 分韭菜迟眼蕈蚊的难题。
2、本发明从分子水平探索了韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊EST序列的不同，探索建立了 韭菜迟眼蕈蚊的鉴别技术，为今后韭菜迟眼蕈蚊的种群动态鉴定、生物学以及控制的研究奠 定了基础。
附图说明
图1是实施例2中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；
其中A、为韭菜迟眼蕈蚊；B、为异迟眼蕈蚊，M：DL2000DNA Marker。
图2是实施例3中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；
其中A、为韭菜迟眼蕈蚊；B、为异迟眼蕈蚊，M：DL2000DNA Marker。
具体实施方式
下面结合实例及附图对本发明的内容做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1中所述韭菜迟眼蕈蚊于2012年采集于山东省11地区；
实施例2中A、B所述韭菜迟眼蕈蚊和异迟眼蕈蚊于2012年分别采集于山东省淄博市 沂源地区和山东省潍坊市昌乐地区；
实施例3中A、B所述韭菜迟眼蕈蚊和异迟眼蕈蚊于2012年分别采集于山东省济宁市 地区和山东省临沂市费县地区；
上述样品均按照(石宝才，路虹，宫亚军等，2010.韭菜迟眼蕈蚊的识别与防治.中国蔬 菜，11:21-22.；张宏瑞，张晓云，沈登荣等，2008.食用菌异迟眼蕈蚊Bradysia difformis的生 物学特性.中国食用菌，27(6):54-56.)中记载的方法对上述韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊进 行了形态鉴定。
实施例所述仪器为尼康SMZ745T体视显微镜，为普通市售产品。
实施例1
构建了韭菜迟眼蕈蚊转录组文库并测序。
首先提取韭菜迟眼蕈蚊幼虫总RNA，将提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳、核酸浓度及质 量检测，判断总RNA浓度。将其中的包含poly(A)的mRNA通过有Oligo(dT)的磁珠进行 富集纯化，反转录出双链cDNA并纯化，利用Klenow添加poly(A)并连接测序接头，通 过琼脂糖凝胶电泳对目的大小cDNA片段的回收和纯化。利用PCR扩增产物中的cDNA片 段，并对PCR目的产物进行胶回收，纯化并检测合格后的cDNA片段，作为cDNA文库在 Illumina HiseqTM 2000上开展测序工作。通过Base calling软件对测序峰图进行读取，最终 转化为序列数据(raw reads)，经过对原始数据的分析筛选，得到韭菜迟眼蕈蚊的转录组文 库。
利用韭菜迟眼蕈蚊转录组文库中的13839条EST序列。经过序列的前处理和聚类分析 后，共得到1047个unigenes序列。利用软件DNAstar对韭菜迟眼蕈蚊EST序列进行预处理， 去除载体序列和长度小于150bp的序列,然后用软件 Cap3(http://genome.cs.mtu.edu/cap/cap3.html)对EST中长度大于150bp的序列按照默认的参 数进行拼接。利用MISA(MicroSatallite)软件进行SSR查找，查找标准：单核苷酸重复10次 以上，二核苷酸重复6次以上，三核苷酸重复5次以上，四核苷酸以上的重复3次。获得 20对引物。
经过对上述引物进行筛选，最终获得一对引物，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列。
引物序列如下：
正义引物EST-F：5’-TTAATTCGTTATCGCTGTG-3’；SEQ ID NO.1
反义引物EST-R：5’-ATGACTCGTCGCTAGACC-3’；SEQ ID NO.2
实施例2
一种鉴别韭蛆与菌蛆的方法，步骤如下：
(1)韭菜迟眼蕈蚊和异迟眼蕈蚊基因组DNA的提取
将单头山东省淄博市沂源地区韭蛆和山东省潍坊市昌乐地区菌蛆个体置于含60μl碱裂 解液的0.2ml的离心管中，碱裂解液为：50mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)、20mmol·L-1NaCl、 1mmol·L-1EDTA(乙二胺四乙酸)、1％SDS(十二烷基硫酸钠)，用封口枪头充分研磨匀浆后， 置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，制得韭菜迟眼蕈蚊基因组DNA溶 液和异迟眼蕈蚊基因组DNA溶液。
(2)韭菜迟眼蕈蚊基因的PCR扩增
分别以步骤(1)制得的韭菜迟眼蕈蚊基因组DNA溶液和异迟眼蕈蚊基因组DNA溶液 为模板进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
PCR扩增体系为：
韭菜迟眼蕈蚊基因组DNA溶液：2μl；20μM引物：0.26μl；5U/μl Taq酶：0.13μl；10 ×Taq Buffer：1.3μl；10mM dNTP：0.26μl；ddH20补至13μl；
引物序列如下：
正义引物EST-F：5’-TTAATTCGTTATCGCTGTG-3’；SEQ ID NO.1
反义引物EST-R：5’-ATGACTCGTCGCTAGACC-3’；SEQ ID NO.2
PCR扩增条件如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸 30秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。
(3)用质量百分比为2.0％的琼脂糖凝胶电泳对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行电 泳检测，EB染色后在紫外凝胶成像仪上成像。结果显示，韭菜迟眼蕈蚊在成像胶片上均有 有一条片段长度121bp左右的条带；异迟眼蕈蚊在成像胶片上均无长度121bp左右的条带， 结果如图1所示。
实施例3
一种鉴别韭蛆与菌蛆的方法，步骤如下：
(1)将单头个体样品分别置于含60μl碱裂解液的0.2ml的离心管中，碱裂解液为： 50mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)、20mmol·L-1NaCl、1mmol·L-1EDTA(乙二胺四乙酸)、1％SDS， (十二烷基硫酸钠)用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃ 水浴10min后，得基因组DNA溶液；
(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，对基因组DNA中的EST序列进行PCR 扩增，制得PCR扩增产物；
PCR扩增体系为：
基因组DNA溶液2μl，20μM引物0.26μl，5U/μlTaq酶0.13μl，10×Taq Buffer 1.3μl， 10mM dNTP 0.26μl，ddH20补至13μl；
引物序列如下：
正义引物EST-F：5’-TTAATTCGTTATCGCTGTG-3’；SEQ ID NO.1
反义引物EST-R：5’-ATGACTCGTCGCTAGACC-3’；SEQ ID NO.2
PCR扩增条件如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸 30秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟；
(3)用质量百分比为2.0％的琼脂糖凝胶电泳对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行电 泳检测，EB染色后在紫外凝胶成像仪上成像；当PCR扩增产物电泳图谱显示被测样品有 121bp的一条条带时，则该被检测样品为韭蛆；当PCR扩增产物电泳图谱显示被测样品无条 带时，则为菌蛆，结果如图2所示，该检测结果与按照(石宝才，路虹，宫亚军等，2010. 韭菜迟眼蕈蚊的识别与防治.中国蔬菜，11:21-22.；张宏瑞，张晓云，沈登荣等，2008.食用 菌异迟眼蕈蚊Bradysia difformis的生物学特性.中国食用菌，27(6):54-56.)中记载的方法 对上述韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊进行形态鉴定的结果一致。
机译： 微卫星标记物，用于鉴别朝鲜沙hopper Trinorchestia longiramus的生境及其使用方法
机译： 甲硅烷基三唑，一种防治包含其的蕈类疾病的方法，以及一种利用甲硅烷基三唑来控制蕈类疾病的方法
机译： 利用微卫星标记鉴别花生品种的方法
