人乳头瘤病毒L1L2衣壳蛋白相互作用位点及其应用

技术领域

本发明涉及分子病毒学领域。具体地，本发明涉及人乳头瘤病毒 主要衣壳蛋白L1与次要衣壳蛋白L2相互作用的结合位点。所述蛋白 结合位点可用于作为预防HPV感染及由HPV感染所导致的疾病例如 宫颈癌等的靶位点。本发明还涉及HPV突变型L1蛋白。本发明还涉 及一种药物组合物以及所述药物组合物用于制备治疗和/预防和/辅助 治疗HPV感染或者由HPV感染所导致的疾病例如宫颈癌等的用途。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)属于乳头瘤病毒科 (Papillomaviridae)乳头瘤病毒属，为无包膜DNA病毒。该病毒基因 组为双链闭环DNA，大小约为7.2－8kb，具有8个开放阅读框。HPV 病毒颗粒直径为45－55nm，核衣壳呈20面体对称，有72个壳微粒， 由L1及L2组成。目前已经发现的100多种型的HPV中，根据其与 肿瘤发生的关系可以分为两类：低危型—包括HPV6和HPV11，致癌 风险低，主要引起尖锐湿疣；高危型—包括HPV16、18、31、33、35、 39、45、52、58、59等，是导致包括女性宫颈癌在内的多种肿瘤疾病 的主要原因(Clifford GM，Smith JS，Plummer M，et a1.Br J Cancer， 2003，88(1)：63-73)。

HPV L1蛋白为主要衣壳蛋白，分子量为55－60kDa，是HPV疫苗 主要靶蛋白。在多种表达系统中表达的HPV L1蛋白可形成在形态结构 上与天然病毒颗粒相似的病毒样颗粒(Virus-Like Particle，VLP)。 该病毒样颗粒保留了病毒颗粒的天然表位，具有较强的免疫原性，可 诱导针对同型HPV病毒的中和抗体(Kirnbauer，R.，F.Booy，et al. 1992Proc Natl Acad Sci U S A89(24):12180-4)。因此，VLP疫 苗已成为HPV疫苗发展的主要方向。目前已上市的HPV疫苗为Merck 的及GSK的上述两种疫苗分别含有 HPV6/11/16/18及HPV16/18VLP。此外，现有的研究结果表明，可以 通过预防HPV感染来预防宫颈癌等疾病的发生。

研究表明，HPV L2约有473个氨基酸，分子量约为51KD，目前 L2蛋白结构尚未解析。研究发现L2的N端和C端都有一段富含正电 荷的氨基酸区域以及C端有一入核信号肽，在病毒DNA核定位中有 重要作用(Day PM.,Gambhira R.,Roden RB.,et al.Mechanisms of  human papillomavirus type16neutralization by l2cross-neutralizing  and l1type-specific antibodies.J Virol.2008May；82(9):4638-46. Epub2008Feb27.)。L2在病毒感染初期的免疫逃逸、入侵宿主细胞、 病毒DNA的核定位及病毒颗粒的高效组装等过程中均具有重要作用 (Fahey LM.,Raff AB.,Da Silva DM.A major role for the minor  capsid protein of human papillomavirus type16in immune escape J  Immunol.2009Nov15；183(10):6151-6.Epub2009Oct28)。随着研 究的深入，人们逐渐对HPV的入胞和致癌机制等均有一定的认识， 但天然HPV颗粒的组装机制及其成熟释放的过程及HPVL1与L2相 互作用尚未完全清楚。目前，HPV16L2与L1相互作用位点的研究仅 有报道L2通过其C端396-439位附近的氨基酸与L1疏水相互作用插 入到五聚体背面的空洞中，仅有一小段暴露在表面(Finnen RL, Erickson KD,Chen XS,et al，Interactions between papillomavirus L1  and L2capsid proteins.J Virol.2003Apr；77(8):4818-26)。然而这些 研究缺乏实验数据的支持，且描述的L1和L2的作用区域过于宽泛， 应用价值有限。

因此，研究HPV的衣壳组装和HPVL1与L2相互作用对HPV 预防性和治疗性疫苗设计及HPV与宫颈癌之间的致病研究具有重要 指导意义。

发明内容

本发明人经过深入地研究和创造性的劳动，得到了位于HPV L1 蛋白上的4个氨基酸位点。本发明人惊奇地发现，这4个氨基酸位点 是L1蛋白与L2蛋白相互作用的位点。通过筛选抑制这些作用位点的 药物，能够得到抑制HPV特别是HPV16以及治疗和/或预防和/辅助 治疗宫颈癌的药物。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种分离的多肽，其氨基酸序列为：SEQ ID NO：1中的第256、315、317、340位中的任意一个或者任意几个 位点(例如2、3或4个)发生突变、替换或缺失；具体地，所述4 个位点中的任意一个或者任意几个(例如2、3或4个)位点突变为丙 氨酸；更具体地，为SEQ IDNO：9、SEQ IDNO：19、SEQ IDNO： 20或SEQ IDNO：21所示的序列。具体地，所述分离的多肽为HPV 突变型L1蛋白。

本发明的另一方面涉及一种分离的多核苷酸，其编码本发明的分 离的多肽；具体地，所述多核苷酸的序列如SEQ IDNO：33、SEQ  IDNO：43、SEQ IDNO：44或SEQ IDNO：45所示。

本发明的再一方面涉及一种重组载体，其含有一个或多个相同或 不同的本发明的多核苷酸；具体地，所述重组载体为重组pAAV或重 组pTO-T7。

本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞，其含有本发明的重组 载体；具体地，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞。

本发明的再一方面涉及一种融合蛋白，其含有一个或多个相同或 不同的本发明的分离的多肽。

本发明的再一方面涉及一种假病毒，其含有本发明的重组载体； 具体地，所述假病毒为HPV假病毒；更具体地，所述假病毒为HPV16 假病毒。

本发明的再一方面涉及一种病毒样颗粒(VLPs)，其含有本发明 的多肽或者本发明的融合蛋白。

本发明的再一方面涉及一种组合物，其包含一个或多个相同或不 同的本发明的多肽或者本发明的融合蛋白；具体地，所述组合物，其 还包含HPV野生型L1蛋白和/或HPV野生型L2蛋白；具体地，所 述HPV野生型L1蛋白为HPV16野生型L1蛋白；具体地，所述HPV 野生型L2蛋白为HPV16野生型L2蛋白。

本发明的实施例证明，野生型HPV16L1的第256、315、317或340 位点突变后，L1和L2不能正常相互作用组成衣壳。本发明涉及的相互 作用位点可以用于筛选与HPVL1相结合的药物，进而可以抑制或阻断 HPVL1&L2在人体细胞中的颗粒组装，达到抑制感染HPV的病人体内 的HPV持续感染，从而可以控制或治疗HPV感染引起的疾病如宫颈 癌。本发明的多肽或者融合蛋白可以作为阴性对照。

本发明的再一方面涉及本发明的组合物在筛选抑制HPV的药物 或者治疗和/或预防和/辅助治疗HPV所致疾病例如宫颈癌的药物中的 用途；具体地，所述HPV为HPV16；具体地，所述宫颈癌为HPV16 所致宫颈癌。

本发明的再一方面涉及一种筛选抑制HPV的药物或者治疗和/或 预防和/辅助治疗HPV所致疾病例如宫颈癌的药物的方法，包括使用本 发明的组合物的步骤；具体地，所述HPV为HPV16；具体地，所述宫 颈癌为HPV16所致宫颈癌。

本发明的再一方面涉及本发明的多肽、多核苷酸、重组载体、重 组细胞、融合蛋白、假病毒或者病毒样颗粒在制备抑制HPV的药物 或者治疗和/或预防和/辅助治疗HPV所致疾病例如宫颈癌的药物(例 如宫颈癌疫苗)中的用途。

本发明的实施例证明，野生型HPV16L1的第256、315、317或 340位点突变后，这4个点突变蛋白的这12个抗原表位均未发生显著 变化，位点突变后仍能保持与原野生型相同的构象。

本发明中相关术语的说明及解释

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词 具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培 养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内 广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关 术语的定义和解释。

根据本发明，术语“HPV L1”是指人乳头瘤病毒(HPV)的L1蛋 白，其序列是本领域公知的(参见，例如NCBI数据库序列号： DQ469930.1)。在本发明中，当涉及HPV L1的序列时，如果没有特 别说明，参考Chen,X.S.，Garcea,R.L.，and Harrison,S.C.et al.2000. Mol Cell,5(3):557-567.其使用NCBI数据库序列号：DQ469930.1(SEQ  ID NO：1)进行描述。

本发明中“野生型HPV L1”一词指的是，利用原核表达系统表 达，纯化而制备的野生型HPVL1蛋白。

根据本发明，术语“HPV L1突变蛋白”是指，在L1蛋白中的某 一位或某几位氨基酸残基进行缺失或用其它氨基酸残基置换所获得的 蛋白质。

根据本发明，术语“HPVX Y Z”是指，用Z氨基酸残基的置换 HPV型L1蛋白质N末端的第Y位的X氨基酸残基所获得的蛋白质。 如“HPV–F256A”指用丙氨酸(A)残基置换HPVL1蛋白质N末端 的第256位的半胱氨酸(F)残基所获得的蛋白质。

根据本发明，术语“HPV L2”是指人乳头瘤病毒(HPV)的L2蛋 白，其序列是本领域公知的(参见，例如NCBI数据库序列号： CAC51368.1)。在本发明中，当涉及HPV L2的序列时，如果没有特 别说明，参考Ramon Pereira，Inga I.Hitzeroth，Edward P. Rybicki.2009.Arch Virol,154:187-197.其使用NCBI数据库序列号： CAC51368.1(SEQ ID NO：97)进行描述。

本发明中的术语“SAS”是指，利用Discovery Studio软件分析 蛋白质的溶剂可及化表面积(solvent accessibility surfaces，SAS)。SAS 表示氨基酸可以接触到溶剂的表面积占整个氨基酸表面积的比例，是 反映氨基酸暴露程度的一个指标，其值越大表明该氨基酸暴露在蛋白 质结构表面的程度越高。

本发明中“载体”一词指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插 入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转 导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以 表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体 如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的 人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。 用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、 腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳 头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控 制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择 元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能 包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但 不仅仅只有这些物质。

本发明中的“单抗”一词指的是由杂交瘤细胞分泌的单抗。单抗对抗 原上的单一表位具有高特异性。单抗与多抗不同，多抗是包含了识别抗 原上的不同表位的抗体分子。如，本发明涉及的单抗可采用Kohler等 首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)

本发明中“抗体滴度”一词指的是，利用间接法ELISA检测抗原 与抗体的结合水平，以反应呈阳性的最高的抗体稀释度表示，反应滴 度越高，则抗原与抗体的结合越强。若抗体与几个抗原的反应滴度相 当，则说明这几个抗原的该抗体表位的结构是相似的。

本发明中的假病毒指利用HPV VLP可非特异性包装核酸的特性, 通过在细胞内表达HPV的L1和L2蛋白，通过包裹细胞内的游离体 病毒DNA或外源导入的报告质粒，组成HPV假病毒(Yeager,M.D, Aste-Amezaga,M.et al(2000)Virology(278)570－7)。具体方法包括 重组病毒表达系统法及多质粒共转染方法。

本发明中的野生型假病毒指在细胞内表达野生型的L1和L2蛋 白，通过包裹细胞内的游离体病毒DNA或外源导入的报告质粒，组 成HPV假病毒。

本发明中的HPV突变假病毒是指在假病毒的L1或L2基因序列 中进行定点突变，而后使用与制备假病毒同样的方法进行制备。如

本发明中的TCID₅₀是指，半数组织培养感染剂量(Tissue culture  infective dose，TCID₅₀)，又称50％组织细胞感染量，反映感染性滴 度，即指能在半数细胞培养板或孔内引起细胞病变的病毒量。

感染滴度，反映病毒的感染能力，用TCID₅₀/ml来表示，即每毫 升病毒溶液稀释多少倍之后仍具有能在半数细胞培养板或孔内引起细 胞病变的病毒量。因此，数值越高，感染能力越强。

本发明提供了一种双抗体夹心酶联免疫吸附方法(Sandwich  ELISA)检测假病毒中衣壳蛋白L1含量的方法。

本发明还提供了一种蛋白免疫印迹方法(Westren-blot)检测假 病毒中衣壳蛋白L2方法。

本发明还提供了一种免疫共沉淀方法(Co-IP)检测假病毒中衣壳 蛋白L1和L2相互作用的方法。

“序列相同百分比”一词指的是候选序列中的核酸或氨基酸分别 与对应的核酸或多肽序列中核酸或氨基酸相同性的百分比。这里涉及 到的与核酸序列或者多肽序列有关的术语“序列相似百分比”定义为 候选核酸序列或氨基酸残基序列分别与目的核酸序列或氨基酸序列的 相似百分比。对于某一个序列，将它和目的序列进行比对，必要时可 跳过突变缺口，以达到最大的基因相似百分比，而不去考虑相似序列 的任意保守性突变。本领域的多种比对方法可用于确定核酸或氨基酸 序列的相似性，如可用的计算机软件包括BLAST,BLAST-2,ALIGN, ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)等。熟悉本领域技术的工作人员懂 得给比对设定合适的测量参数，包括为使用最大可比性的一些运算法 则达到而全长序列的比较。

发明的有益效果

与现有技术相比，本发明提供的主要衣壳蛋白L1与次要衣壳蛋 白L2相互作用的结合位点具有显著的有利方面。特别地，本发明的 结合位点能够阻断L1和L2蛋白形成HPV衣壳，从而使其在病毒的 预防与治疗方面具有特别显著的优势。

附图说明

图1：pAAV-HPV16L123个突变载体构建过程中的PCR扩增鉴 定结果。泳道样品顺序如下：泳道1：pAAV-H16L1-E106A质粒；泳 道2：pAAV-H16L1-F248A质粒；泳道3：pAAV-H16L1-Y249A质粒； 泳道4：pAAV-H16L1-L250A质粒；泳道5：pAAV-H16L1-R251A质 粒；泳道6：pAAV-H16L1-R252A质粒；泳道7：pAAV-H16L1-Q254A 质粒；泳道8：pAAV-H16L1-F256A质粒；泳道9：pAAV-H16L1-S298A 质粒；泳道10：pAAV-H16L1-M299A质粒；泳道11： pAAV-H16L1-T301A质粒；泳道12：pAAV-H16L1-D303A质粒；泳 道13：pAAV-H16L1-N308A质粒；泳道14：pAAV-H16L1-K309A质 粒；泳道15：pAAV-H16L1-P310A质粒；泳道16：pAAV-H16L1- W312A质粒；泳道17：pAAV-H16L1-Q314A质粒；泳道18： pAAV-H16L1-R315A质粒；泳道19：pAAV-H16L1-Q317A质粒；泳 道20：pAAV-H16L1-T340A质粒；泳道21：pAAV-H16L1-K467A 质粒；泳道22：pAAV-H16L1-L470A质粒；泳道23： pAAV-H16L1-Q471A质粒。结果显示，成功地构建了23个 pAAV-HPV16L1突变质粒。

图2：pAAV-16L1突变载体质粒酶切结果。泳道样品顺序如下： 泳道1：pAAV-H16L1-E106A质粒；泳道2：pAAV-H16L1-F248A质 粒；泳道3：pAAV-H16L1-Y249A质粒；泳道4：pAAV-H16L1-L250A 质粒；泳道5：pAAV-H16L1-R251A质粒；泳道6：pAAV-H16L1-R252A 质粒；泳道7：pAAV-H16L1-Q254A质粒；泳道8：pAAV-H16L1-F256A 质粒；泳道9：pAAV-H16L1-S298A质粒；泳道10： pAAV-H16L1-M299A质粒；泳道11：pAAV-H16L1-T301A质粒；泳 道12：pAAV-H16L1-D303A质粒；泳道13：pAAV-H16L1-N308A质 粒；泳道14：pAAV-H16L1-K309A质粒；泳道15：pAAV-H16L1-P310A 质粒；泳道16：pAAV-H16L1-W312A质粒；泳道17： pAAV-H16L1-Q314A质粒；泳道18：pAAV-H16L1-R315A质粒；泳 道19：pAAV-H16L1-Q317A质粒；泳道20：pAAV-H16L1-T340A 质粒；泳道21：pAAV-H16L1-K467A质粒；泳道22： pAAV-H16L1-L470A质粒；泳道23：pAAV-H16L1-Q471A质粒。结 果显示，成功地构建了23个pAAV-HPV16L1突变基因。

图3：蛋白质印迹对各突变假病毒的L1和L2蛋白量的检测结果。 泳道1：L1蛋白；泳道2：L2蛋白；泳道3：E106A突变假病毒；泳 道4：F248A突变假病毒；泳道5：Y249A突变假病毒；泳道6：L250A 突变假病毒；泳道7：R251A突变假病毒；泳道8：R252A突变假病 毒；泳道9：Q254A突变假病毒；泳道10：F256A突变假病毒；泳道 11：S298A突变假病毒；泳道12：M299A突变假病毒；泳道13：T301A 突变假病毒；泳道14：D303A突变假病毒；泳道15：N308A突变假 病毒；泳道16：K309A突变假病毒；泳道17：P310A突变假病毒； 泳道18：W312A突变假病毒；泳道19：Q314A突变假病毒；泳道20： R315A突变假病毒；泳道21：Q317A突变假病毒；泳道22：T340A 突变假病毒；泳道23：K467A突变假病毒；泳道24：L470A突变假 病毒；泳道25：Q471A突变假病毒；泳道26：HPV16野生型假病毒。 结果显示，除E106A、N308A和W312A突变后未表达L1蛋白外， 其余均正常表达。

图4：使用双抗体夹心ELISA法测定不同L1突变构建的突变假 病毒以及野生型HPV16假病毒中L1含量测定结果。wt，wildtype， 野生型HPV16假病毒，L1alone，野生型HPV16L1但无L2的假病 毒。结果显示，除了E106A、N308A和W312A突变后未表达L1蛋 白外，其余均正常表达。

图5：6个纯化后的HPV16L1突变蛋白以及野生型HPV16L1蛋 白SDS-PAGE结果。其中1为野生型HPV16L1，2为HPV16L1-F256A， 3为HPV16L1-R315A，4为HPV16L1-Q317A，5为HPV16L1- T340A，6为HPV16L1-R251A，7为HPV16L1-T301A，8为HPV16 L1–K476A。SDS-PAGE结果显示，4个HPV16L1突变蛋白纯化纯 度均达到了95％左右。

图6：使用透射电镜观察HPV16L1突变蛋白的结果。其中图6A 为野生型HPV16L1，图6B为HPV16L1-F256A，图6C为HPV16L1- R315A，图6D为HPV16L1-Q317A，图6E为HPV16L1-T340A， 图6F为HPV16L1–R251A，图6G为HPV16L1–T301A，图 6H为HPV16L1–K476A。结果显示，HPV16L1突变蛋白在电镜视 野下均能观察到均一的直径约为50nm的颗粒，表明这些位点突变后 不影响VLP的形成。

图7：通过间接法ELISA检测HPV16L1-F256A、 HPV16L1-R315A、HPV16L1-Q317A、HPV16L1-T340A以及野生型 HPV16L1蛋白与HPV16抗体的反应性。检测结果表明， HPV16L1-F256A、HPV16L1-R315A、HPV16L1-Q317A、 HPV16L1-T340A蛋白与HPV16抗体的反应滴度在105-107之间，与 野生型HPV16L1与HPV16抗体的反应性相当。

图8：最低稀释度的不同突变L1构建的突变假病毒感染293FT 细胞表达GFP在荧光显微镜下的观察结果。A：野生型HPV16假病 毒；B：单独L1形成的HPV16假病毒；C：单独L2形成的HPV16 假病毒；D：H16L1-E106A突变假病毒；E：H16L1-F248A突变假 病毒；F：H16L1-Y249A突变假病毒；G：H16L1-L250A突变假病 毒；H：H16L1-R251A突变假病毒；I：H16L1-R252A突变假病毒； J：H16L1-Q254A突变假病毒；K：H16L1-F256A突变假病毒；L： H16L1-S298A突变假病毒；M：H16L1-M299A突变假病毒；N： H16L1-T301A突变假病毒；O：H16L1-D303A突变假病毒；P： H16L1-N308A突变假病毒；Q：H16L1-K309A突变假病毒；R： H16L1-P310A突变假病毒；S：H16L1-W312A突变假病毒；T： H16L1-Q314A突变假病毒；U：H16L1-R315A突变假病毒；V： H16L1-Q317A突变假病毒；W：H16L1-T340A突变假病毒；X： H16L1-K417A突变假病毒；Y：H16L1-L470A突变假病毒；Z： H16L1-Q371A突变假病毒。结果显示，单独的L1蛋白形成的假病毒， 单独L2形成的假病毒以及H16L1-E106A突变假病毒，H16L1-N308A 突变假病毒和H16L1-W312A突变假病毒无法感染293FT细胞使报告 基因表达，而H16L1-F256A突变假病毒、H16L1-R315A突变假病毒、 H16L1-R317A突变假病毒和H16L1-T340A突变假病毒的感染滴度显 著降低。其余突变假病毒感染能力与野生型假病毒相当。

图9：不同L1突变构建的突变假病毒的感染滴度结果。wt， wildtype，野生型HPV16假病毒；L1alone，野生型HPV16L1但无 L2的假病毒；L2alone，野生型HPV16L2但无L1的假病毒。结果显 示，单独的L1蛋白形成的假病毒，单独L2形成的假病毒以及 H16L1-E106A突变假病毒，H16L1-N308A突变假病毒和 H16L1-W312A突变假病毒无法感染293FT细胞使报告基因表达，而 H16L1-F256A突变假病毒、H16L1-R315A突变假病毒、H16L1-R317A 突变假病毒和H16L1-T340A突变假病毒的感染滴度显著降低。其余 突变假病毒感染能力与野生型假病毒相当。

图10：10A－10C显示了不同突变L1构建的突变假病毒感染 293FT细胞后，由流式细胞仪检测其感染率的结果；图10D是突变假 病毒感染率统计结果。wt，wildtype，野生型HPV16假病毒；L1alone， 野生型HPV16L1但无L2的假病毒；L2alone，野生型HPV16L2但 无L1的假病毒。结果显示了单独的L1蛋白形成的假病毒，单独L2 形成的假病毒以及H16L1-E106A突变假病毒，H16L1-N308A突变假 病毒和H16L1-W312A突变假病毒无法感染293FT细胞使报告基因表 达，而H16L1-F256A突变假病毒、H16L1-R315A突变假病毒、 H16L1-R317A突变假病毒和H16L1-T340A突变假病毒的感染滴度显 著降低。其余突变假病毒感染能力与野生型假病毒相当。

图11：蛋白免疫印迹分析结果。Wt，wildtype，野生型HPV16 假病毒；L1alone，野生型HPV16L1但无L2的假病毒；L2alone，野 生型HPV16L2但无L1的假病毒；其余则为突变假病毒；L1与L2 分别指使用HPV16L1的单抗22E4以及HPVL2的单抗14H6对免疫 共沉淀的蛋白进行检测的结果。图11A显示14H6抗体捕获L2时， 单独L2检测不到，野生型假病毒中被免疫共沉淀下来的L1蛋白量比 4个H16L1-F256A、H16L1-R315A、H16L1-Q317A和H16L1-T340A 突变假病毒的L1多图；11B显示了野生型假病毒中被共沉淀的L2蛋 白量较H16L1-F256A、H16L1-R315A、H16L1-Q317A和H16L1-T340A 这4个突变假病毒多。

关于生物材料保藏的说明

本发明涉及以下生物材料：

杂交瘤细胞HPV14H6，其于2012年5月31日保藏于中国典型 培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C201268， 保藏地址为中国.武汉.武汉大学，430072。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领 域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限 定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造 商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通 过市购获得的常规产品。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检 测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2 版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子 生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的 方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域 技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明 所要求保护的范围。

实施例1：计算机分析预测HPV16L1与HPV16L2相互作用位点

本实验室用于蛋白质结构分析与模拟的Discovery Studio软件购 自美国Accelrys公司。利用Discovery Studio软件分析HPVL1五聚 体可能与L2相互作用的表面氨基酸，通过氨基酸的溶剂可及化表面 积(solvent accessibility surfaces，SAS)来评价。SAS表示氨基酸可以 接触到溶剂的表面积占整个氨基酸表面积的比例，是反映氨基酸暴露 程度的一个指标，其值越大表明该氨基酸暴露在蛋白质结构表面的程 度越高(Le Grand,S.M.,Eyrand,V.An algorithm for the  representation and conputatio of suermolecular surface and volumes.J. Comp.Chen.1989,10:868-871)。其中，筛选出23个位点，其SAS在 15％以上，如表1。

不拘于理论的限制，由于丙氨酸体积小、无其他官能团的甲基， 同时对蛋白质结构的影响较小，若换成侧链更小的甘氨酸，因其阿尔 法-碳没有手性，可能对蛋白结构有较大影响(Morrison,K.L.&Weiss, G.A.Combinatorial alanine-scanning[J].Curr Opin Chem Biol,2001,5: 302-307)。故采用丙氨酸扫描法将这23个位点逐一突变成丙氨酸，， 验证其是否是与L2相互作用的位点。这23个突变的L1大蛋白的氨 基酸序列分别如SEQ ID NO：2－24所示，其编码这些氨基酸序列的 DNA序列分别如SEQ ID NO：26－48所示。

表1：计算机预测HPV16L1&L2可能相互作用位点(23个)

实施例2：23个pAAV-16L1位点突变质粒的构建

基因克隆采用定点突变PCR反应来进行，使用本实验室构建的 pAAV-HPV16L1质粒(由NIH的John T.Schiller教授惠赠,其中 HPV16L1的DNA序列如本发明的SEQ NO：25)为模板(简写为 H16L1)，各个PCR反应的引物与产物见表2，使用表3中设计的引 物进行PCR扩增，在PCR仪(Biometra，T3)中进行PCR反应， 扩增条件设为：

94℃变性10分钟，25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火 一定时间，72℃延伸6分钟)，最后72℃延伸10分钟。

扩增产物加入2μL DpnI限制性内切酶，在37℃处理60min后转 化制备的感受态大肠杆菌DH5α。

提取质粒分别以PCR鉴定(参见图1)和酶切鉴定(参见图2)， DNA测序鉴定筛选出序列正确的克隆，将正确的菌株保存于-20℃用 以表达或大量制备质粒。

表2：构建突变HPVL1的各PCR反应的引物和产物命名

表3：用于构建突变HPV L1的引物序列

将上述的pAAV-HPV16L1-E106A～pAAV-HPV16L1-HPV16L1- Q471A共23个H16L1突变菌株于LB培养基中进行生长，待菌生长 至OD为1时，提取质粒，质粒用DU800进行浓度测定，放于-20℃ 备用。

实施例3：23个HPV16突变假病毒制备

使用磷酸钙转染法分别将实施例2获得的野生型pAAV-16L1质 粒或23个突变pAAV-16L1质粒、pAAV-HPV16L2质粒(由NIH的 John T.Schiller教授惠赠；本领域人员可以自行构建，也可以使用其 它的空白质粒进行酶切重组)以及含有报告基因的质粒 pcDNA3.1-EGFP(构建方法参见卢五迅等，生物工程学报，2006年， 22卷：990-995页)各40μg共转染培育于10cm细胞培养皿中的293FT 细胞(购自Invitrogen公司)制备假病毒或突变的假病毒。关于假病 毒制备，参照卢五迅等，生物工程学报，2006年，22卷：990-995页， 也可以参考下面的步骤：

将野生型或突变型pAAV-16L1质粒、pAAV-HPV16L2质粒以及 含有报告基因的质粒pcDNA3.1-EGFP各40μg加入1mL的HEPES 溶液(每50mL去离子水含有pH＝7.3的1M Hepes125μL，4℃储存) 和1mL的0.5mol/L CaCl₂溶液的混合溶液中，混匀，然后逐滴加入 2mL2×HeBS溶液(0.28M NaCl(16.36g)，0.05M HEPES(11.9g)， 1.5mM Na₂HPO₄(0.213g)，溶解于1000mL去离子水，pH＝6.96)中， 室温下静置1min；然后将混合液加入培养有293FT细胞的10cm细胞 培养皿中，培养6hr；然后换入10mL新鲜的完全培养液(购自 Invitrogen公司)。转染48hr后，弃去培养基，用PBS清洗细胞2 次；然后收集细胞，进行细胞计数，并且每10⁸个细胞用1mL裂解液 (0.25％Brij58，9.5mM MgCl₂)重悬。裂解后，以5000g离心10min， 收集上清，加入5M NaCl(终浓度为850mM)，从而制得假病毒液。

将相应的L1突变质粒获得的假病毒命名为该突变的假病毒，如： 将pAAV-HPV16L1-E106A、pAAV-HPV16L2质粒与pcDNA3.1-EGFP 质粒共转染制备的假病毒命名为H16L1-E106A假病毒，同时使用 pAAV-HPV16L1、pAAV-HPV16L2质粒与pcDNA3.1-EGFP制备野 生型假病毒；使用pAAV-HPV16L1与pcDNA3.1-EGFP制备L1alone 假病毒；使用pAAV-HPV16L2与pcDNA3.1-EGFP制备L2alone假 病毒作为对照。

实施例4：23个HPV16突变假病毒L1蛋白与L2蛋白的表达量检测

1.Western Blotting检测HPV16突变假病毒中L1蛋白与L2蛋白 的表达情况

取实施例3获得假病毒上清各即100μL加入20μL6X Loading  Buffer，混匀并于80℃水浴10min；然后取10μl于10％SDS-聚丙烯 酰胺凝胶中以120V电压电泳120min；

转膜：将上述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳胶上的蛋白电转移至硝酸 纤维素膜上。

封闭：将硝酸纤维素膜浸泡至5％脱脂奶中进行封闭60min。

加抗体:将16L1检测抗体为线性单克隆抗体21A5(参考Kohler 等在Nature256:495(1975)中报道的杂交瘤制备方法制备单抗)，16L2 检测抗体为线性单克隆抗14H6(14H6小鼠杂交瘤细胞株已在中国典 型培养物保藏中心(CCTCC,Wuhan University,Wuhan,China)进行保 藏，保藏号是C201268)用5％脱脂奶稀释成10μg/ml的溶液，分别 加入硝酸纤维素膜中浸泡，反应1小时。

洗涤：使用20mM Tirs-HCl，pH8.0，0.5M NaCl，0.05％Tween20 溶液洗5遍,每遍洗3min。

加酶：每张硝酸纤维素膜上加GAM-AP反应1小时。

洗涤：使用20mM Tirs-HCl，pH8.0，0.5M NaCl，0.05％Tween20 溶液洗5遍,每遍洗3min。

化学发光显色：选用ImageQuant LAS4000mini超灵敏化学发光 成像仪(购自美国GE公司)，分别将ELISA化学发光底物luminol  enhancer stable solution和stable peroxide solution按等体积混匀 后，用移液器均匀滴加在硝酸纤维素膜上后沥干，将膜置于托盘上， 调准焦距后，进行检测。线性单克隆抗体21A5与各个突变假病毒及 对照的假病毒进行Western Blotting反应性检测，实验结果如图3所 示，线性单克隆抗体14H6与各个突变假病毒及对照的假病毒进行 Western Blotting反应性检测，实验结果如图3所示。结果表明，23 个突变假病毒除了H16L1-E106A突变假病毒、H16L1-N308A突变假 病毒和H16L1-W312A突变假病毒中未检测到L1蛋白和L2蛋白的表 达外，其余20个突变假病毒中均含有L1和L2两种蛋白。

2.双抗夹心ELISA法检测23个HPV16突变假病毒表达情况

取实施例3获得假病毒上清对HPV16L1进行双抗夹心ELISA法 定量检测。选择包被的抗体为HPV16L1抗体22E4(参考Kohler等 在Nature256:495(1975)中报道的杂交瘤制备方法制备单抗)，200ng/ 孔。检测抗体为辣根过氧化物酶标记的HPV16L1的抗体21A5-HRP。 以BCA法检测精确定量的HPV16L1VLP(制备方法参考参见魏旻 希等，病毒学报，2009年，04卷：245-250页)作为标准样品。

酶标板的制备：

在8K-96孔板(8行×12列)上包被抗体22E4，抗体22E4包被 使用20mM磷酸盐缓冲液(PB，pH7.4)溶液，在37℃下包被过夜； 然后使用PBST(10mM PBS+0.05％Tween20)洗涤一次，扣干后再 加入封闭液(酪蛋白+蔗糖)，37℃封闭2hr，再扣干并真空抽干包装 成酶标板(8x12孔)。

双抗夹心实验其它成分的配制：

酶标试剂：以HRP标记21A5鼠抗，得到稀释度合适的酶标试剂

阴性对照：以HEV抗原为阴性对照。

显色剂A液：13.4g/L Na₂HPO₄.12H₂O+4.2g/L柠檬酸.H₂O+ 0.3g/L过氧化氢脲

显色剂B液：0.2mM/L四甲基联苯胺3,3’,5,5’ -Tetramethylbenzidine(TMB)+20mM/L二甲基甲酰胺

终止液：2M浓硫酸

浓缩洗涤液：20x PBST

检测过程：配液：将50ml浓缩液(20×)用蒸馏水或去离子水稀释 至1000ml备用

标准品稀释：将HPV16VLP样品稀释至1mg/ml，然后用1.5mlEP 管2倍倍稀，稀释24个梯度，每个梯度体积为500μl。

待HPV16突变假病毒及加样:

将上述23个HPV16突变假病毒，加入酶标板的每排首孔行第一 孔，然后将第一孔的浓度稀释2倍加入第二孔，如此向后倍比稀释依 次将前孔的样品稀释2倍至后一孔共稀释11个浓度梯度，每行最后一 孔只加不含抗体的样品稀释液。将稀释好的HPV16VLP标准品依次 加入孔中。

孵育：用封口膜封板后置生化培养箱37℃温育60min。

洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。

加入酶标抗体：将21A5-HRP稀释2000倍加入每孔反应。

孵育：用封口膜封板后置生化培养箱37℃60min。

洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。

显色：每孔加入显色剂A、B液各50μl，37℃显色10min。

测定：每孔加终止液1滴(50μl)，用酶标仪单波长450nm(需 设空白对照孔)或双波长450nm/630nm测定各孔OD值。

结果判定：

a)阴性对照的正常范围：正常情况下，阴性对照孔≤0.1(阴性对 照孔OD值若大于0.1应舍弃，如果所有阴性对照孔OD值都大于0.1， 应重复实验。若阴性对照孔小于0.03，则按0.03计算)。

b)临界值(CUTOFF)计算：阴性对照孔OD均值+0.15。

c)根据标准品HPV16VLP的OD值与浓度制作标准曲线

d)将在线性范围内的待检测突变假病毒的OD值使用标准曲线计 算假病毒中L1的含量。检测结果如图4所示。

检测结果显示，除H16L1-E106A突变假病毒、H16L1-N308A突 变假病毒和H16L1-W312A突变假病毒未检测到L1蛋白，其余各突 变假病毒均含有L1蛋白，但是表达量差异较大，其中，H16L1-R252A 突变假病毒，H16L1-D303A突变假病毒，H16L1-K309A突变假病毒， H16L1-R315A突变假病毒，H16L1-Q317A突变假病毒中L1的含量 小于0.5μg/ml，其余突变假病毒中L1含量与野生型假病毒相当。

实施例5：在原核表达系统中验证相互作用位点突变后对L1VLP的影响

1.HPV16L1突变基因的非融合表达载体的构建

将实施例2中F256A、R315A、Q317A、T340A四个相互作用位 点和R251A、T301A、K476A三个非相互作用位点共七个突变基因的 酶切片段与经NdeI/SalI酶切的非融合表达载体pTO-T7(罗文新等， 生物工程学报，2000，16:53-57)相连接，转入ER2566细菌；提取质 粒，经NdeI/SalI酶切鉴定得到插入目的片段的阳性表达克隆 pTO-T7-16L1-F256A、pTO-T7-16L1-R315A、pTO-T7-16L1-Q317A、 pTO-T7-16L1-T340A、pTO-T7-16L1-R251A、pTO-T7-16L1-T301A 和pTO-T7-16L1-K476A表达质粒。

各取1μL的pTO-T7-16L1-F256A、pTO-T7-16L1-R315A、 pTO-T7-16L1-Q317A、pTO-T7-16L1-T340A、pTO-T7-16L1-R251A、 pTO-T7-16L1-T301A和pTO-T7-16L1-K476A质粒(0.15mg/ml)转 化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌BL21(购自新英格兰生 物实验室公司)，将其涂布于含卡那霉素(终浓度25mg/mL，下同) 的固体LB培养基(LB培养基成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L 氯化钠，下同)，并37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑 取单菌落至含4mL液体LB培养基(含卡那霉素)的试管，在37℃220 转/分钟下振荡培养10小时，从中取1mL菌液于-70℃保存。

2.HPV16L1-F256A、HPV16L1-R315A、HPV16L1-Q317A、HPV 16L1-T340A、HPV16L1-R251A、HPV16L1-T301A和HPV16L1- K476A蛋白的大量表达

从-70℃中取出携带重组质粒pTO-T7-16L1-F256A、pTO- T7-16L1-R315A、pTO-T7-16L1-Q317A、pTO-T7-16L1-T340A、 pTO-T7-16L1-R251A、pTO-T7-16L1-T301A和pTO-T7-16L1-K476A 的大肠杆菌菌液，接种入50ml含卡那霉素的LB液体培养基中，在 200rpm，37℃下培养大约8小时；然后转接入15瓶500ml含卡那霉 素的LB培养基中(每瓶接入1ml菌液)，在200rpm，37℃下培养4 小时后将温度降低为30℃，加入IPTG诱导8小时，离心收集菌体。

按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液，pH7.2，300mM NaCl)的比例重悬菌体。采用APV均质机(An Invensys Group产品) 以600bar压力破碎菌体5次。以13500rpm(30000g)离心菌体破碎液 15min，留取上清(即，破菌上清)进行纯化。

3.HPV16L1-F256A、HPV16L1-R315A、HPV16L1-Q317A、HPV 16L1-T340A、HPV16L1-R251A、HPV16L1-T301A和HPV16L1- K476A蛋白色谱纯化

仪器系统：GE Healthcare公司(原Amershan Pharmacia公司) 生产的AKTA explorer100型制备型液相色谱系统。

层析介质：SP Sepharose4Fast Flow(GE Healthcare公司)。

柱体积：5.5cm×20cm。

缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液pH8.0，20mM DTT

        20m M磷酸盐缓冲液pH8.0，20mM DTT，2M NaCl。

流速：25mL/min

检测器波长：280nm。

样品为上述获得的HPV16L1-F256A、HPV16L1-R315A、 HPV16L1-Q317A和16L1-T340A蛋白超声上清溶液。

洗脱程序为：400mM NaCl洗脱杂蛋白，800mM NaCl洗脱目的 蛋白，收集800mM NaCl洗脱级分进行CHTⅡ(羟基磷灰石色谱) 纯化。

样品处理：前一步骤获得的800mM NaCl洗脱级分，将NaCl浓 度稀释至0.5M。

洗脱程序为：500mM NaCl洗脱杂蛋白，1000mM NaCl洗脱目的 蛋白，收集1000mM NaCl浓度时的洗脱级分。目的蛋白经SDS-PAGE 鉴定结果如图5所示，蛋白纯度在95％左右。

4.HPV16L1-F256A、HPV16L1-R315A、HPV16L1-Q317A、HPV 16L1-T340A、HPV16L1-R251A、HPV16L1-T301A和HPV16L1- K476A病毒样颗粒的组装及透射电镜观察

将HPV16L1-F256A、HPV16L1-R315A、HPV16L1-Q317A、HPV 16L1-T340A、HPV16L1-R251A、HPV16L1-T301A和HPV16L1- K476A蛋白透析于复性缓冲液(50mM PB(磷酸钠缓冲液)pH6.0， 2mM CaCl₂，2mM MgCl₂，0.5M NaCl，0.003％Tween-80)充分交换 样品缓冲液，交换体积为样品原始体积的10倍以上。透析6小时后交 换至储存缓冲液(20mM PB(磷酸钠缓冲液)pH6.5，0.5M NaCl) 中进行交换，交换体积为样品体积4倍以上。6小时后取出置于4℃保 存备用。

透射电镜观察使用的仪器为日本电子公司生产的100kV透射电 镜，放大倍数为100,000倍。将上述透析后的突变蛋白样品的病毒样 颗粒用2％磷钨酸pH7.0负染，固定于喷炭的铜网上，进行观察。电 镜结果见图6A－6H，其中可见大量半径为25nm左右的病毒样颗粒， 大小均匀，呈现为空心形态，从而证明，位点突变对于HPV16VLP 的组装没有影响。

实施例6：使用间接法ELISA检测HPV16L1-F256A、HPV16L1-R315A、HPV16L1-Q317A、HPV16L1-T340A蛋白与12株HPV16L1抗体的免疫反应性

以磷酸盐缓冲液(20mM磷酸缓冲液，pH7.4，300mM氯化钠) 稀释实施例5纯化的HPV16L1-F256A、HPV16L1-R315A、 HPV16L1-Q317A、HPV16L1-T340A蛋白至终浓度3ng/μl，然后在 96孔板上进行包被(包被体积100μl)，37℃温育2h。在37℃封闭 2h后，抽干，加入稀释至终浓度100ng/ml的8A9、PD1、1D12(HPV16L1 特异抗体)等12株单抗(参考Kohler等在Nature256:495(1975) 中报道的杂交瘤制备方法来制备HPV16L1单抗；也可以采用其它的 HPV16L1特异性单抗)，37℃反应30min；洗板，然后加入HRP标 记的抗鼠IgG二抗(KPL产品)，37℃反应30min；洗板，37℃显色 15min，然后在450nm处读取吸光值(参比波长为620nm)。结果如 图7所示。

结果显示HPV16L1-F256A、HPV16L1-R315A、HPV16L1-Q317A、 HPV16L1-T340A蛋白与12株HPV16抗体的反应滴度均在105-107 之间，与野生型HPV16L1与HPV16抗体的反应性相当。说明，这4 个点突变蛋白的这12个抗原表位均未发生显著变化，位点突变后仍能 保持与原野生型相同的构象。

实施例7：分析23个HPV16突变假病毒的感染滴度

1.稀释法检测突变假病毒的感染滴度

半数组织培养感染剂量(Tissue culture infective dose，TCID₅₀)， 又称50％组织细胞感染量，即指能在半数细胞培养板或孔内引起细胞 病变((cytopathic effect,CPE)的病毒量，其可作为病毒感染滴度的 单位。而感染滴度反映病毒的感染能力，用TCID₅₀/ml来表示，即每 毫升病毒液稀释多少倍之后仍具有能在半数细胞培养板或孔内引起细 胞病变的病毒量。因此，数值越高，感染能力越强。

将293FT细胞(Invitrogen)中提前4h预铺293FT(1.5×10⁴个/ 孔)到96孔细胞培养板中，取施例3获得的于4℃保存的突变假病毒， 以10％DMEM培养基10倍梯度稀释8个梯度，使每l00ul培养基中 分别含有10^-1～10^-8等8个浓度梯度的病毒稀释液。取各梯度病毒稀释 液100μl加入293FT细胞中，一个稀释梯度8孔重复，另设16孔细 胞为阴性对照(不加病毒)，将96孔板放入37℃恒温培养箱培养。培养 72小时后置荧光显微镜下观察，出现了1个以上绿色荧光细胞判为阳 性孔。计算各稀释度的阳性孔数和阴性孔数。如果阴性对照中没有出 现任何的发光细胞，最小稀释倍数(10^-1)8孔中100％阳性，最大稀释 倍数(10^-8)100％阴性，则本实验有效。按Karber法公式计算出分离病 毒株的感染滴度：log感染滴度＝L-d(S-0.5)，其中：L＝实验中使 用的最低稀释度的log值；d＝稀释梯度的log值；S＝终判时阳性 部分的总和。

在Nikon TE2000倒置荧光显微镜下采用蓝光激发观察最高浓度 样品感染孔的报告基因表达情况，观察结果如图8所示。结果显示， 单独的L1蛋白形成的假病毒以及单独L2形成的假病毒不能感染 293FT细胞表达报告基因。与之相同的是，H16L1-E106A突变假病毒、 H16L1-N308A突变假病毒和H16L1-W312A突变假病毒也无法感染 293FT细胞使报告基因表达，应是其中的L1蛋白没有正常表达造成 的。进一步计算野生型假病毒与其余20个突变型假病毒的感染滴度， 结果如图9所示。数据结果整理成表4：其中野生型HPV16假病毒的 感染滴度为1.3×10⁵TCID₅₀/μl，而H16L1-F256A突变假病毒、 H16L1-R315A突变假病毒、H16L1-R317A突变假病毒和 H16L1-T340A突变假病毒的感染滴度显著降低。由实施例3，实施例 4，实施例5和实施例6的结果可知其假病毒中的L1蛋白和L2蛋白 表达量均正常，而且L1蛋白能形成VLP且构象与野生型的一致，说 明这是这4个位点的突变导致了L1和L2不能正常相互作用组成衣壳 造成的，因此F²⁵⁶，R³¹⁵，R³¹⁷，T³⁴⁰是L1和L2蛋白的相互作用位点。

表4：各突变假病毒的感染滴度(稀释法)

2.流式细胞仪检测法检测23个HPV16突变假病毒的感染滴度

利用流式细胞仪计算实施例3获得的23个突变假病毒的感染滴 度。预铺293FT细胞(1.5×10⁵个/孔)至96孔板中，将每个突变假 病毒按照L1的浓度稀释至为4.0×10^-2μg/mlL1蛋白作为最高假病毒 浓度进行感染，此后，依次2倍倍稀假病毒至10个梯度。取各个梯度 的假病毒稀释液100μl加入293FT细胞孔中，一个稀释梯度2孔重复， 另设阴性对照孔。培养72小时后，吸去培养基，每孔加入200ul的 PBS润洗后吸干，加入5％的胰酶，约7分钟后反复吹吸，使细胞充 分悬浮并吹散为单细胞悬液，1500r/min离心5min，用含5％胎牛血 清的PBS重新悬浮。细胞悬浮液经200目的尼龙网过滤后使用流式 细胞仪(Beckman Coulter EPICS XL)检测，激发波长为488nm， 检测波长为525nm，用EXPO32软件对采集的数据进行分析。每个 细胞样品收集大约5×10³个细胞，以未处理的正常细胞作为阴性对 照，设定EGFP阳性细胞区(B区)，使阴性对照细胞样品在B区 中的细胞数不超过2％。基因转移效率为细胞样品在B区中的细胞 数量百分率减去阴性对照细胞样品在B区中的数量百分率；阳性细 胞平均荧光强度为细胞样品在B区中细胞荧光强度的平均值。

检测结果如图10A－10D所示，检测值数据使用GraphPad Prism 5软件进行分析，使用log(inhibitor)vs.response-variable slope模型 拟合计算每个样品达到TCID₅₀的稀释倍数，即该样品的感染滴度，数 据结果整理成表5。与稀释法检测相同，流式细胞仪计算的结果进一 步证实了H16L1-F256A、H16L1-R315A、H16L1-R317A和 H16L1-T340A为相互作用位点之一。

表5：各突变假病毒的感染滴度(流式细胞仪检测法)

实施例8：免疫共沉淀分析HPV16L1与HPV16L2相互作用

免疫共沉淀是体外分析蛋白质相互作用的有效方法，利用抗原抗 体特异性反应选择性的免疫沉淀目的蛋白和与其相互作用的蛋白。制 备H16L1-F256A、H16L1-R315A、H16L1-Q317A和H16L1-T340A 四个感染率显著降低的突变假病毒，利用免疫共沉淀方法分析其相互 作用。

免疫共沉淀实验流程：

(1)在原装小瓶内重悬Dynabeads protein G(购自美国GE公 司),漩涡震荡30s；

(2)吸取50ul(约1.5mg)Dynabeads protein G至一空EP管内；

(3)将此EP管置于磁石上让磁珠从溶液中分离，弃去上清液；

(4)用200ul含有Tween-20的PBS稀释抗体，抗体量一般为 1-10ug；

(5)将稀释好的抗体加入到准备好的Dynabeads中。室温下旋 转10min孵育；弃去上清液；

(6)用200ul含有Tween-20的PBS温和重悬清洗磁珠-抗体复 合物，弃去上清。

(7)加入含有抗原的样品(抗原量一般为100-1000ul)并温和地 反复吸取以使磁珠-抗体复合物重悬；

(8)室温下旋转孵育30min,使抗原与磁珠-抗体复合物结合；

(9)将EP管置于磁石上，将上清吸取至另一干净管内以备分析 所需；

(10)用200μl清洗液(HEPS7.0,0.5M NaCl)清洗磁珠-抗体- 抗原复合物，重复3次。

(11)用100μl清洗液重悬磁珠-抗体-抗原复合物，吸取磁珠悬液 至另一干净EP管内，磁珠与清洗液分离后，直接加入40μl蛋白质上 样Buffer，沸水浴10min，按实施例4中描述的进行SDS-PAGE、 western blotting和化学发光检测，检测结果如图11A和11B所示。

结果显示,HPV16L1的抗体22E4抗体捕获野生型与突变型假病 毒中的L1时，野生型假病毒中被共沉淀的L2蛋白量较H16L1-F256A、 H16L1-R315A、H16L1-Q317A和H16L1-T340A这4个突变假病毒多， 表明这4个位点突变后，导致L1和L2相互作用减弱，同等L1结合 的L2量减少；14H6抗体捕获L2时，单独L2无法可溶性表达，因此 检测不到，野生型假病毒中被免疫共沉淀下来的L1蛋白量比4个 H16L1-F256A、H16L1-R315A、H16L1-Q317A和H16L1-T340A突变 假病毒的L1多，这也表明这4个位点突变后，导致L1和L2相互作 用减弱，同等L2结合的L1量减少，从而进一步证实F²⁵⁶，R³¹⁵，R³¹⁷， T³⁴⁰为L1上与L2的相互作用关键位点。

实施例9：比对分析HPV16L1与HPV16L2相互作用位点的保守性

使用Mega4.0软件对现有HPV L1数据库中的1462条，包括134 种型别的HPV L1序列中的F²⁵⁶，R³¹⁵，R³¹⁷，T³⁴⁰4个位点进行同源 性比对分析，结果发现R³¹⁷，T³⁴⁰同源性高达99％以上，F²⁵⁶同源性 为92.5％，Arg315同源性为R³¹⁵，如表6。结果表明这4个位点在多 个型别中相对保守，应为HPV L1和L2相互作用位点。

表6：4个位点氨基酸的保守性分析

由表6中的数据可见，上述4个位点在目前已知类型的HPVL1 中是高度保守的，因此，尽管本发明的L1中的4个作用位点是由HPV 16L1中研究得到的，但也是其它类型的HPV L1与L2作用的位点。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人 员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修 改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。