通过抑制MyD88/Erk MAP激酶相互作用的癌症治疗

本发明涉及鉴定用于癌症治疗的新颖化合物的方法及抑制MyD88/Erk  MAP激酶相互作用以治疗癌症的化合物。

已经完善建立的是炎症起致癌作用的促进者作用。因此，MyD88(TLR 信号传导途径的一种接头蛋白)由于其在炎症中的作用而涉及致癌作用。

现在本发明令人惊奇地表明，MyD88在体外和体内在ras依赖性致癌作用 中发挥固有作用。具体地，MyD88通过保守基序结合ERK MAP激酶，因此 阻断其特异性磷酸酶MKP3对ERK的失活，并导致ras规范途径活性的放大。 证实在人类癌症中这种机制的关联性，在许多人类癌症中MyD88表现为过表 达并与磷酸-ERK相关。此外，实验数据表明MyD88直接参与ras信号传导途 径和由这一癌基因诱导的恶性转化。

MyD88/Erk MAP激酶相互作用抑制剂在肿瘤细胞中诱导凋亡。有趣的 是，在MyD88/Erk MAP激酶的抑制剂和诱导DNA损伤的化疗剂之间观察到 协同效应。因此，本发明对癌症提供了新的治疗前景，其中，第一线治疗是 基于诱导DNA损伤的化疗剂。诱导DNA损伤的化疗剂与抑制MyD88/Erk  MAP激酶相互作用的结合在敏感性肿瘤中实现剂量降低，因此增加患者的耐 受性或在具有高效DNA修复机制的耐受性癌细胞株中再诱导敏感性。

发明内容

1)本发明涉及一种用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗剂治疗 癌症的效果的化合物的方法，包括以下步骤：

a)提供至少一种候选化合物；

b)在适于允许ERK MAPK和MyD88在不存在候选分子的情况下相互作 用的条件下，将至少一种候选化合物与ERK MAPK蛋白和MyD88蛋白接触；

c)确定在存在和不存在至少一种候选化合物的情况下所测量的ERK  MAPK和MyD88的相互作用；和

d)选择抑制ERK MAPK和MyD88相互作用的候选化合物。

2)根据1的用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗剂治疗癌症的 效果的化合物的方法，其中ERK MAPK和MyD88中的一种或两种与可检测标 记物附接。

3)根据1-2中任一项的用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗剂 治疗癌症的效果的化合物的方法，其中使用双杂交系统、亲和层析、共免疫 沉淀、大分子复合物的亚细胞分级和分离、免疫印迹、免疫标记、邻近连接 测定法(proximity ligation assay)、免疫沉淀测定法、Biacore测定法或GST下 拉(pull-down)测定法确定ERK MAPK和MyD88的相互作用。

4)根据1-3中任一项的用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗剂 治疗癌症的效果的化合物的方法，其中所述诱导DNA损伤的化疗剂选自奥沙 利铂(oxaliplatin)、顺铂、卡铂、多柔比星、依托泊苷、博来霉素(bleomycin) 及其混合物。

5)根据1-4中任一项的用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗剂 治疗癌症的效果的化合物的方法，其中所述癌症选自：结肠直肠癌、肠癌、 黑素瘤、肺癌和宫颈癌。

6)用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗剂治疗癌症的效果的化 合物的方法，包括以下步骤：

a)提供至少一种候选化合物；

b)提供在诱导型启动子控制下稳定表达MyD88和在选自SRE启动子、 ELK启动子和MyC启动子的来自MAPK途径的启动子控制下表达报告基因 的转化细胞；

c)在至少一种候选化合物的存在下，在所述转化细胞中诱导MYD88的 过表达；

d)测量所述报告基因的表达并选择至少一种抑制所述报告基因表达的 候选化合物；

e)提供通过转染MyD88和Myc癌基因转化的永生化成纤维细胞；

f)监测在步骤d)中选择的至少一种候选化合物的存在下，和在至少一种 诱导DNA损伤的化疗剂的存在下的集落形成，并选择增强诱导DNA损伤的 化疗剂对集落形成的抑制效果的候选化合物。

7)根据6的用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗剂治疗癌症的 效果的方法，其中步骤b)中MAPK途径的启动子是SRE启动子。

8)根据6-7中任一项的用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗剂 治疗癌症的效果的化合物的方法，其中所述方法还包括以下步骤：

-提供在诱导型启动子控制下稳定表达MyD88和在选自Nf-kB启动子和 ISRE启动子的来自炎症途径的启动子控制下表达报告基因的转化细胞；

-在至少一种候选化合物的存在下，在所述转化细胞中诱导MYD88的过 表达；

-测量所述报告基因的表达并选择不抑制所述报告基因表达的候选化 合物。

9)根据8的用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗剂治疗癌症的 效果的化合物的方法，其中所述来自炎症途径的启动子是Nf-kB。

10)根据6-9中任一项的用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗剂 治疗癌症的效果的化合物的方法，其中步骤b)中，细胞选自HCT116细胞系、 A375细胞系和HeLa细胞系。

11)根据6-10中任一项的用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗剂 治疗癌症的效果的化合物的方法，其中所述诱导型启动子是抗生素诱导型启 动子。

12)根据6-11中任一项的用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗剂 治疗癌症的效果的化合物的方法，其中所述报告基因是萤光素酶。

13)根据6-12中任一项的用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗 剂治疗癌症的效果的化合物的方法，其中所述永生化成纤维细胞是NIH3T3 永生化成纤维细胞。

14)根据6-13中任一项的用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗 剂治疗癌症的效果的化合物的方法，其中所述癌症选自：结肠直肠癌、肠癌、 黑素瘤、肺癌和宫颈癌。

15)根据6-14中任一项的用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗 剂治疗癌症的效果的化合物的方法，其中所述诱导DNA损伤的化疗剂选自奥 沙利铂、顺铂、卡铂、多柔比星、依托泊苷及其混合物。

16)根据6-14中任一项的用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗 剂治疗癌症的效果的化合物的方法，其中步骤a)的至少一种候选化合物是根 据1-5中任一项的方法选择的。

本发明涉及一种用于选择用于治疗癌症的化合物的体外方法，包括以下 步骤：

a)提供候选化合物；

b)提供在诱导型启动子控制下稳定表达MyD88和在选自SRE启动子、 ELK启动子和MyC启动子的来自MAPK途径的启动子控制下表达报告基因 的转化细胞；

c)在候选化合物的存在下，在所述转化细胞中诱导MYD88的过表达；

d)测量所述报告基因的表达并选择抑制所述报告基因表达的候选化合 物；

e)提供通过转染MyD88和Myc癌基因转化的永生化成纤维细胞；

f)监测在步骤d)中选择的候选化合物的存在下的集落形成，并且如果集 落形成受到抑制，则选择所述化合物。

优选地，在本发明的方法步骤b中来自MAPK途径的启动子是SRE启动 子。

在优选的实施方案中，本发明的方法还包括以下步骤：

-提供在诱导型启动子控制下稳定表达MyD88和在选自Nf-kB启动子和 ISRE启动子的来自炎症途径的启动子控制下表达报告基因的转化细胞；

-在候选化合物的存在下，在所述转化细胞中诱导MYD88的过表达；

-测量所述报告基因的表达并选择不抑制所述报告基因表达的候选化 合物。

优选地，所述来自炎症途径的启动子是Nf-kB启动子。

在优选的实施方案中，本发明的方法中，所述细胞选自HCT116细胞系、 A375细胞系和HeLa细胞系。

优选地，所述诱导型启动子是抗生素诱导型启动子。

优选地，所述报告基因是萤光素酶。

在本发明的方法中，永生化成纤维细胞优选地是NIH3T3永生化成纤维 细胞。

本发明还涉及选择治疗癌症的化合物的体外方法，包括通过邻近连接测 定法、免疫沉淀测定法、Biacore测定法或GST下拉测定法或酵母双杂交系统 确定所述化合物是否抑制MyD88蛋白和ERK MAP激酶之间的相互作用。

本发明还涉及在通过诱导癌细胞凋亡治疗癌症中使用的抑制MyD88和 ERK MAP激酶相互作用的化合物，其选自抑制MyD88与ERK MAP激酶相互 作用的肽和抑制人MyD88表达的干扰RNA。

优选地，本发明化合物用于治疗选自结肠直肠癌、肠癌、黑素瘤、肺癌 和宫颈癌的癌症。

有利地，所述癌症是结肠直肠癌。

本发明还涉及用于治疗癌症的组合物，所述组合物包含诱导DNA损伤的 化疗剂和抑制MyD88与ERK MAP激酶相互作用的化合物，该化合物选自抑 制MyD88和ERK MAP激酶相互作用的肽的和抑制人MyD88表达的干扰 RNA。

本发明还涉及组合物，所述组合物包含用于与诱导DNA损伤的化疗剂联 用治疗癌症的抑制MyD88与ERK MAP激酶相互作用的化合物，其选自抑制 MyD88和ERK MAP激酶相互作用的肽和抑制人Myd88表达的干扰RNA。

在本发明的方法和组合物中，诱导DNA损伤的化疗剂优选地选自奥沙利 铂、顺铂、卡铂、多柔比星、依托泊苷及其混合物。

本发明还涉及用于治疗癌症的试剂盒，所述试剂盒具有包含诱导DNA 损伤的化疗剂和抑制MyD88与ERK MAP激酶相互作用的化合物的部分，所 述化合物选自抑制MyD88和ERK MAP激酶相互作用的肽和抑制人MyD88表 达的干扰RNA。

序列表

SEQ ID NO.1：抗-MyD88siRNA MyD2

SEQ ID NO.2：抗-MyF88siRNA MyD3

SEQ ID NO.3：抗-MyD88shRNAmir有义

SEQ ID NO.4：抗-MyD88shRNAmir反义

SEQ ID NO.5：抗-MyD88shRNAmir

发明详述

已经完善建立的是炎症起致癌作用的促进者作用。因此，MyD88(TLR 信号传导途径的一种接头蛋白)由于其在炎症中的作用而涉及致癌作用。现 在本发明令人惊奇地表明，MyD88在体外和体内的ras依赖性致癌作用中发挥 固有作用。通过在癌细胞中诱导凋亡，对MyD88的抑制使在体外和体内降低 致癌作用。观察到与诱导DNA损伤的化疗的协同效应。

本发明涉及用于选择和鉴定通过MAPK/ERK途径特异性抑制MyD88活 性的化合物的方法。这些化合物抑制DNA修复并因此增强经典地用于癌症治 疗的诱导DNA损伤的化疗剂的效果。

术语“MyD88”是指Gene Bank号U70451.1(21-03-1997)确定的髓样分化 初级反应多肽或基因。MyD88已被描述为在TLR信号传导途径中的接头蛋 白。在炎症途径中，MyD88激活转录因子Nf-kB。现在本发明令人惊奇地表 明MyD88参与MAPK/ERK途径的激活。

术语“ERK MAP激酶”是指Gene Bank号(Gene ID：5595，NG_029936.1) 确定的胞外调节激酶基因。该基因编码的蛋白是MAP激酶家族成员。MAP 激酶，也称为细胞外信号调节激酶(ERKs)，在调节各种细胞过程，例如响应 多种细胞外信号的增殖、分化和细胞周期进展的信号传导级联中发挥作用。 该激酶由上游激酶激活，从而导致其移位到细胞核，在那里它使细胞核靶点 磷酸化。

术语“增强诱导DNA损伤的化疗剂效果的化合物”是指能够增强或增加 诱导DNA损伤的化疗剂的效果的化合物。这些化合物可以与诱导DNA损伤 的化疗剂具有协同作用。将“协同作用”定义为两种药物一起使用的联合效 果大于两种药物单独使用的效果之和。这些化合物也可能使对诱导DNA损伤 的化疗剂有抗性的肿瘤细胞对这些诱导DNA损伤的化疗剂敏感。这些化合物 能够生成更有活性或更有效的诱导DNA损伤的化疗剂。

诱导DNA损伤的化疗剂与MyD88/Erk MAP激酶相互作用的抑制结合能 够在敏感性肿瘤中实现剂量降低，并因此增加患者的耐受性，或者在具有高 效DNA修复机制的抗性癌细胞株中再诱导敏感性。

术语“诱导DNA损伤的化疗剂”是指导致DNA加合物、DNA核苷酸的 不可逆修饰或DNA链断裂的化学药剂。虽然修复系统可以修复轻微的损伤， 但是若损伤不能被修复，则导致细胞死亡。这些药物包括在癌症，特别是在 Ras途径的一个或多个组分(例如EGFR、Ras、Raf、B-Raf、MEK、ErK及其 他)具有突变或激活的特定癌症，例如结肠直肠癌、肠癌、肺癌、乳腺癌、 造血性(hematopoietic)癌症、胃癌、前列腺癌等癌症治疗中使用的不同化合 物家族。诱导DNA损伤的化疗剂优选地选自奥沙利铂、顺铂、卡铂、多柔比 星、依托泊苷、博来霉素及其混合物。

本发明涉及一种用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗剂治疗癌 症的效果的化合物的方法，包括以下步骤：

a)提供至少一种候选化合物；

b)在适于允许ERK MAPK和MyD88在不存在候选分子情况下相互作用 的条件下，使至少一种候选化合物与ERK MAPK蛋白和MyD88蛋白接触；

c)如在存在和不存在至少一种候选化合物的情况下测量的，确定ERK MAPK和MyD88相互作用；和

d)选择抑制ERK MAPK和MyD88相互作用的候选化合物。

在本发明的方法中，ERK MAPK和MyD88中一种或两种优选地与可检测 标记物附接。

在本发明的方法中，优选地使用双杂交系统、亲和层析、共免疫沉淀、 大分子复合物的亚细胞分级和分离、免疫印迹、免疫标记，邻近连接测定法、 免疫沉淀测定法、Biacore测定法或GST下拉测定法确定ERK MAPK和MyD88 的相互作用。

在本发明的方法中，诱导DNA损伤的化疗剂选自：奥沙利铂、顺铂、卡 铂、多柔比星、依托泊苷、博来霉素及其混合物。

本发明的方法优选地用于选择用于治疗选自结肠直肠癌、肠癌、黑素瘤、 肺癌和宫颈癌的癌症的化合物。

本发明更具体地涉及筛选或选择候选化合物的方法，其中分析候选化合 物调节MyD88蛋白和ERK MAP激酶相互作用，例如防止MyD88与ERK MAP 激酶的结合，或还有部分地或全部地解离所形成的MyD88/ERK MA激酶复合 物的能力。优选地，本发明涉及一种筛选能够调节MyD88/ERK MAPK相互 作用的化合物，以及特别地用于治疗癌症的化合物的方法，其中确定了 MyD88/ERK MAPK相互作用的拮抗剂。可以测定候选化合物干扰或破坏 MyD88与ERK MAPK相互作用的能力。有利地，MyD88蛋白，ERK MAPK 蛋白和至少一种候选化合物接触，并在适于允许它们相互作用，并且特别地 解离ERK MAPK/MyD88复合物的条件下孵育。或者，MyD88蛋白和ERK  MAPK蛋白是在适于形成ERK MAPK/MyD88复合物的条件下接触。进一步 加入至少一种候选化合物并且在适于允许它们相互作用，并且任选地在允许 ERK MAPK/MyD88复合物解离的条件下使三种组分接触。

可以通过本领域技术人员众所周知的任何合适的方式，例如经典的分离 和/或检测方法实现确定候选化合物调节MyD88与ERK MAPK相互作用的能 力，或者结合并调节MyD88/ERK MAPK复合物的能力。例如，可以在增加 浓度的候选化合物存在下定量MyD88/ERK MAPK复合物。可以使用经典的 分析方法进行MyD88/ERK MAPK的结合，例如蛋白或肽结合的体外分析， 如其中可以采用将MYD88或ERK MAPK组分中的一种或两种与可检测标记 物(BRET、FRET、HTRF)附接，和/或固定化。一般情况下，经典用于检测 阳性蛋白-蛋白相互作用的方法，例如任选地与可检测的标记，如荧光、同 位素或显色标记相关的双杂交系统、亲和层析、共免疫沉淀、大分子复合物 的亚细胞分级和分离、免疫印迹、或免疫标记、邻近连接技术、免疫沉淀测 定法、Biacore测定法、GST下拉测定法或酵母双杂交系统，也可以用于鉴定 干扰或破坏所述相互作用的化合物。

本发明还涉及一种用于体外选择能够增强诱导DNA损伤的化疗剂治疗 癌症的效果的化合物的方法，包括以下步骤：

a)提供至少一种候选化合物；

b)提供在诱导型启动子控制下稳定表达MyD88和在选自SRE启动子、 ELK启动子和MyC启动子的来自MAPK途径的启动子控制下表达报告基因 的转化细胞；

c)在至少一种候选化合物的存在下，在所述转化细胞中诱导MYD88的 过表达；

d)测量所述报告基因的表达并选择抑制所述报告基因表达的至少一种 候选化合物；

e)提供通过转染MyD88和Myc癌基因转化的永生化成纤维细胞；

f)监测在步骤d)中选择的至少一种候选化合物的存在下和至少一种诱 导DNA损伤的化疗剂的存在下的集落形成，并选择增强诱导DNA损伤的化 疗剂对集落形成的抑制效果的候选化合物。

本发明的方法提供了选择抑制MyD88活化MAPK/ERK途径的化合物。

术语“MAPK途径”、“ERK途径”和“MAPK/ERK途径”在本文中无差 别地使用并且是指涉及调节各种基因转录的蛋白激酶级联的信号转导途径。 这一途径涉及各种癌症。

任何候选化合物可在本发明的方法中进行选择。在优选的实施方案中， 所述候选化合物是能够扩散到细胞中的小化合物，例如化学化合物或肽。

本发明的测定法是基于在诱导型启动子控制下表达MyD88和在选自 SRE启动子、ELK启动子和MyC启动子的来自MAPK途径的启动子控制下表 达报告基因的转化细胞。

任何合适的细胞可用于本发明的方法；优选地，所述细胞是真核细胞， 和最优选地为哺乳动物细胞。在本发明的方法中，永生化细胞系是优选的。 有利地，所述细胞选自：HCT116细胞系、A375细胞系和HeLa细胞系。根据 已知的技术转化细胞。

在诱导型启动子的控制下在转化细胞中表达MyD88。技术人员已知的任 何诱导型启动子和活化它们的任何因子可用于本发明的方法。在优选的实施 方案中，诱导型启动子是抗生素诱导型启动子，而因子/诱导剂是抗生素。在 一个优选的实施方案中，所述启动子是可用多西环素诱导的。

转化细胞在选自SRE启动子、ELK启动子和MyC启动子的来自MAPK途 径的启动子控制下进一步表达报告基因。任何报告基因，其表达易于被鉴定 和测量，可以在本发明的方法中使用。萤光素酶和GFP是通常使用的报告基 因的实例。在优选的实施方案中，所述报告基因是萤光素酶。测量其活性的 报告基因在SRE启动子、ELK启动子或MyC启动子的控制下表达。

术语“SRE启动子”是指“血清应答元件”，其是一种DNA序列(CC(A/ T)6GG)，该DNA序列在报告基因的上游使用，并且已知是由Gene Bank编号 (Gene ID:6722，NM_003131.2)确定的SRF基因编码的SRF(血清反应因子)蛋 白的结合位点。

术语“ELK启动子”是指Gene Bank编号(Gene ID:2002，NG_009222.1) 确定的E26(ETS)样转录因子基因的启动子。由该基因编码的蛋白是 ras-raf-MAPK信号传导级联的核靶点。

术语“MyC启动子”是指Gene Bank编号(Gene ID:4609，NG_007161.1) 确定的C髓细胞瘤病病毒癌基因同源基因的启动子。Myc依赖于各种促有丝 分裂信号，例如EGF(通过MAPK/ERK途径)激活。通过修饰Myc靶基因的表 达，Myc活化导致多种生物效应，像驱动细胞增殖、调节细胞生长、凋亡、 分化和干细胞自我更新。

优选地，在本发明的方法中，在步骤b)中的来自MAPK途径启动子是SRE 启动子。

MyD88的过表达在将因子/诱导剂添加到培养基中被诱导或在诱导剂的 恢复后被关闭。MyD88的过表达激活MAPK/ERK途径。在本发明的方法中， MyD88的过表达在候选化合物的存在下被诱导。候选化合物对MyD88活化 ERK/MAPK途径的抑制是通过测量选自SRE启动子、ELK启动子和MyC启动 子的来自MAPK/ERK途径的启动子控制下的报告基因的表达监测的。在本发 明的方法中选择在转化细胞中抑制报告基因表达的候选化合物。

由于已知MyD88是用于激活炎症途径，本发明的方法可以有利地包含去 除抑制炎症途径的化合物，或选择不显著抑制炎症途径的化合物的步骤。因 此本发明的方法还可包括以下步骤：

-提供在诱导型启动子控制下稳定表达MyD88和在选自Nf-kB启动子和 ISRE启动子的来自炎症途径的启动子控制下表达报告基因的转化细胞；

-在候选化合物的存在下，在所述转化细胞中诱导MYD88的过表达；

-测量所述报告基因的表达并选择不抑制所述报告基因表达的候选化 合物。

如上所述，进行这些附加的步骤。

术语“Nf-κB启动子”是指活化B细胞的核因子κ-轻链增强子的启动子， 它是由Gene Bank编号(p65RELA＝基因ID：5970，NG_029971.1/P50＝基 因ID：4790，NM_001165412.1)确定的基因编码的p65RELA/p50蛋白的二聚 体构成的。清楚地，NF-κB是促炎基因表达的最重要的调节剂之一。细胞因 子，如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的合成是由NF-κB介导的，环加氧酶2 (Cox-2)的表达也是。

术语“ISRE启动子”是指干扰素敏感性应答元件，一种用于报告基因上 游，并且已知是STAT(信号转导物和转录蛋白活化剂)家族蛋白，像STAT3 (NG_007370.1，NM_003150.3)和IRF(干扰素应答因子)家族蛋白，像 IRF3(NG_031810.1，NM_001197122.1)的结合位点的DNA序列(TTTCAT)。所 述STAT途径是一个将细胞因子信号转换成调节免疫细胞的增殖和分化的基 因表达程序的主要信号传导途径。STAT蛋白家族的几个成员在调节促炎性 和消炎反应中起转录因子作用。

优选地，来自炎症通路的启动子是Nf-kB启动子。

这些附加的步骤选择化合物，其不干扰MyD88在炎症途径中的作用。它 们可同时进行或在选择抑制MAPK/ERK途径活化的候选化合物之后进行。

上述的方法提供了抑制MyD88活化MAPK/ERK途径并有利地不干扰 MyD88在炎症通路中的作用的候选化合物。

进一步筛选选择的候选化合物增强诱导DNA损伤的化疗剂对成纤维细 胞中MyD88激活的致癌作用的抑制效果的能力。用MyD88和Myc癌基因转化 永生化成纤维细胞。术语“Myc”是指Gene Bank编号(Gene ID:4609， NG_007161.1)确定的C髓细胞瘤病病毒癌基因同源基因。Myc基因依赖于各 种促有丝分裂信号，例如EGF(通过MAPK/ERK途径)被激活。通过修饰Myc 靶基因的表达，Myc活化导致多种生物效应，像驱动细胞增殖、调节细胞生 长、凋亡、分化和干细胞的自我更新。

在本发明的方法中，所述永生化的成纤维细胞优选地是NIH3T3永生化 的成纤维细胞。

在上述选择的至少一种候选化合物的存在下和在至少一种诱导DNA损 伤的化疗剂存在下监测成纤维细胞的集落形成。选择了至少一种增强诱导 DNA损伤的化疗剂对体外细胞培养中集落形成的抑制作用的候选化合物。

优选地，本发明的方法提供了用于筛选、鉴定或选择用于治疗癌症的化 合物，其中所述癌症选自结肠直肠癌、肠癌、黑素瘤、肺癌和宫颈癌。

在上述的方法中，诱导DNA损伤的化疗剂优选地选自奥沙利铂、顺铂、 卡铂、多柔比星、依托泊苷、博来霉素及其混合物。

本发明的另一目的是用于通过在癌细胞中诱导凋亡治疗癌症的抑制 MyD88与ERK MAP激酶相互作用的化合物，其选自抑制MyD88和ERK MAP 激酶相互作用的肽和抑制人MyD88表达的干扰RNA。

术语“肽”是指肽和修饰的肽。

在优选的实施方案中，抑制MyD88和ERK MAP激酶的相互作用的化合 物是抑制人MyD88表达的干扰RNA。

干扰RNA分子用于特异性靶向信使RNA(mRNA)：干扰RNA与mRNA杂 交并由此抑制相应蛋白的翻译，其通过简单的空间阻碍，或通过促进mRNA 切割进行。

干扰RNA可以选自多种形式，例如：反义RNA、双链RNA、“小干扰RNA” RNA(siRNA)、“小发夹”RNA(shRNA)或核糖体RNA。

siRNA(代表“小干扰RNA”)是约15到30个碱基对的短序列。它们包括 第一链和一条与靶基因的RNA的靶定区域相同的额外链。

shRNA(代表“小发夹RNA”)是由表达载体中的克隆序列产生的双链 RNA，所述克隆序列编码一个会由Dicer和Loquacious复合物切割后将采用发 夹形状的RNA分子。

干扰RNA的设计和制备及其使用是众所周知的，并且在许多出版物中被 广泛描述。

在优选的实施方案中，siRNA选自SEQ ID No.1的siRNA和SEQ ID No.2 的siRNA。在另一个实施方案中，干扰RNA是包含SEQ ID No.3-4的序列的 shRNAmir。最优选地，干扰RNA是SEQ ID No.5的shRNAmir。

本发明还提供药物组合物，其包含：

a)有效量的如上所述的化合物，和

b)药学上可接受的载体，其可以是惰性的或生理活性的。

如本文所用的，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有 溶剂、分散介质、涂层材料、抗菌剂和抗真菌剂等。合适的载体、稀释剂和 /或赋形剂的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇等中的 一种或多种，及其组合。在许多情况下，优选地在组合物中包括等张剂，例 如糖、多元醇或氯化钠。特别地，合适的载体的相关实例包括：(1)Dulbecco 磷酸盐缓冲液，pH～7.4，其含有或不含有约1mg/ml至25mg/ml人血清白蛋 白，(2)0.9％盐水(0.9％w/v氯化钠(NaCl))，和(3)5％(w/v)葡萄糖；并且还可 包含抗氧化剂，如色胺和稳定剂，如Tween20。

本发明所包括的药物组合物还可包含其它的治疗癌症，特别是治疗结肠 直肠癌、肠癌、黑素瘤、肺癌和宫颈癌的治疗剂。

本发明的组合物可以是各种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂 型，但优选的形式依赖于给药和治疗应用的预期方式。典型的优选的组合物 是可注射或可输注的溶液形式。优选的给药方式是胃肠外(例如静脉内、肌 内、腹膜内、皮下)。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物作为推注 或通过连续输注一段时间静脉内给药。在另一个优选的实施方案中，它们通 过肌内、皮下、关节内、滑膜内、瘤内、瘤周、病灶内、或损伤周围的途径 注射，以发挥局部及全身的治疗效果。

可以通过在适当的溶剂中结合所需量的化合物，随后微量过滤灭菌制备 用于胃肠外给药的无菌组合物。作为溶剂或载体，可以使用水、盐水、磷酸 盐缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。在许多情况下，优选地在组 合物中包含等张剂，例如糖、多元醇或氯化钠。这些组合物还可以包含佐剂， 特别是湿润剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。用于胃肠外给药的无菌 组合物还可以以无菌固体组合物的形式制备，其可以在使用时溶解在无菌水 或任何其它可注射的无菌介质中。

包含本文所述的化合物的组合物还可以口服给药。可以使用片剂、丸剂、 粉剂(明胶胶囊，小药囊)或颗粒剂作为口服给药的固体组合物。在这些组合 物中，将本发明的活性成分与一种或多种惰性稀释剂，例如淀粉、纤维素、 蔗糖、乳糖或二氧化硅在氩气流下混合。这些组合物还可包含稀释剂以外的 物质，例如一种或多种润滑剂，例如硬脂酸镁或滑石、着色剂、涂层材料(糖 包衣片剂)或釉(glaze)。

作为用于口服给药的液体组合物，也可以使用药学上可接受的溶液、悬 浮液、乳状液、糖浆和酏剂，其含有惰性稀释剂，如水、乙醇、甘油、植物 油或石蜡油。这些组合物可包含稀释剂以外的物质，例如湿润剂、甜味剂、 增稠剂、调味剂或稳定产品。

剂量取决于所需的效果、治疗的持续时间和使用的给药途径。

本发明还涉及如上所述的化合物用于制造用于治疗癌症，特别是用于治 疗结肠直肠癌、肠癌、黑素瘤、肺癌和宫颈癌的药物的用途。

本发明还提供了用于治疗癌症的方法，包括向人或有需要的患者给药有 效量的如上所述的化合物。在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗 结肠直肠癌、肠癌、黑素瘤、肺癌和宫颈癌的方法。

本发明还涉及用于治疗癌症的组合物，所述组合物包含诱导DNA损伤的 化疗剂和抑制MyD88与ERK MAP激酶相互作用的化合物，其选自抑制 MyD88和ERK MAP激酶相互作用的肽和抑制人MyD88表达的干扰RNA。

本发明还涉及用于治疗癌症的方法，包括向人或有需要的患者给药有效 量的诱导DNA损伤的化疗剂和抑制MyD88与ERK MAP激酶相互作用的化合 物，其选自抑制MyD88和ERK MAP激酶相互作用的肽和抑制人Myd88表达 的干扰RNA。

诱导DNA损伤的化疗剂和抑制MyD88与ERKMAP激酶的相互作用的化 合物可以同时或分别给药。

诱导DNA损伤的化疗剂与抑制MyD88/Erk MAP激酶相互作用的结合使 得在敏感性肿瘤中的剂量降低，并因此增加患者的耐受性，或者在具有高效 DNA修复机制的抗性癌细胞株中再诱导敏感性。

本发明进一步涉及组合物，其包含与诱导DNA损伤的化疗剂联用治疗癌 症的抑制MyD88与ERK MAP激酶相互作用的化合物，该化合物选自抑制 MyD88和ERK MAP激酶相互作用的肽和抑制人Myd88表达的干扰RNA。

在本发明的方法和组合物中，诱导DNA损伤的化疗剂优选地选自奥沙利 铂、顺铂、卡铂、多柔比星、依托泊苷、博来霉素及其混合物。

本发明还涉及用于治疗癌症的试剂盒，所述试剂盒具有包含诱导DNA 损伤的化疗剂和抑制MyD88与ERK MAP激酶相互作用的化合物的部分，所 述化合物选自抑制MyD88和ERK MAP激酶相互作用的肽和抑制人MyD88表 达的干扰RNA。

在优选的实施方案中，本发明的化合物和组合物可用于治疗癌症，更尤 其是用于治疗结肠直肠癌、肠癌、黑素瘤、肺癌和宫颈癌。最有利的是，本 发明的化合物可用于治疗结肠直肠癌。优选地，本发明的化合物和组合物可 用于通过在癌细胞中诱导凋亡治疗癌症。

附图说明

图1：在肠癌细胞系中MyD88的沉默诱导p53依赖性凋亡。

A-在通过siRNA沉默Myd88后不同肠癌细胞系中的凋亡分析。

B-在通过两种不同siRNA沉默Myd88后HCT116p53+/+或p53-/-细胞中的 凋亡分析。

图2：体内联合测定法。

实施例

实施例1MyD88消除激活p53并诱导凋亡

先前已显示MyD88涉及肿瘤启动，我们疑问MyD88是否可以在已建立的 肿瘤的肿瘤表型的维持中发挥作用。当通过特异的siRNA消除MyD88后，细 胞发生凋亡。为了阐明肿瘤抑制蛋白p53在此凋亡中的作用，我们使用了 HCT116p53+/+或p53基因-/-细胞系。与p53-/-细胞系相比，在p53+/+细胞系 中我们在MyD88抑制后观察到大量凋亡，伴随着p53蛋白的稳定化。我们在 不同的人结肠癌细胞系中进行了相同的实验，并确认在这些细胞系中， MyD88的抑制诱导p53依赖的凋亡，表明至少在结肠癌中，这可能是普遍的 机制。

然后，我们产生了稳定表达多西环素可诱导的MyD88shRNA的HCT116 p53+/+或p53-/-。将这些细胞系皮下植入裸鼠，然后以多西环素处理或不处 理小鼠以诱导肿瘤中MyD88消除。该实验表明，肿瘤细胞中MyD88的抑制在 体内阻断了肿瘤生长。

实施例2：MyD88在维持基因组完整性中的作用

Ras/ERK信号传导途径需要MyD88。MAPK途径涉及诱导DNA修复机制 是已知的。因此，我们推测在MyD88抑制后，ERK磷酸化的减少将诱导DNA 修复机制的缺乏，诱导DNA损伤积累并引发p53依赖的凋亡。我们的数据证 实了这一假设。事实上，以组成性表达活化的MEK激酶的质粒转染HCT116 p53+/+shMyD88细胞降低了多西环素处理后诱导的其凋亡，表明MyD88消除 诱导的凋亡是由于MAPK途径的抑制所致。MAPK途径涉及DNA修复机制， 特别是涉及DNA修复的某些基因，像ERCC1蛋白的调节；因此，我们定量了 MyD88抑制后的ERCC1蛋白水平。我们观察到ERCC1蛋白水平的降低和 pH2AX的积累，表明双链DNA损伤的积累。

如果MyD88消除危及某些DNA修复系统，因此，使用遗传毒性的化疗剂 在癌细胞中诱导DNA损伤在这些细胞中缺乏MyD88的情况下应大大增加凋 亡。而事实上，我们显示MyD88抑制协同地放大了DNA损伤化疗剂，而不是 作用于其他途径的化疗诱导的细胞凋亡。

实施例3：抑制MyD88和ERK MAP激酶间相互作用的化合物的筛选

我们的目标是从不同的库中选出能够抑制MyD88与磷酸ERK相互作用 的小分子或肽。基于我们的数据，我们知道在细胞中MyD88的过表达诱导 ERK和Nf-kB途径两者的活化，其以ERK磷酸化、Nf-kB核移位、和下游转录 因子活化例示。因此，我们设计了一种两步的筛选技术。

我们使用同时稳定表达两种不同构建体的细胞系(HCT116、A375、Hela)：

1-在SRE启动子(ERK途径)或Nf-kB启动子(Nf-kB途径)控制下的萤光素 酶cDNA。

2-在抗生素诱导型启动子(多西环素)控制下的MyD88cDNA。

在这些细胞中，在培养基中加入多西环素后的24小时，我们将诱导 MyD88的过表达并激活ERK和Nf-kB途径，因此激活萤光素酶活性。

为评价小分子或肽对MyD88相互作用的影响，在培养基中加入多西环素 的同时加入候选分子，并在随后的24小时监测萤光素酶活性。在这个阶段， 我们观察到如下文所示的4种不同结果：

此测试可适于用在高通量筛选分析中。

将在第一次筛选试验中检测的显示对MyD88-ERK相互作用的抑制能力 的分子，用于基于集落形成试验的第二次功能测试。

通过转染Ras和Myc癌基因的组合可以转化NIH3T3永生化的成纤维细胞 是已知的。我们发现，MyD88替换Ras也可以诱发转化，但不能结合ERK的 MyD88的突变形式无法诱发转化。该测定读出的是结晶紫染色。

基于这些数据，以MyD88和Myc癌基因转染NIH3T3细胞，并以第一筛 选选择的分子同时处理，并监测集落的形成。如果一种分子能够阻断 MyD88-ERK相互作用，则这阻断集落的形成。

实施例4：联合检测

对HCT116p53+/+或p53-/-shMyD88细胞系进行联合检测，其中MyD88 消除在多西环素处理48小时后获得。使用四种不同的化疗剂(顺铂、奥沙利 铂、依托泊苷和紫杉醇)。每种组合检测由三种设置组成：

设置1＝细胞+单独的多西环素

设置2＝细胞+单独的化疗

设置3＝细胞+多西环素+化疗。

每种设置包含如下5种不同浓度(一式两份实施)的范围：

-多西环素处理：0-1-2-4-8-16μg/ml。

-顺铂处理：0-6，25-12，5-25-50-100μM。

-奥沙利铂处理：0-8，75-17，5-35-70-140μM。

-依托泊苷处理：0-520，5-1041-2082-4164-8328nM。

-帕西他赛(pacitaxel)治疗：0-4，5-9-18-36-72nM。

在第0天，将HCT116shMyd88p53+/+或p53-/-细胞系以10000个细胞/孔 分配于96孔板中。

在第1天，以多西环素处理设置1和3的细胞，并将设置2的细胞留在培养 基中。

在第3天，将设置1的细胞留在包含多西环素的培养基中，化疗处理设置 2和3的细胞。

在第6天，MTS试验测量每孔中活细胞的百分比。使用CompuSyn软件分 析原始数据并生成指示存在或不存在协同作用的组合指数。

结果表明，MyD88沉默与诱导DNA损伤的化疗有协同作用。

在HCT116p53+/+或p53-/-DOX可诱导的shMyD88细胞中MyD88沉默(多西 环素处理)和不同化疗剂间的各种组合条件的组合指数显示于下表。

协同＝IC<1

没有协同＝IC>1

实施例5：体内联合检测方案

将HCT116p53+/+shMyD88细胞皮下注射到裸鼠的侧翼。肿瘤发生(200 mm³)后，处理四组小鼠：

-对照组：小鼠接受3％葡萄糖的饮用水。

-多西环素组：小鼠接受3％葡萄糖+2mg/ml多西环素的饮用水。

-顺铂组：小鼠接受3％葡萄糖的饮用水并以每2天0.5mg/kg的剂量腹膜 内注射顺铂。

-联合组：小鼠接受3％葡萄糖+2mg/ml多西环素的饮用水，并以每2天 0.5mg/kg的剂量腹膜内注射顺铂。

每3天测量肿瘤体积并监测到方案结束。

实施例6：用于测量MYD88和ERK MAP激酶间相互作用的抑制的分析

1)邻近连接技术

基于两种识别靶抗原的不同物种中产生的一抗，将邻近连接分析用于确 定内源性蛋白-蛋白相互作用。将各具有与其附接的特有短DNA链的物种特 异性二抗(称为PLA探针)与一抗结合。

当PLA探针相距较近(<40nm)时，DNA链可以通过随后加入的两个其他 成环的DNA寡核苷酸相互作用。通过酶连接来连接两个加入的寡核苷酸后， 使用聚合酶通过滚环扩增将其扩增。

因此，发生了DNA环的几百倍复制，并且标记的互补寡核苷酸探针突出 显示产物。当用荧光显微镜观察时，作为特有的亮点可以容易地看到在每个 单分子扩增产物中产生的高浓度荧光。

详细的方案：

-用10％FCS刺激细胞5和10分钟，用4％PFA固定，用含0.3％皂苷，10％ BSA的PBS透化和封闭。

-然后将细胞用针对MyD88(Assay Designs)和p-ERK(Sigma-Aldrich)的 一抗培养过夜。

-用1X PBS洗涤3次后，在37℃将细胞与合适的DNA连接的二抗(PLA) 孵育2小时。

-用1X PBS洗涤2次后，在37℃加入杂交液15分钟。

-用TBS-T洗涤2次后，在37℃加入Duolink聚合酶90分钟。

-用TBS-T洗涤2次后，在37℃加入检测溶液60分钟。

-然后，2分钟洗涤如提及的那样依次进行：2X SSC、1X SSC、0.2X SSC、 0.02X SSC和70％EtOH。

-使用Duolink封固培养基封固细胞。

2)免疫沉淀测定法：

免疫沉淀测定法用于可视化蛋白-蛋白相互作用。

-在10cm板中接种3.10⁶个HEK293T细胞。

-24小时后，用3μg感兴趣的质粒转染HEK293T。

-转染48小时后收获细胞，使用含有1％NP40、20mM Tris pH7.5、150 mM NaCl和2mM EDTA的裂解缓冲液裂解细胞。

-裂解和蛋白质剂量后，使用每种条件1-2mg蛋白进行免疫沉淀实验。

-将裂解物在4℃，旋转器上用30μL蛋白A琼脂糖珠孵育30分钟。

-在4℃以2000rrpm将管离心5分钟。

-将上清液转移到新的管中。

-预澄清的裂解物中加入2-5ug抗体。在4℃下在旋转器上孵育2-4小时。

-加入50μL蛋白A琼脂糖珠。将管在4℃下在旋转器上孵育1小时。

-在4℃以2000rpm将管离心5分钟。弃上清，并保留珠。

-以1mL裂解缓冲液洗珠3-4次。在4℃以2000rmp离心5分钟。

-珠子加入50μL 2X Laemelli缓冲液以洗脱蛋白。

-通过WB显现2种蛋白间的相互作用。

参考文献

Rakoff-Nahoum S等人，2007.Science

Coste I等人，2010J Clin Invest

Dai Y等人，2008.Blood

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