含有髓磷脂碱性蛋白的寡肽片段的脂质体,用于治疗多发性硬化的药物组合物和方法

技术领域

相关申请的交叉参考

本申请要求于2012年4月11日提交的美国专利申请13/444788的优先权，标题 为“含有髓磷脂碱性蛋白的寡肽片段的脂质体，用于治疗多发性硬化的药物组合物和 方法”，在此特别引入其公开全文作为参考，用于所有目的。

背景技术

多发性硬化(MS)是神经退行性疾病，其表现为大脑和脊髓的轴突周围的脂肪 髓鞘受损，导致脱髓鞘和瘢痕形成。对中枢神经系统(CNS)的损害导致大范围的神 经症状。全世界大约一百万人患有自体免疫性疾病，其具有让人费解的病因以及知之 甚少的发病机理。针对髓鞘膜成分具有反应性的B细胞和T细胞介导大脑和脊髓脱 髓鞘并似乎是大部分病情恶化的原因。

MS患者的B细胞和T细胞对其具有反应性的潜在自身抗原的列表逐步增长且包 含若干少突胶质细胞相关的蛋白质、最显著的髓磷脂碱性蛋白(MBP)以及髓鞘少突 胶质细胞糖蛋白(MOG)。这些巨噬细胞和淋巴球透过血脑屏障(BBB)对中枢神经 系统的渗透，使大脑和脊髓中形成炎性脱髓鞘损伤。

当T细胞成为大部分脱髓鞘效果的原因时，B细胞也同样起到了实质性的作用。 这是因为B细胞的功能就像抗原递呈细胞和产生细胞因子的细胞一样，除此之外， 还有其在生产抗体方面已充分认知的作用(Hikada和Zouali,Nat Immunol 2010； 11:1065-8)。脱髓鞘过程中B细胞参与的附加证据是在多发性硬化患者中检测出MBP 的催化性抗体。这些催化性抗体不仅能够结合其抗原，还能够对其切割(Ponomarenko  NA等,Proc Natl Acad Sci USA 2006；103:281-6)。证据显示MS的恶化存在强烈的环 境因素，其可与神经元和病毒抗原交叉反应的自身抗体有助于MS的病因和发病机理 的形成(Gabibov AG等,FASEB J 2011；25:4211-21)。

许多MS的疗法已被提出，包括：(1)醋酸格拉替雷(GA)的施用；(2)与T 细胞受体(TCR)产生相互作用的“变异性肽配体”(APL)的施用；(3)IFNβ的施 用；(4)抗CD20、抗CD25和抗CD52单克隆抗体的施用；(5)各种口服疗法；(6) 具有灭活的T细胞或TCR高变区的疫苗接种；(7)通过自身抗原的施用或DNA疫 苗接种实现的免疫系统的免疫耐受作用；以及(8)B细胞靶向的耗竭疗法。

然而，尽管具有令人满意的临床、免疫学和生化数据，但是目前的治疗方法都不 能治愈或预防多发性硬化的恶化。因此，本领域急需有效的MS治疗方法。

发明内容

在一方面，本发明通过提供用于为有需要的受治对象施用的链接到载体的免疫显 性的MBP肽的治疗组合物，满足了医学领域对于用于治疗多发性硬化的有效组合物 和方法的需求。在具体的实施例中，该组合物包括包封于甘露糖基化脂质体的免疫显 性的MBP肽。如本文所示，这些组合物的施用改善了EAE诱导的MS大鼠模型中进 行的实验性自身免疫性脑脊髓炎。

本发明在某种程度上基于以下发现：某些MBP肽是患有多发性硬化的患者中主 要的B细胞表位。据发现，对MS啮齿动物模型施用这些肽(但并非游离肽)的脂质 体制剂，导致统计学上显著的麻痹减轻。在不受理论约束的情况下，这些肽的脂质体 制剂可能增加递送到免疫细胞(例如：B细胞和/或抗原递呈细胞)的这些肽和/或增 加摄入免疫细胞(例如：B细胞和/或抗原递呈细胞)的这些肽。

因此，本发明除其它方面以外提供用于治疗多发性硬化的组合物和方法。该组合 物包括一种或多种已鉴定的链接到载体(例如：甘露糖基化脂质体)的MBP肽。

一方面，本发明提供用于治疗多发性硬化的组合物，该组合物包括链接到第一载 体的第一髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽，该第一MBP肽由以下氨基酸序列组成： (R¹)_a-P₁-(R²)_b，其中，P₁是与选自SEQ ID NOS:1-3组成的基团的氨基酸序列具有至 少85％同一性的氨基酸序列；R₁和R₂分别为独立地包含1-10个氨基酸的氨基酸序 列；以及a和b各自独立地为0或1。

在上述组合物的一个实施方式中，a和b均为0。在上述组合物的另一个实施方 式中，a为1而b为0。在上述组合物的另一个实施方式中，a为0而b为1。在上述 组合物的又一个实施方式中，a和b均为1。

在上述组合物的一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的 氨基酸序列。在上述组合物的另一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:1具有至少90％ 同一性的氨基酸序列。在上述组合物的另一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:1具 有至少95％同一性的氨基酸序列。在上述组合物的又一个实施方式中，P₁是SEQ ID  NO:1的氨基酸序列。

在上述组合物的一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的 氨基酸序列。在上述组合物的另一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:2具有至少90％ 同一性的氨基酸序列。在上述组合物的另一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:2具 有至少95％同一性的氨基酸序列。在上述组合物的又一个实施方式中，P₁是SEQ ID  NO:2的氨基酸序列。

在上述组合物的一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性的 氨基酸序列。在上述组合物的另一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:3具有至少90％ 同一性的氨基酸序列。在上述组合物的另一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:3具 有至少95％同一性的氨基酸序列。在上述组合物的又一个实施方式中，P₁是SEQ ID  NO:3的氨基酸序列。

在上述组合物的一个实施方式中，该组合物进一步包括链接到第二载体的第二 MBP肽，该第二MBP肽由以下氨基酸序列组成：(R³)_c-P₂-(R⁴)_d，其中，P₂是与选自 SEQ ID NOS:1-3组成的基团的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；R³和 R⁴分别为独立地包含1-10个氨基酸的氨基酸序列；以及_c和d各自独立地为0或1，， 其中P₁和P₂为不同的氨基酸序列。

在上述组合物的一个实施方式中，该第一载体和第二载体为同一载体。

在上述组合物的一个实施方式中，该组合物进一步包括链接到第三载体的第三 MBP肽，该第三MBP肽由以下氨基酸序列组成：(R⁵)_e-P₃-(R⁶)_f，其中，P₃是与选自 SEQ ID NOS:1-3组成的基团的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；R⁵和 R⁶分别为独立地包含1-10个氨基酸的氨基酸序列；以及_e和f各自独立地为0或1， 其中P₁、P₂和P₃为不同的氨基酸序列。

在上述组合物的一个实施方式中，该第一载体、第二载体和第三载体为相同的载 体。

在上述组合物的一个实施方式中，P₁是SEQ ID NO:1的氨基酸序列；P₂是SEQ ID  NO:2的氨基酸序列；以及P₃是SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

在上述组合物的一个实施方式中，该MBP肽共价地链接到载体。在上述组合物 的另一个实施方式中，该MBP肽非共价地链接到载体。

在上述组合物的一个实施方式中，该载体包括纳米颗粒。在上述组合物的一个具 体实施方式中，该纳米颗粒为脂质体。

在上述组合物的一个实施方式中，该载体包括靶向官能基。在上述组合物的一个 具体实施方式中，该载体为靶向官能基。

在上述组合物的一个实施方式中，与缺乏靶向官能基的链接到载体的MBP肽相 比，该靶向官能基增加：(1)递送到免疫细胞的MBP肽；或(2)摄入免疫细胞的 MBP肽。

在上述组合物的一个实施方式中，靶向官能基包括甘露糖残基。在上述组合物的 另一个实施方式中，该靶向官能基包括特异地结合免疫细胞的抗体。在上述组合物的 另一个实施方式中，该靶向官能基包括特异地结合到免疫细胞的适配体。在上述组合 物的一个实施方式中，该靶向官能基包括特异地结合到免疫细胞的肽。在上述组合物 的一个实施方式中，该免疫细胞为B细胞。在上述组合物的另一个实施方式中，该 免疫细胞为抗原递呈细胞(APC)。

在一方面，本发明提供了用于治疗多发性硬化的组合物，该组合物包括链接到第 一载体的第一髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽，第一MBP肽由以下氨基酸序列组成： (R¹)_a-P₁-(R²)_b，其中，P₁是与选自SEQ ID NOS:1-3组成的基团的氨基酸序列具有至 少85％同一性的氨基酸序列；R₁和R₂分别为独立地包含1-10个氨基酸的氨基酸序列； 以及a和b各自独立地为0或1，其中该载体为包括甘露糖基化脂质的脂质体。

在上述组合物的一个实施方式中，P₁是SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在上述组合物的一个实施方式中，该组合物进一步包括：链接到第二载体的第二 MBP肽，该第二MBP肽由以下氨基酸序列组成：(R³)_c-P₂-(R⁴)_d；以及链接到第三载 体的第三MBP肽，该第三MBP肽由以下氨基酸序列组成：(R⁵)_e-P₃-(R⁶)_f，其中，P₁是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；P₂是与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；P₃是与SEQ ID NO:3的氨基 酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶分别为独立地 包含1-10个氨基酸的氨基酸序列；以及a、b、c、d、e和f各自独立地为0或1。

在上述组合物的一个实施方式中，该MBP肽非共价地链接到脂质体。在上述组 合物的另一个实施方式中，该MBP肽通过脂质体包封。

在上述组合物的一个实施方式中，该脂质体具有100nm到200nm的平均直径。

在上述组合物的一个实施方式中，该甘露糖基化脂质为四甘露糖基-3-L-赖氨酸- 二油酰基甘油。在上述组合物的另一个实施方式中，该甘露糖基化脂质为manDOG。

在一方面，本发明提供了用于为有需要的患者治疗多发性硬化的方法，该方法 包括对该患者施用组合物，该组合物包括链接到第一载体的第一髓磷脂碱性蛋白 (MBP)肽，该第一MBP肽由以下氨基酸序列组成：(R¹)_a-P₁-(R²)_b，其中，P₁是与 选自SEQ ID NOS:1-3组成的基团的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列； R₁和R₂分别为独立地包含1-10个氨基酸的氨基酸序列；以及a和b各自独立地为0 或1。

在上述方法的一个实施方式中，a和b均为0。在上述方法的另一个实施方式中， a为1而b为0。在上述方法的另一个实施方式中，a为0而b为1。在上述方法的又 一个实施方式中，a和b均为1。

在上述方法的一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的氨 基酸序列。在上述方法的另一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:1具有至少90％同 一性的氨基酸序列。在上述方法的另一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:1具有至 少95％同一性的氨基酸序列。在上述方法的又一个实施方式中，P₁是SEQ ID NO:1 的氨基酸序列。

在上述方法的一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的氨 基酸序列。在上述方法的另一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:2具有至少90％同 一性的氨基酸序列。在上述方法的另一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:2具有至 少95％同一性的氨基酸序列。在上述方法的又一个实施方式中，P₁是SEQ ID NO:2 的氨基酸序列。

在上述方法的一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性的氨 基酸序列。在上述方法的另一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:3具有至少90％同 一性的氨基酸序列。在上述方法的另一个实施方式中，P₁是与SEQ ID NO:3具有至 少95％同一性的氨基酸序列。在上述方法的又一个实施方式中，P₁是SEQ ID NO:3 的氨基酸序列。

在上述方法的一个实施方式中，该组合物进一步包括链接到第二载体的第二 MBP肽，该第二MBP肽由以下氨基酸序列组成：(R³)_c-P₂-(R⁴)_d，其中，P₂是与选自 SEQ ID NOS:1-3组成的基团的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；R³和 R⁴分别为独立地包含1-10个氨基酸的氨基酸序列；以及_c和d各自独立地为0或1， 其中P₁和P₂为不同的氨基酸序列。

在上述方法的一个实施方式中，该第一载体和第二载体为相同的载体。

在上述方法的一个实施方式中，该组合物进一步包括链接到第三载体的第三 MBP肽，该第三MBP肽由以下氨基酸序列组成：(R⁵)_e-P₃-(R⁶)_f，其中，P₃是与选自 SEQ ID NOS:1-3组成的基团的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；R⁵和 R⁶分别为独立地包含1-10个氨基酸的氨基酸序列；以及_e和f各自独立地为0或1， 其中P₁、P₂和P₃为不同的氨基酸序列。

在上述方法的一个实施方式中，该第一载体、第二载体和第三载体为相同的载体。

在上述方法的一个实施方式中，P₁是SEQ ID NO:1的氨基酸序列；P₂是SEQ ID  NO:2的氨基酸序列；以及P₃是SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

在上述方法的一个实施方式中，该MBP肽共价地链接到载体。在上述方法的另 一个实施方式中，该MBP肽非共价地链接到载体。

在上述方法的一个实施方式中，该载体包括纳米颗粒。在一个具体实施方式中， 该纳米颗粒为脂质体。

在上述方法的一个实施方式中，该载体包括靶向官能基。

在上述方法的一个实施方式中，与缺乏靶向官能基的链接到载体的MBP肽相比， 该靶向官能基增加：(1)递送到免疫细胞的MBP肽；或(2)摄入免疫细胞的MBP 肽。

在上述方法的一个实施方式中，该载体为靶向官能基。在上述方法的另一个实施 方式中，靶向官能基包括甘露糖残基。在上述方法的另一个实施方式中，该靶向官能 基包括特异地结合免疫细胞的抗体。在上述方法的另一个实施方式中，该靶向官能基 包括特异地结合到免疫细胞的适配体。在上述方法的一个实施方式中，该靶向官能基 包括特异地结合到免疫细胞的肽。在上述方法的一个实施方式中，该免疫细胞为B 细胞。在上述方法的另一个实施方式中，该免疫细胞为抗原递呈细胞(APC)。

在上述方法的一个实施方式中，该组合物包括具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列 的MBP肽，该链接到载体的MBP肽包括靶向官能基，其中该包括靶向官能基的载 体为包括甘露糖基化脂质的脂质体。

在上述方法的一个实施方式中，该组合物包括：(1)具有SEQ ID NO:1的氨基 酸序列的第一MBP肽；(2)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的第二MBP肽；以及 (3)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第三MBP肽。

在上述方法的一个实施方式中，该MBP肽非共价地链接到脂质体。

在上述方法的一个实施方式中，该MBP肽由脂质体包封。

在上述方法的一个实施方式中，该脂质体具有100nm到200nm的平均直径。

在上述方法的一个实施方式中，该甘露糖基化脂质为四甘露糖基-3-L-赖氨酸-二 油酰基甘油。在上述组合物的另一个实施方式中，该甘露糖基化脂质为manDOG。

在上述方法的一个实施方式中，每周至少对患者施用该组合物一次。在上述方法 的另一个实施方式中，每周至少对患者施用该组合物两次。在上述方法的另一个实施 方式中，每天对患者施用该组合物。

在上述方法的一个实施方式中，该组合物通过局部给药、肠溶给药和胃肠外给药 进行施用。

附图说明

图1.具有诱导的EAE的DA大鼠是关于抗-MBP自身抗体结合方式最相关的MS 啮齿动物模型。(A)采自MS患者和患有实验性自身免疫性脑脊髓炎的啮齿动物模 型(DA大鼠、SJL和C57BL/6小鼠)的血清自身抗体可再生地结合ELISA中的MBP。 BALB/c小鼠的血清用于阴性对照。(B)MBP表位库的设计。具有MBP表位库的抗 原癌基因和抗MBP单克隆抗体的典型的考马斯染色和蛋白免疫印迹杂交。由于靶向 表位存在于所有融合蛋白中(上述方案)，抗原癌基因抗体结合MBP表位库的所有 成分，因此，显示出正处于原癌基因表位的上游的所有MBP肽的暴露及可达性。正 如所预测的，单克隆抗MBP抗体(克隆F4A3，MBP表位RHGFLPRHR(SEQ ID  NO:20)与整个MBP及其肽MBP2和肽MBP3反应。(C)根据ELISA的针对MBP 表位库的血清自身抗体结合方式。根据我们的数据，患有EAE的DA大鼠是与MS 啮齿动物模型最相关的。具有显示于其表位库的肽的MBP序列在底部显示(SEQ ID  NO:17)。第十个氨基酸残基分别被标为粗体。方括号表示选择用于治疗效率筛选的 免疫显性肽MBP-1/-2/-3。

图2.采自于用MBP(63-81)免疫的DA大鼠的多克隆抗体特异性和亲和性的特 征描述。(A)上图显示了三个MBP片段通过具有诱导的EAE的DA大鼠中的血清 自身抗体识别。根据结合表位库的自身抗体的ELISA以及基于其重叠序列假设的进 一步的理论计算确定免疫显性肽。此外，该MBP表位库与抗原癌基因以及抗MBP F4A3单克隆抗体杂交以验证该结合测定(下图)。(B)通过自身抗体识别的确定表 位的定量特征由SPR技术测定。已示出各自的肽和有效解离常数。精确的表位以粗 体显示，ND＝不确定。

图3.用于将MBP免疫显性肽包封于甘露糖基化SUV脂质体的脂质体化技术的 示意图。(左上)氯仿中脂质的混合物(具有1％甘露糖基化DOG的蛋PC)。(中上) 有机溶剂蒸发过程中不规则脂质层的形成。(右上)导致多层MLV脂质体形成的第 一次再水化。颗粒的平均直径为1-5μm。(左下)通过高压均质从MLV脂质体中获 得的SUV脂质体，以及具有过量糖的肽混合物的冷冻干燥。(中下)肽位于折叠的 SUV脂质体之间。(右下)第二次再水化期间，将肽包封到SUV脂质体中，该脂质 体具有约60-80nm的尺寸且其表面具有1.0％的甘露糖残基。透视图由视觉科学公司 (Visual Science Company)提供。

图4.包埋于脂质体的免疫显性MBP肽改善DA大鼠中的实验性自身免疫性脑脊 髓炎。对研究中的所有组(A-G)进行有关平均病症评分、神经胶质过多症/脱髓鞘比 率的测试。未治疗的对照(媒介物)组通过粗体暗色线(A)显示并在各图中重复出 现用于对比。包封于甘露糖基化SUV脂质体的三个MBP免疫显性片段用于DA大鼠 的EAE治疗：MBP(46-62)在病症第一次发作(B)期间最有效地降低最高病症评 分，MBP(124-139)(C)和MBP(147-170)(D)防止复发阶段病症的进展。包埋 于脂质体的免疫显性MBP肽MBP(46-62)、MBP(124-139)和MBP(147-170)的 混合物的施用显著改善了慢性EAE(E)，醋酸格拉替雷(F)和游离肽MBP(46-62) (G)分别用于阳性对照和阴性对照。显示每组的平均病症评分。通过粗体浅色线显 示统计学上的显著差异。通过细体线显示所选的个体大鼠的代表性状况。右图显示代 表性苏木素和伊红染色。

图5.包埋于脂质体的免疫显性MBP肽降低血清抗MBP自身抗体滴定度并下调 Th1CNS细胞因子谱。(A)与未经治疗的非免疫大鼠相比，经MBP1SUV、MBP1/2/3 SUV以及醋酸格拉替雷治疗的EAE DA大鼠的血清抗MBP自身抗体浓度。与未经 治疗的大鼠(左上)相比，用于Th1细胞因子IFNγ(B)和IL2(C)的典型坚牢蓝 染色(B)和免疫染色，以及经MBP1SUV(右下)、MBP1/2/3SUV(左下)以及醋 酸格拉替雷治疗(右上)的DA大鼠脑部的BDNF(D)的免疫染色。

图6.MS EAE诱导的大鼠模型的平均麻痹评分。在研究持续期间每天为每只大鼠 分配麻痹评分：环境适应性、EAE诱导、治疗和后期治疗(共35天)。54只EAE诱 导的DA大鼠平均分成9组。第I-VII组通过制剂1-7进行治疗，第VIII组通过醋酸 格拉替雷进行治疗(阳性对照组)，第IX组施用水注射剂(阴性对照组)。每日记录 麻痹评分并显示第I-V组(A)和第VI-IX组(B)的平均值。在治疗后的第3天和 第4天，观察到第IV组(经制剂4治疗)的麻痹评分相比对照组在统计学上显著降 低(n＝6,*p<0.05)。标准差通过误差条表示。

图7.MS EAE诱导的大鼠模型的平均体重(g)。在所有研究期间，记录所有动物 的体重：环境适应性、EAE诱导、治疗和后期治疗(共35天)。54只EAE诱导的 DA大鼠平均分成9组。在通过MBP肽制剂治疗的大鼠与对照组大鼠的体重之间没 有发现统计学上的显著差异。标准差通过误差条表示。

图8.MS EAE诱导的大鼠模型脊髓的苏木素和伊红(H&E)染色。从EAE诱导 的大鼠中分离的脊髓放大10倍和40倍的图像，该大鼠通过如下方式治疗：(A)(大 鼠35；第II组)、(大鼠53；第IV组)、(大鼠69；第IX组)；(B)(大鼠71；第VIII 组)、(大鼠77；第III组)、(大鼠79；第V组)；以及(C)(大鼠81；第I组)、(大 鼠95；第VII组)、(大鼠2003；第VI组)。

图9.实验设计。实验布置，包括实施例12、13和14中测试的所有实验制剂的 肽的同一性、脂质体含量以及用量。MBP1(SEQ ID NO:1)；MBP1FL(SEQ ID NO:9)； MBP1FR(SEQ ID NO:10)；MBP2(SEQ ID NO:2)；MBP(SEQ ID NO:3)。

图10.MS EAE诱导的大鼠模型的平均麻痹评分。在研究持续期间，每天为每只 大鼠分配麻痹评分：环境适应性、EAE诱导、治疗和后期治疗(共36天)。54只EAE 诱导的DA大鼠分成10组。第I-VIII组通过制剂MBP F 1-8进行治疗，第IX组通过 醋酸格拉替雷进行治疗(阳性对照组)，对第X组施用水注射剂(阴性对照组)。在 经治疗后的第2天和第3天，与对照组相比，观察到第III组和第IV组(通过200mg 剂量治疗)的麻痹评分在统计学上显著降低(n＝5,*p<0.05)。标准差通过误差条表示。

图11.MS EAE诱导的大鼠模型的平均体重(g)。在所有研究期间，记录所有动 物的体重：环境适应性、EAE诱导、治疗和后期治疗(共36天)。54只EAE诱导的 DA大鼠平均分成10组。在通过MBP肽制剂治疗的大鼠与对照组大鼠的体重之间没 有发现统计学上的显著差异。标准差通过误差条表示。

图12.MS EAE诱导的大鼠模型的平均麻痹评分。在研究持续期间，每天为每只 大鼠分配麻痹评分：环境适应性、EAE诱导、治疗和后期治疗(共36天)。42只EAE 诱导的DA大鼠分成7组。第II-V组通过制剂MBP F I-IV进行治疗，第VI组和第 VII组通过醋酸格拉替雷进行治疗(分别为150μg和450μg；阳性对照组)，以及对 第I组施用水注射剂(阴性对照组)。与阴性对照组相比，观察到：在治疗后的第1-4 天，第II组(通过MBP1脂质体制剂治疗；肽与脂质比率为1:330)的麻痹评分在统 计学上显著降低(n＝6,*p<0.005)；在治疗后的第1天，第III组(通过MBP1/2/3脂 质体制剂治疗；肽与脂质比率为1:330)的麻痹评分在统计学上显著降低(n＝6, *p<0.05)；以及在治疗后的第1-3天，第V组(通过MBP1/2/3脂质体制剂治疗；肽 与脂质比率为1:110)的麻痹评分在统计学上显著降低(n＝6,*p<0.05)。标准差通过 误差条表示。

图13.MS EAE诱导的大鼠模型的平均体重(g)。在所有研究期间，记录所有动 物的体重：环境适应性、EAE诱导、治疗和后期治疗。42只EAE诱导的DA大鼠平 均分成7组。在通过MBP肽制剂治疗的大鼠与对照组大鼠的体重之间没有发现统计 学上的显著差异。标准差通过误差条表示。

图14.7种MBP剪接亚型的序列比对。通用蛋白质资源识别号：P02686(SEQ ID  NO:13)；P02686-2(SEQ ID NO:14)；P02686-3(SEQ ID NO:15)；P02686-4(SEQ ID  NO:16)；P02686-5(SEQ ID NO:17)；P02686-6(SEQ ID NO:18)；以及P02686-7(SEQ  ID NO:19)。

具体实施方式

导言

多发性硬化(MS)是具有自身免疫背景的严重神经退行性疾病。尽管已知用于 应对多发性硬化的几种治疗方法，但是并不存在能够治愈这种疾病的方法。此外，目 前疗法的疗效有限且可能产生有害的副作用。因此，研发MS的新型治疗方法显得格 外重要。本文报导了组合物以及包封于小单层囊泡(SUV)甘露糖基化脂质体内的髓 磷脂碱性蛋白(MBP)的B细胞表位作为有效药物的用途，其用于作为人类MS技 术上可接受的模型的DA大鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的治疗。

在一方面，本发明提供链接到载体的抗原性MBP肽的治疗组合物，其可用于多 发性硬化的治疗。在具体的实施方式中，该治疗组合物包括一种、两种或三种链接到 载体的抗原性MBP肽(例如：脂质体)，其选择性地包括靶向官能基(例如：甘露糖 基化脂质)。当对多发性硬化患者施用时，该治疗组合物提高认知能力并且缓解麻痹 症状。因此，本发明同样提供了对有需要的受治对象进行治疗、管理以及预防多发性 硬化的方法。

通过使用髓磷脂碱性蛋白表位库，分析复发缓解型MS患者的血清自身抗体 (autoAb)的结合形式，并将其与患有EAE的来自瑞士詹姆斯兰伯特(SJL)小鼠、 C57black 6(C57BL/6)小鼠以及黑刺(DA)大鼠比较。据发现患有EAE的DA大 鼠是与基于自身抗体到MBP片段的光谱的MS啮齿动物模型最相关的。包封于甘露 糖基化SUV脂质体的三个MBP免疫显性片段用于DA大鼠EAE的治疗。MBP(46-62) 在病症第一次发作期间最有效地降低最高病症评分，而MBP(124-139)和MBP (147-170)防止恶化阶段病症的进展。包埋于脂质体的免疫显性MBP肽混合物的施 用通过下调Th1细胞因子以及诱导BDNF在CNS中的产生显著改善了慢性EAE。 MBP肽的协同作用降低了具有中度第一次发作的总体病程和快速的恶化结果，表明 其为一种新型的MS治疗模式。

II.定义

正如本文所使用的，术语“载体”指的是能与载物相关联的分子结构(例如：治 疗性或诊断性的小分子、肽、核酸以及蛋白生物制剂)。在一个实施方式中，载体是 为有需要的受治对象施用的藏匿或引导治疗性载物(例如：MBP肽)的分子结构。 载体可以但并不一定：提高由载物赋予的治疗效果；改善或定位载物的传递，使其进 入体内位置或各种类型的细胞中；改善载物的摄取，使其进入细胞或体内或体外的特 定细胞中；提高体内载物的半衰期；保护载物免受体内有害的相互作用的影响；或者 从受试者的血流和/或身体中降低载物的清除率。在一个实施方式中，载体包括纳米 颗粒，如下面所定义的，该纳米颗粒具有包封、嵌入、系留载物的能力。选择性地， 载体，例如：纳米颗粒媒介物，可进一步包括靶向官能基。在另一个实施方式中，载 体为直接链接(共价地或非共价地)到载物的靶向官能基。载体的非限定性的实例包 含：纳米颗粒，例如脂质体、胶束、嵌段共聚物胶束、聚合物囊泡、类脂质体囊泡、 裹覆脂质的纳米气泡以及树形分子；固体传递体，例如：金属颗粒和硅石颗粒；糖官 能基，例如：甘露糖、甘露糖衍生物、甘露糖类似物或包含一个或多个甘露糖残基、 甘露糖衍生物或甘露糖类似物的碳水化合物；肽，例如：细胞受体的配体；多肽，例 如：抗体或其功能片段；以及核酸，例如：适配体或

正如本文所使用的，术语“靶向官能基”指的是当与载物相关联时，与单独载物 的疗效相比，提高治疗性或诊断性载物疗效的药剂。在一个实施方式中，靶向官能基 改善相关载物的传递，使其进入到体内位置或各种类型的细胞中；和/或改善载物的 摄取，使其进入细胞或体内位置。该靶向官能基可共价或非共价地链接到载物(例如： MBP肽)，包含但不限于，通过共价键、离子键、静电作用、疏水作用或物理包埋。 在某些实施方式中，该链接可通过链接基团或其他载体结构介导。靶向官能基的实例 包括但不限于，糖基(例如：甘露糖或含有一个或多个甘露糖残基的碳水化合物)、 肽(例如：细胞受体的配体)、多肽(例如：抗体或其功能片段)以及核酸(例如： 适配体或)。

正如本文所使用的，术语“包括靶向官能基的载体”指的是增加输入细胞的载物 和/或增加摄入细胞的载物的分子结构。在一个实施方式中，该载体包括共价或非共 价地链接到能运送载物(例如：MBP肽或其它治疗性药剂)的纳米媒介物的靶向官 能基。选择性地，该包括靶向官能基的载体包含能藏匿载物的纳米颗粒媒介物。在另 一个实施方式中，包括靶向官能基的载体由直接共价或非共价链接到载物(例如： MBP肽或其它治疗性药剂)的靶向官能基组成。在具体的实施方式中，包括靶向官 能基的载体为靶向官能基。

正如本文所使用的，术语“纳米颗粒”指的是平均直径在约1nm至约1000nm之 间的载体，其链接到载物，例如：肽(例如：MBP肽)、核酸、治疗性官能基或诊断 性官能基。纳米颗粒可以是中空的(例如：具有外壳和空心)、固体的或多层的。该 载物(例如：MBP肽)可被系留于、嵌入或包封于纳米颗粒。许多纳米颗粒为本领 域已知的(参见，例如，Elizondo等,Prog Mol Biol Transl Sci.2011；104:1-52，其内 容在此特别全文引入作为参考，用于所有目的)并且包含但不限于，脂质体、胶束、 嵌段共聚物胶束(参见Kataoka等，Adv Drug Deliv Rev.2001年3月23日； 47(1):113-31，其内容在此特别全文引入作为参考，用于所有目的)、聚合物囊泡(参 见Christian等，Eur J Pharm Biopharm.2009年3月；71(3):463-74，其内容在此特别 全文引入作为参考，用于所有目的)、类脂质体囊泡(参见Kazi等，J Adv Pharm  Technol Res.2010年10月；1(4):374-80，其内容在此特别全文引入作为参考，用于所 有目的)、裹覆脂质的纳米气泡(Unger等，Adv Drug Deliv Rev.2004年5月7日； 56(9):1291-314，其内容在此特别全文引入作为参考，用于所有目的)、树形分子、金 属颗粒(例如：氧化铁颗粒或金颗粒)以及硅石颗粒。

在一个实施方式中，纳米颗粒的平均直径在约1nm至约1000nm之间。在另一个 实施方式中，纳米颗粒的平均直径在约20nm至约500nm之间。在另一个实施方式中， 纳米颗粒的平均直径在约50nm至约400nm之间。在另一个实施方式中，纳米颗粒的 平均直径在约75nm至约300nm之间。在其它的实施方式中，纳米颗粒的平均直径在 约100nm至约200nm之间。在某些实施方式中，脂质体可包含阳离子脂质、阴离子 脂质、两性离子脂质、中性脂质或前述脂质的组合。

正如本文所使用的，术语“脂质体”指的是脂质双分子层(即，薄层)包围的任 意结构。术语脂质体包含多层囊泡(MLV)脂质体，其尺寸范围在约0.1μm至约5μm 之间，小单层囊泡(SUV)脂质体，其尺寸范围在约0.02μm至约0.05μm之间，以 及大单层囊泡脂质体，其尺寸范围在约0.06μm以上。正如本文所使用的，术语“多 层”指的是含有两个脂质层以上的脂质结构。相应地，术语“单层”指的是含有两个 脂质层的脂质结构，即，单脂质薄层。通常，当存在于水环境时，大多数包括脂质双 分子层的脂质的亲水部分(例如：脂质极性头部基团)将位于结构的表面(即，薄层 的内外表面或外表面)，以及大多数包括脂质双分子层的脂质的疏水部分(例如：饱 和或不饱和羟基)将位于双分子层内部。

正如本文所使用的，术语“胶束”指的是脂质单分子层包围的任意结构。通常， 当存在于水环境时，大多数包括胶束的脂质的亲水部分(例如：脂质极性头部基团) 将位于结构的表面，以及大多数包括胶束的脂质的疏水部分(例如：饱和或不饱和羟 基)将位于结构内部的。在某些实施方式中，脂质体可包封于较大的胶束中。同样地， 在某些实施方式中，胶束可包封于较大的脂质体中。

正如本文所使用的，术语“甘露糖基化脂质体”指的是包括与脂质双分子层外部 相关联的一个或多个甘露糖残基、甘露糖衍生物或甘露糖类似物的脂质体。在一个实 施方式中，甘露糖基化脂质体包括缀合到一个或多个甘露糖残基、衍生物或类似物的 脂质。在具体的实施方式中，该甘露糖残基、衍生物或类似物将缀合到通常位于水环 境中存在的脂质双分子层外侧的极性头部基团或其它其他脂质结构(例如：脂质体的 外侧和/或内侧表面)。优选地，至少一定比例的缀合到甘露糖基化脂质体的甘露糖残 基、衍生物或类似物将暴露于脂质体的外部环境并且因此容易产生相互作用，例如： 与免疫细胞产生相互作用。在一个实施方式中，甘露糖基化脂质体包含单糖基化脂质。 在具体的实施方式中，该单糖基化脂质为ManDOG脂质(参见，Ponpipom,M.M.等， J.Med.Chem.1981,24,1388；和Espuelas等，Bioorg Med Chem Lett.2003年8月4 日；13(15):2557-60，其内容在此全文引入作为参考，用于所有目的)。图3提供了 ManDOG脂质的结构。在另一个实施方式中，甘露糖基化脂质体包括四甘露糖基-3-L- 赖氨酸-二油酰基甘油(Espuelas等，同上)。甘露糖衍生物和类似物的非限定性实例 包括1-脱甘露糖野尻霉素、甲基-a-吡喃甘露糖苷、2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)、2-脱氧 -2-氟代-甘露糖(2-FM)以及2-脱氧-2-氯代-甘露糖(2-CM)，任何上述物质可缀合 到脂质。

在某些实施方式中，至少0.01％的包括甘露糖基化脂质体的脂质将缀合到至少一 个甘露糖残基。在另一个实施方式中，至少0.1％的包括甘露糖基化脂质体的脂质将 缀合到至少一个甘露糖残基。在另一个实施方式中，至少1％的包括甘露糖基化脂质 体的脂质将缀合到至少一个甘露糖残基缀合。在其它的实施方式中，至少0.01％、 0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、 0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、 9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的包括甘露糖基化脂质体的脂质将缀合 到至少一个甘露糖残基。

正如本文所使用的，术语“脂质”指的是能在水环境中形成单分子层或双分子层 结构的疏水或两性分子，例如：胶束或脂质体。脂质包括但不限于，脂肪、蜡、固醇、 脂溶性维生素、甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯以及磷脂。用于形成纳米颗粒的脂质， 例如脂质体和胶束，可进一步被改性或缀合到靶向官能基。可缀合到脂质的靶向官能 基的非限制性实例包括：糖基(例如：甘露糖或含有一个或多个甘露糖残基的碳水化 合物)、肽(例如：细胞受体的配体)、多肽(例如：抗体或其功能片段)以及核酸(例 如：适配体或)。

正如本文所使用的，术语“胆固醇”指的是天然存在的具有四个稠合环的固醇类 酒精(固醇)，及其具有长链状脂肪酸的酯类和类似物，它们具有调节膜流动性的能 力。胆固醇和胆固醇酯是血浆脂蛋白和动物细胞的外细胞膜的组成部分，且具有调节 膜流动性的能力。具有调节膜流动性的能力的胆固醇类似物在本领域中是已知的(参 见，例如，Gimpl,G.等(1997)Biochemistry 36:10959-10974)并且包括，例如，5-胆 甾烯、5-孕烯-3β-醇-20-酮、4-胆甾烯-3-酮和5-胆甾烯-3-酮。胆固醇和胆固醇类似物 是常见的脂质体组成部分，其可赋予形成胶束或脂质体的脂质单分子层或双分子层额 外的流动性。

正如本文所使用的，术语“链接的”和“缀合的”可互换使用并指的是两个官能 基之间的共价或非共价的关联，例如：在治疗性药剂和载体或靶向官能基之间。两个 官能基之间形成的链接，尽管本质上不需要共价，但是可以帮助维系官能基之间的关 联。用于关联两个官能基的链接的非限制性实例，例如MBP肽和靶向官能基，包含： 共价相互作用(即，共价化学键既可以直接在第一官能基和第二官能基之间形成又可 以通过链接基团分子形成)；离子相互作用(例如：离子键既可以直接在第一官能基 和第二官能基之间形成又可以通过链接基团分子形成)；静电相互作用(例如：两个 相反电荷的吸引)；疏水相互作用；通过范德华力结合在一起的相互作用；以及通过 物理包埋结合在一起的相互作用(例如：将载物分子包封或嵌入纳米颗粒中)。在一 个实施方式中，包封于载体中(例如：脂质体)的载物分子(例如：MBP肽)链接 到系留于载体外部的靶向官能基(例如：甘露糖残基)。

正如本文所使用的，术语“嵌入”指的是关于载体的载物分子的定位，该载物分 子位于载体结构的基质中。例如，当肽或其一部分位于脂质双分子层(脂质体)或单 分子层(胶束)中时，肽载物被称为被嵌入脂质体的载体或胶束载体。嵌入载体中的 载物分子可与载体基质(例如：聚合物外壳)或载体基质(例如：存在于脂质体的脂 质双分子层中的脂质)的子成分共价或非共价相关联，例如：通过共价键、离子键、 静电相互作用、疏水相互作用或物理包埋。

正如本文所使用的，术语“包封于”指的是关于载体的载物分子的定位，该载物 分子附着或包含于载体结构的内部。例如，当肽位于脂质双分子层中时，肽载物被称 为被包封于脂质体的载体，进而将外部环境与脂质体隔离。包封于载体的载物分子可 与载体(例如：聚合物外壳)或载体基质(例如：存在于脂质体的脂质双分子层中的 脂质)的子成分共价或非共价相关联，例如：通过共价键、离子键、静电相互作用、 疏水相互作用或物理包埋。

在某些实施方式中，脂质体或胶束载体内部将包括水环境。相应地，亲水性载物， 例如：肽或核酸，可部分或完全地在载体内部溶为溶剂。在其它的实施方式中，脂质 体或胶束载体内部可包括无水环境，例如：可由极性溶剂组成。相应地，疏水载物， 例如：非极性小分子，可部分或全部在载体内部溶为溶剂。

正如本文所使用的，术语“系留于”指的是关于载体的载物分子的定位，该载物 分子在一点或多点上链接到载物结构。可共价(例如：通过化学键)和非共价(例如： 通过核酸分子杂交)地完成对载物分子的系留。载物分子可被系留于载体(例如：聚 合物外壳)的外部或内部或载体基质(例如：存在于脂质体的脂质双分子层中的脂质) 的子成分。另外，在附着点上系留于载体结构的载物分子可自由地在空间中移动(例 如：另外，通过载体的外部或内部的环境使其溶为溶剂)。被系留于载体上的载物分 子可共价或非共价地与载体(例如：聚合物外壳)或载体基质(存在于脂质体的脂质 双分子层中的脂质)的子成分相关联，例如：通过共价键、离子键、静电相互作用或 疏水相互作用。

正如本文所使用的，术语“适配子”、和“核酸配体”可互换 使用并指的是非天然存在的寡核苷酸(通常15-250个核苷酸的长度)，其特异地结合 到特定目标。适配子是含有特异的二级结构的核酸，其赋予目标分子(例如：细胞表 面标记或受体)特异性。适配子可进一步包括特异的三级结构，以及可能的四级结构， 这些结构进一步有助于核酸以及目标分子之间的亲和性。当存在于适当的三维结构中 时，适配子特异地结合到特定目标。适配子包含天然核酸序列(例如：dA、dT、dC、 dG、rA、rU、rC和rG)，以及非自然核酸(例如：dU、dI、rT、rI)和改性的核酸。 是与L-核酸(而非天然存在的D-核酸)形成的适配子。适配子和 可包含L-核酸和D-核酸的混合物。

正如本文所使用的，术语“抗体”指的是多肽，其与特定抗原免疫反应。正如本 文所使用的，术语“免疫球蛋白”包含各种同型的完整分子以及具有抗原结合能力的 片段，例如：Fab'、F(ab')2、Fab、Fv以及rIgG。参见e.g.,Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.)；Kuby,J.,Immunology,3^rd Ed.,W.H. Freeman&Co.,New York(1998)，其内容在此全文引入作为参考，用于所有目的。该 术语同样包含重组单链Fv片段(scFv)。该术语进一步包含二价或双特异的分子、双 体、三体和四体。二价或双特异的分子描述于：例如，Kostelny等(1992)J.Immunol. 148:1547；Pack and Pluckthun(1992)Biochemistry 31:1579；Hollinger等,1993,Proc Natl Acad Sci U S A.1993年7月15日；90(14):6444-8；Gruber等,(1994)J.Immunol.5368； Zhu等,(1997)Protein Sci 6:781；Hu等,(1996)Cancer Res.56:3055，其内容在此全文引 入作为参考，用于所有目的。该术语“抗体”同样包含，例如，人类抗体、人源化抗 体以及嵌合抗体。

“嵌合抗体”是免疫球蛋白分子，其中，(a)恒定区或其一部分被改变、替换或 交换，以便抗原结合点(可变区)链接到不同的或已改变的类别、效应子功能和/或 种类的恒定区，或完全不同的分子，其赋予嵌合抗体新的属性，例如：酶、毒素、激 素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其一部分被改变、替换或交换，可变区具 有不同的或改变的抗原特异性。

“人源化抗体”是含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白分子。人 源化抗体包含人类免疫球蛋白(接受者抗体)，其中，来自接受者的互补决定区(CDR) 的残基被来自非人类物种(供应者抗体)，例如：具有理想的特异性、亲和性和能力 的小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替换。在一些实例中，人类免疫球蛋白Fv框架的残 基通过相应的非人类残基而替换。人源化抗体也可包括即没有发现于接受者的抗体中 又没有发现于输入的CDR或者框架序列中的残基。一般地，人源化抗体大体上包括 至少一个，以及通常两个可变域，其中，全部或大体上全部CDR区域与非人类免疫 球蛋白的CDR区域相对应，并且全部或大体上全部的框架(FR)区是人类免疫球蛋 白共有序列的框架。优选地，该人源化抗体还包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)， 通常为人类免疫球蛋白的恒定区的一部分(Jones等,Nature 321:522-525(1986)； Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596 (1992)，其内容在此全文引入作为参考，用于所有目的)。通过Winter以及其合作者 的方法可以本质上实行人源化(Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332:323-327(1988)；以及Verhoeyen等,Science 239:1534-1536(1988)，其内容 在此全文引入作为参考，用于所有目的)，该方法通过啮齿动物CDRs或CDR序列取 代相应的人类抗体序列。相应地，这种人源化抗体为嵌合抗体(U.S.Pat.No.4,816,567， 其内容在此全文引入作为参考，用于所有目的)，其中大体上少于完整的人类可变域 已通过来自非人类物种的相应序列被取代。

正如本文所使用的，术语“特异地结合”指的是相比非靶向分子，结合到具有至 少两倍以上的亲和力的特定目标(例如：细胞表面标记或受体)的分子(例如：靶向 官能基)。在某些实施例中，相比非靶向分子，分子特异地结合具有3倍、4倍、5 倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5000 倍、10000倍或以上的亲和力的目标。

正如本文所使用的，术语“免疫细胞”指的是具有造血源且对于免疫反应起作用 的细胞。免疫细胞包含淋巴球，例如：B细胞和T细胞；天然杀伤细胞；骨髓细胞， 例如：单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性细胞、肥大细胞、嗜碱性细胞以及粒细胞。

正如本文所使用的，术语“B细胞”指的是产生于大多数哺乳动物骨髓中的淋巴 球，其对于体液免疫系统起作用。在多个进展阶段，B细胞指的是：祖(或前-后)B 细胞；早期祖(或前-前)B细胞；晚期祖(或前-前)B细胞；大型前B细胞；小型 前B细胞；未成熟B细胞；以及成熟的B细胞，其中每一个都包含于术语B细胞的 概念内。可用于区分B细胞和其它淋巴球(例如：T细胞)的表型细胞表面标记包含： 主要组织相容性复合物(MHC)II级分子、CD19以及CD21。该术语“B细胞”包 含血浆B细胞、记忆B细胞、B-1细胞、B-2细胞、边缘区B细胞以及滤泡B细胞。

正如本文所使用的，术语“抗原递呈细胞”和“APC”可互换使用并且指的是专 门的抗原递呈细胞(例如：B淋巴球、单核细胞、树形细胞、朗格尔汉斯细胞)，以 及其它抗原递呈细胞(例如：角质细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、纤维母细胞以及 少突细胞)。

正如本文所使用的，术语“细胞表面标记”、“细胞表面受体”以及“细胞表面分 子”指的是存在于细胞表面的抗原结构。该细胞表面抗原可以为，但不限于，细胞特 异性抗原、免疫细胞特异性抗原、B细胞抗原、抗原递呈细胞特异性抗原、淋巴球特 异性抗原、与多发性硬化相关联的抗原、受体(例如：生长因子受体)、表面表位、 通过特异性免疫效应器细胞识别的抗原，例如：T细胞，以及通过非特异性免疫效应 器细胞识别的抗原，例如：巨噬细胞或天然杀伤细胞。“细胞表面抗原”的实例包含 但不限于，以下细胞的表型标记：NK细胞(例如：CD16和CD56)；助性T细胞(例 如：TCRαβ、CD3和CD4)；细胞毒性T细胞(例如：TCRαβ、CD3和CD8)；γδT 细胞(例如：TCRγδ和CD3)；以及B细胞(MHC II级、CD19和CD21)。细胞表 面分子也可包含存在于相关细胞表面的碳水化合物、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白或任何 其他的分子。

正如本文所使用的，术语“髓磷脂碱性蛋白”和“MBP”可互换使用并且指的是 通过人类髓磷脂碱性蛋白基因编码的蛋白质(MBP；NCBI Gene ID:4155)。在体内， MBP蛋白质的多个亚型是由可选择的剪接作用引起的(有关综述，参见Harauz等, Biochemistry,(2009)9月1日；48(34):8094-104，其内容在此全文引入作为参考，用于 所有目的)，每一个都包含于术语“髓磷脂碱性蛋白”的概念内。图14提供七个具有 代表性的MBP序列比对。正如本文所使用的，MBP肽的氨基酸编号指的是发现于成 熟的髓鞘中的MBP的主要亚型的氨基酸序列(剪接亚型5：UniProt ID No.:P02686-5)， 由171个氨基酸组成的18.5kDa蛋白质(SEQ ID NO:17)。

如本文所用，术语“多发性硬化”和“MS”可互换使用，并且是指一种炎性疾 病，其中脑和脊髓神经轴突周围的脂肪髓鞘遭到破坏和/或损耗，导致脱髓鞘和疤痕， 以及迹象和症状的广谱(综述参见，Compston和Coles，Lancet.2008年10月25日； 372(9648)：1502-1517，其内容在此全文引入作为参考，用于所有目的)。已经分类 了MS的几种亚型，包括复发缓解型(RRMS)、继发进展型(SPMS)、原发进展型 (PPMS)和进行性复发(PRMS)，其中每一个亚型包含在术语多发性硬化中。

如本文所用，术语“患者”或“受试对象”可以互换使用，并且是指对需要或寻 求治疗的个体。例如，受试对象可能已被确诊患有或具有发展成多发性硬化(MS) 或其亚型的风险。多发性硬化患者可以指已诊断患有MS且正在接受MS治疗的个体、 以前接受过MS治疗的个体或从未接受过MS治疗的个体、具有MS复发风险的个体 或具有MS风险的个体(例如，具有MS遗传倾向的个体)。

如本文所用，术语多发性硬化的“疗法”和“治疗”可互换使用，并且是指MS 所引起的不良的生理或心理状况的任何的缓解或改善。例如，以下状况的严重程度或 频率的降低：感觉迟钝、感觉异常、肌无力、阵挛、肌肉痉挛、麻痹、运动失调、构 音障碍、吞咽困难、眼球震颤、视神经炎(如幻视或复视)、疲劳、急性或慢性疼痛、 排尿和排便困难等、认知障碍、抑郁症、Uhthoff症以及Lhermitte症。在一个实施方 式中，扩展残疾状态量表(EDSS)可以用来作为衡量MS患者病症进展和严重程度 的指标(参见，Kurtzke JF，Neurology 1983；33：1444-1452，其内容在此全文引入 作为参考，用于所有目的)。因此，在一个实施方式中，疗法是指改善患者EDSS的 行为。

如本文所用，术语多发性硬化的“预防”和“预防性治疗”可以互换使用，并且 是指减少MS临床症状的风险、严重程度或发病的治疗性处理。预防可以是局部的或 整体的。对于具有患有MS或引发MS复发风险的患者而言，局部预防可能导致疾病 状态或症状的延迟发作或延迟进展。虽然未鉴定严格的MS的致病遗传组分，但已经 鉴定了与多发性硬化风险增加关联的几个遗传因素，包括但不限于，Hafler DA等鉴 定的SNP(N Engl J Med.2007年8月30；357(9)：851-62，其内容在此全文引入作 为参考，用于所有目的)，例如rs3135388(A等位基因；HLA-DRA基因)、rs12722489 (C等位基因；IL2RA基因)、rs2104286(T等位基因；IL2RA基因)、rs6897932(C 等位基因；IL7R基因)、rs6498169(G等位基因；KIAA0350)、rs6604026(C等位 基因；RPL5)、rs10984447(A等位基因；DBC1基因)、rs12044852(C等位基因； CD58基因)、rs7577363(A等位基因；ALK基因)、rs7536563(A等位基因；FAM69A 基因)、rs11164838(C等位基因；FAM69A基因)、rs10975200(G等位基因；ANKRD15 基因)、rs10735781(G等位基因；EVI5基因)、rs6680578(T等位基因；EVI5基因)、 rs4763655(A等位基因；KLRB1基因)、rs12487066(T等位基因；CBLB基因)和 rs1321172(C等位基因；PDE4B基因)。

如本文所用，术语“剂量”和“用量”可以互换使用并且是指在单一时间点活性 组分的施用量。在本发明的上下文中，剂量可以是指受试对象MBP肽的施用量。用 量还可以是指受试对象MBP肽载体制剂的施用量，例如，一种或组合MBP肽的脂 质体制剂。患者施用量的变化取决于许多因素，包括：施用频率、病况的严重程度(如 多发性硬化)、病况的子类别(如复发缓解型MS、继发进展型MS、原发进展型MS 和进展复发型MS)、病况的阶段(如初始发病、复发和缓解)、受试对象的体型和耐 受性、采用的给药途径、副作用风险、不良药物相互作用的风险以及对前期治疗的反 应，其中每一个因素都可以由熟练的内科医师很容易地确定。术语“剂型”是指药学 试剂的特定形式，例如，用于皮下给药的液体制剂或用于经储库控制释放的凝胶制剂。

如本文所用，术语“治疗有效剂量”和“治疗有效量”可以互换使用，并且是指 产生施用效果的剂量。确切的剂量将取决于治疗的目的，而且可由本领域技术人员通 过已知的技术确定(参见，例如，Augsburger&Hoag，Pharmaceutical Dosage Forms (第1-3卷，第3版，2008)；Lloyd，The Art，Science and Technology of Pharmaceutical  Compounding(第3版，2008)；Pickar，Dosage Calculations(第8版，2007)；以 及Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，2005，Gennaro，Ed.， Lippincott，Williams&Wilkins)。

如本文所用，术语“药物组合物”是指适于受试对象施用的制剂，该制剂含有治 疗剂和以下任选的一种或多种剂型：载体、靶向官能基、缓冲剂、盐、防腐剂(如抗 氧化剂或抗微生物剂)、渗透剂、膨胀剂和适合于通过特定给药途径递送治疗剂的任 何其它赋形剂或传递体。

如本文所用，术语“对照”是指作为参考与试验结果对比的样品、水平或表型结 果，例如，通过特定治疗实现的治疗效果。术语对照既包括阳性对照(如，给定治疗 的预期值或结果)，也包括阴性对照(如，没有治疗情况下的预期值或结果)。

阳性对照可以指通过施用治疗剂得到的结果，已知该治疗剂能对疾病状态或症状 产生有益的效果。例如，通过对诊断患有MS的受试对象或MS动物模型施用醋酸格 拉替雷得到的结果，可以用作实验性MS疗法的阳性对照。在这个意义上，与施用醋 酸格拉替雷得到的结果相比，产生类似或更好结果的实验性疗法，将被认为是MS治 疗的良好选择。

阴性对照可以是指在没有对疾病状态或症状治疗的情况下得出的结果。例如，对 诊断患有MS的受试对象或MS动物模型施用水或空载体，可以用作实验性MS疗法 的阴性对照。在这个意义上，产生与阴性对照类似结果的实验性疗法，将不会被认为 是MS治疗的良好选择。然而，与阴性对照的结果相比，产生更好结果的实验性治疗， 将被认为是MS治疗的良好选择。

如本文所用，术语“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”是可以互换使用的， 并且是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有特别 说明，其包括含有天然存在核苷酸的已知类似物的多核苷酸，该类似物可以以与天然 存在的核苷酸类似的方式起作用。可以理解的是，当核酸分子由DNA序列表示时， 它也包括具有相应RNA序列的RNA分子，其中，“U”(尿嘧啶核苷)取代“T”(胸 腺嘧啶核苷)。

如本文所用，术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，并且是指四个或四 个以上氨基酸残基的聚合物。术语适用于氨基酸聚合物，该氨基酸聚合物中的一个或 多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的人工化学类似物，也适用于天然存在氨基酸 聚合物。术语“重组肽”是指通过核苷酸序列表达而产生的肽，所述核苷酸序列编码 重组DNA分子肽的氨基酸序列。

如本文所用，术语“合成肽”是指通过化学方法制备的肽，例如，液相或固相肽 合成。合成肽包括氨基酸聚合物，该氨基酸聚合物中的一个或多个氨基酸残基是相应 天然存在的氨基酸的人工化学类似物，也包括天然存在的氨基酸聚合物。

如本文所用，术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和非天然的氨基酸，包括氨 基酸类似物和氨基酸模拟物，两者以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用。天然存 在的氨基酸包括遗传密码编码的氨基酸以及后来改性的氨基酸，如羟脯氨酸、_γ-羧 基谷氨酸、O-磷酸丝氨酸、5-羟色氨酸、羊毛硫氨酸。天然存在的氨基酸可包括，例 如，D-氨基酸和L-氨基酸。本文所使用的氨基酸也可以包括非天然的氨基酸。氨基 酸类似物是指基本化学结构与天然存在的氨基酸相同的化合物，即结合到以下基团的 任意碳，该基团包括：氢、羧基、氨基和R基，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸 亚砜或甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有改性的R基团(如正亮氨酸)或改性的肽 骨架，但保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指结构与氨 基酸的一般化学结构不同，但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化合物。本 文中的氨基酸可由公知的氨基酸的三个字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会 所推荐的单字母符号来表示。

至于氨基酸序列，本领域的普通技术人员将认识到，核酸或肽序列的个体取代、 删除或添加以改变、添加或删除编码序列中单个氨基酸或较小比例的氨基酸，是“保 守改性的变体”，其中，改变导致以化学上相似的氨基酸取代该氨基酸。提供功能相 似氨基酸的保守取代表在本领域中是众所周知的。提供功能相似氨基酸的保守取代表 在本领域中是众所周知的。此类保守改性变体除上述之外，不排除本发明的多态变体、 种间同系物和等位基因。

以下八个基团中的每一个包含彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸 (G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精 氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸 (V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)； 以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。参见，如Creighton，蛋白质(1984)。

如本文所用，当使用涉及两个或多个多核苷酸序列或两个或多个多肽序列时，术 语“相同的”和“同一性”是指按最大对应性排列时相同序列的残基。当序列同一性 的比例是参照肽而使用的，可认识到，一个或多个不同的残基位置可通过保守氨基酸 的取代而不同，其中，第一氨基酸残基由具有相似化学性质如相似的电荷、疏水性或 亲水性的另一个氨基酸残基所取代，因此，基本上不改变肽的功能特性。当肽序列在 保守取代方面是不同的，百分序列同一性可以向上调整以校正取代的保守性。可使用 公知的方法完成此类调整，例如，对保守取代作为部分错配而不是整体错配进行打分， 从而增加百分比序列同一性。因此，例如，如果将相同氨基酸的分数定为1并且非保 守取代的分数定为零，则保守取代的分数介于零和1之间。可使用任意公知的算法计 算保守取代的得分(参见，如，Meyers和Miller，Comp.Appl.Biol.Sci.4:11-17，1988； Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2:482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol. 48:443，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 85:2444(1988)；Higgins 和Sharp，Gene 73:237-244，1988；Higgins和Sharp，CABIOS 5:151-153；1989；Corpet 等，Nucl.Acids Res.16:10881-10890，1988；Huang等，Comp.Appl.Biol.Sci.8:155-165， 1992；Pearson等，Meth.Mol.Biol.，24:307-331，1994)。可通过简单的目视检查和 序列的人工排列来进行排列。

应当认识到，个体取代、删除或添加以改变、添加或删除肽序列中单个氨基酸或 较小比例的氨基酸(例如小于15％、小于10％或小于5％)，可认为是保守改性的变 型，只要改变导致了化学上相似的氨基酸取代了该氨基酸。

提供功能相似氨基酸的保守性氨基酸取代是本领域中公知的技术。取决于具体氨 基酸的功能，即催化重要性、结构重要性、空间重要性，氨基酸的不同分组可认为是 彼此保守的取代。表1提供了氨基酸的分组，该分组被认为是基于氨基酸的电荷和极 性、氨基酸的疏水性、氨基酸的表面暴露/结构性质以及氨基酸的二级结构倾向的保 守取代。

表1.基于蛋白残基功能的保守氨基酸取代的分组。

如果氨基酸序列或核苷酸序列彼此共享至少60％的序列同一性，或与给定对比 窗口的参考序列共享至少60％的序列同一性，则两个或多个氨基酸序列或两个或多 个核苷酸序列被认为是“基本上相同的”。因此，基本上相同的序列包括具有以下特 征的序列，例如，至少60％的序列同一性、至少65％的序列同一性、至少70％的序 列同一性、至少75％的序列同源性、至少80％的序列同源性、至少85％的序列同一 性、至少90％的序列同一性、至少95％的序列同一性或至少99％的序列同一性。在 某些实施方式中，基本上相同的序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65 ％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77 ％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89 ％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一 性。在一个实施方式中，序列共享60-95％的序列同一性。在另一个实施方式中，序 列共享65-90％的序列同一性。在另一个实施方式中，所述序列共享70-85％的序列 同一性。在其它实施方式中，序列共享65-95％的序列同一性、70-95％的序列同一性、 75-95％的序列同一性、80-95％的序列同一性、85-95％的序列同一性或90-95％的序 列同一性。

在某些实施方式中，如果两个多肽共享有效提供治疗效果的相同或几乎相同的核 心肽序列，则它们会被认为是基本相同。例如，不管位于上游的额外氨基酸(即核心 序列的N端)或下游(即核心序列的C端)是否存在，第一核心肽序列可提供治疗 效果，包含第二核心肽序列的多肽可被认为是大致相同的，其中第二核心肽序列与第 一核心肽序列共享至少80％的同一性。甚至当整个多肽序列与参考序列不具有至少 80％的同一性时也是如此。例如，如果(1)P₁和P₂具有至少80％的同一性，并且(2) P₁和P₂足以向需要的受试对象提供治疗效果，具有氨基酸序列(R¹)_a-P₁-(R²)_b和 (R³)_c-P₂-(R⁴)_d的两个治疗性多肽可认为是基本相同的，与R₁、R₂、R₃和R₄的氨基酸 序列无关。

在某些实施方式中，基本相同的核心肽序列将共享至少60％、61％、62％、63％、 64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、 77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。 在具体的实施方式中，核心肽序列将共享至少85％的序列同一性(即85-100％的同 一性)。在另一个具体实施方式中，核心肽序列将共享至少90％的序列同一性(即 90-100％的同一性)。在另一个具体实施方式中，核心肽序列将共享至少95％的序列同 一性(即95-100％的同一性)。在另一个具体实施方式中，核心肽序列将共享100％的 序列同一性，与两个对比多肽的整体序列同一性无关。在一个实施方式中，核心肽序 列共享60-95％的序列同一性。在另一个实施方式中，核心肽序列共享65-90％的序 列同一性。在另一个实施方式中，核心肽序列共享70-85％的序列同一性。在其它实 施方式中，核心肽序列共享65-95％的序列同一性、70-95％的序列同一性、75-95％ 的序列同一性、80-95％的序列同一性、85-95％的序列同一性或90-95％的序列同一 性。

如本文所用，术语“对比窗口”是指氨基酸或核苷酸的连续序列片段，在对比窗 口上，对两个多肽或多核苷酸序列进行对比以确定序列同一性或相似性。相对于治疗 性肽，对比窗口可以是大约5-50个氨基酸的长度。在一个实施方式中，对比窗口可 以是大约5-25个氨基酸的长度。在另一个实施方式中，对比窗口可以是大约10-20 个氨基酸的长度。根据各种因素，如对比多肽的长度，对比窗口可以是以下数量氨基 酸的长度，例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多。在特定实施方式中，对比 窗口是参考氨基酸序列的全长。

序列的排列可通过下列方法进行，例如，局部同源性算法，Smith和Waterman (1981)Adv.Appl.Math.2:482；同源性排列算法，Needleman和Wunsch(1970)J. Mol.Biol.48：443；寻求相似性方法，Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci. (U.S.A.)85:2444；这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics Software Package  Release 7.0中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group， 575Science Dr.，Madison，Wis.)；或检查，且由所选的各种方法产生最佳的排列(即 在对比窗口中产生最高百分比的同源性)。BLAST算法非常适合于确定百分序列同一 性和序列相似性(Altschul等，J Mol.215：403-410，(1990)，其公开在此全文引入 作为参考，用于所有目的)。公众可通过国家生物技术信息中心(NCBI)网站获取结 合BLAST算法的数个软件程序。这些程序包括blastp、blastn、blastx、tblastn、tblastx 和PSI-blast软件程序。

III.MBP肽

A.导言

在一个方面，本发明提供了用于治疗或预防多发性硬化(MS)复发的髓鞘碱性 蛋白(MBP)肽类。如图1C所示，在MS EAE诱导的DA大鼠模型中鉴定了MBP 的两个免疫显性区，这两个免疫显性区与对诊断患有复发缓解型多发性硬化(RRMS) 的人类患者中的MBP：MBP(43-64)和MBP(115-170)的免疫应答有关。据发现， 在EAE诱导的DA大鼠模型中产生了这些区域的多克隆IgG自身抗体(图2)，表明 这些区域包含对MS的病理至关重要的B细胞表位。因此，包括这些区域的一部分或 全部的肽可用于MS的治疗或预防。在具体实施方式中，MBP肽包含B细胞表位。

在本发明的一个方面中，提供了用于治疗MS的肽类，该肽类包括与鉴定的MBP 免疫显性区相同或基本相同的氨基酸序列。在具体实施方式中，提供了用于治疗MS 的MBP肽，MBP肽包括MBP(43-64)(SEQ ID NO：11)或MBP(115-170)(SEQ ID NO：12)的至少6个连续氨基酸。通常，MBP肽在长度上包括6-100个氨基酸。 在一个实施方式中，MBP肽在长度上包括6-50个氨基酸。在另一个实施方式中，MBP 肽在长度上包括6-25个氨基酸。在其它实施方式中，MBP肽包括大约6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个氨基酸。 在一个具体实施方式中，MBP肽在长度上包括6-40个氨基酸。

在一个实施方式中，MBP肽包含MBP(43-64)(SEQ ID NO：11)或MBP(115-170) (SEQ ID NO：12)的至少10个连续氨基酸。在另一个实施方式中，MBP肽包含 MBP(43-64)(SEQ ID NO：11)或MBP(115-170)(SEQ ID NO：12)的至少15 个连续氨基酸。在其他实施方式中，MBP肽包含MBP(43-64)(SEQ ID NO：11) 或MBP(115-170)(SEQ ID NO：12)的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21或22个连续氨基酸。在其它实施方式中，MBP肽包含MBP (115-170)(SEQ ID NO：12)的至少23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40或更多个连续氨基酸。在一个实施方式中，MBP 肽链接到载体，该载体可以包括或不包括靶向官能基。在具体实施方式中，所述载体 是脂质体。在更具体的实施方式中，脂质体是一种甘露糖基化脂质体。

在另一个方面，MBP肽包含MBP(43-64)(SEQ ID NO：11)或MBP(115-170) (SEQ ID NO：12)的6-25个连续氨基酸。在另一个实施方式中，MBP肽包含MBP (43-64)(SEQ ID NO：11)或MBP(115-170)(SEQ ID NO：12)的10-20个连续 氨基酸。在另一个实施方式中，MBP肽包含MBP(115-170)(SEQ ID NO：12)的 6-40、或6-35、或6-30、或6-20个连续氨基酸。在其它实施方式中，MBP肽包含 MBP(43-64)(SEQ ID NO：11)或MBP(115-170)(SEQ ID NO：12)的6-20、或 6-18、或6-16、或6-14、或6-12、或6-10、或6-8个连续氨基酸。在一个实施方式中， MBP肽链接到载体。在具体实施方式中，载体是脂质体。在一个更具体的实施方式 中，脂质体是一种甘露糖基化脂质体。

在具体实施方式中，MBP肽包含以下序列：GGDRGAPKRGSGKDSHH(MBP (46-62)；SEQ ID NO：1)。在一个实施方式中，MBP(46-62)链接到载体。在具 体实施方式中，所述载体是脂质体。在更具体的实施方式中，脂质体是甘露糖基化脂 质体。

在另一个具体实施方式中，MBP肽包含以下序列：GFGYGGRASDYKSAHK (MBP(124-139)，SEQ ID NO：2)。在一个实施方式中，MBP(124-139)链接到 载体。在一个具体实施方式中，所述载体是脂质体。在一个更具体的实施方式中，脂 质体是甘露糖基化脂质体。

在另一个具体实施方式中，MBP肽包含以下序列： QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR(MBP(147-170)，SEQ ID NO：3)。在一个实 施方式中，MBP(147-170)链接到载体。在一个具体实施方式中，所述载体是脂质 体。在一个更具体的实施方式中，脂质体是甘露糖基化脂质体。

B.氨基酸取代

本文提供的MBP肽可进一步包含相对于野生型MBP序列(SEQ ID NO：17) 的一个或多个氨基酸取代。在一个实施方式中，氨基酸取代是保守性的氨基酸取代。 例如，具有相似疏水性(例如，亮氨酸和异亮氨酸)的氨基酸可以很容易的相互取代。 表1提供了氨基酸的分组，该分组被认为是基于氨基酸的电荷和极性、氨基酸的疏水 性、氨基酸的表面暴露/结构性质以及氨基酸的二级结构倾向的保守取代。在另一个 实施方式中，氨基酸取代不是保守性的氨基酸取代。

在一个实施方式中，MBP肽包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列与MBP(43-64) (SEQ ID NO：11)或MBP(115-170)(SEQ ID NO：12)的至少6个连续氨基酸肽 序列具有至少80％序列同一性。在另一个实施方式中，MBP肽包含一种氨基酸序列， 该氨基酸序列与MBP(43-64)(SEQ ID NO：11)或MBP(115-170)(SEQ ID NO： 12)的至少6个连续氨基酸肽序列具有至少85％的序列同一性。在另一个实施方式 中，MBP肽包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列与MBP(43-64)(SEQ ID NO：11) 或MBP(115-170)(SEQ ID NO：12)的至少6个连续氨基酸肽序列具有至少90％ 的序列同一性。在另一个实施方式中，MBP肽包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列 与MBP(43-64)(SEQ ID NO：11)或MBP(115-170)(SEQ ID NO：12)的至少6 个连续氨基酸肽序列具有至少95％的序列同一性。在其它实施方式中，MBP肽包含一 种氨基酸序列，该氨基酸序列与MBP(43-64)(SEQ ID NO：11)或MBP(115-170) (SEQ ID NO：12)的至少6个连续氨基酸肽序列具有至少60％、61％、62％、63％、 64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、 77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

在具体实施方式中，MBP肽包含与SEQ ID NO：1具有至少80％序列同一性的 氨基酸序列。在另一个实施方式中，MBP肽包含与SEQ ID NO：1具有至少85％序 列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，MBP肽包含与SEQ ID NO：1具有 至少90％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，MBP肽包含与SEQ ID  NO：1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在其它实施方式中，MBP肽包含与 SEQ ID NO：1具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、 69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在具体实施方式中，MBP肽包含与SEQ ID NO：2具有至少80％序列同一性的 氨基酸序列。在另一个实施方式中，MBP肽包含与SEQ ID NO：2具有至少85％序 列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，MBP肽包含与SEQ ID NO：2具有 至少90％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，MBP肽包含与SEQ ID NO：2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在其它实施方式中，MBP肽包含与 SEQ ID NO：2具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、 69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在具体实施方式中，MBP肽包含与SEQ ID NO：3具有至少80％序列同一性的 氨基酸序列。在另一个实施方式中，MBP肽包含与SEQ ID NO：3具有至少85％序 列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，MBP肽包含与SEQ ID NO：3具有 至少90％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，MBP肽包含与SEQ ID NO：3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在其它实施方式中，MBP肽包含与 SEQ ID NO：3具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、 69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

C.肽侧翼区

抗原递呈细胞(APC)，如B-细胞淋巴细胞、树突状细胞及巨噬细胞，通过内化、 处理以及呈递处理的外部抗原(例如病原感染应答)或本体抗原(例如自身免疫疾病) 以刺激免疫应答来达到刺激各种类型T细胞的目的。在不受理论束缚的情况下，因为 APC能够将较大的抗原内化并处理成较小的抗原肽，该抗原肽可由T-细胞机制识别， 本文所述包含MBP(43-64)或MBP(115-170)的至少6个连续氨基酸的MBP肽， 可在N-端和/或C-端上具有额外的氨基酸，即侧翼残基。

MBP侧翼残基可包括野生型MBP蛋白中存在的天然侧翼区(例如，氨基酸N- 端到MBP残基43和115和/或氨基酸C-端到MBP残基64和170)，或可选地包括外 源或随机的顺序。在一个实施方式中，N-端和/或C-端侧翼残基可以赋予MBP肽以 有利特性。例如，侧翼氨基酸残基可以具有以下功能：使肽类稳定；将肽类靶定到特 定的细胞内或细胞外位置；改善肽的载体负载特性；或提高或导向免疫细胞(如B 细胞或APC)中的抗原处理或抗原呈递。

在一个实施方式中，MBP肽还包含在肽N-端和/或C-端上的1-50个额外氨基酸。 在另一个实施方式中，MBP肽还包括在肽N-端和/或C-端上的1-25个额外氨基酸。 在另一个实施方式中，MBP肽还包括在肽N-端和/或C-端上的1-10个额外氨基酸。 在其它实施方式中，MBP肽还包括在肽N-端和/或C-端上的1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、 46、47、48、49、50或更多额外氨基酸。

在具体的实施方式中，含有序列：GGDRGAPKRGSGKDSHH(MBP(46-62)； SEQ ID NO：1)的MBP肽还包括在肽N-端和/或C-端的1-50个额外氨基酸。在另 一个实施方式中，MBP(46-62)肽还包括在肽N-端和/或C-端的1-25个额外氨基酸。 在另一个实施方式中，MBP(46-62)肽还包括在肽N-端和/或C-端的1-10个额外氨 基酸。在其它实施方式中，MBP(46-62)肽还包含在肽N-端和/或C-端的1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50或多个额外氨基酸。

在具体的实施方式中，含有序列：GFGYGGRASDYKSAHK(MBP(124-139)， SEQ ID NO：2)的MBP肽还包括肽N-端和/或C-端的1-50个额外氨基酸。在另一 个实施方式中，MBP(124-139)肽还包括在肽N-端和/或C-端的1-25个额外氨基酸。 在另一个实施方式中，MBP(124-139)肽还包括在肽N-端和/或C-端的1-10个额外 氨基酸。在其它实施方式中，MBP(124-139)肽还包含在N-端和/或C-端的1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50或多个额外氨基酸。

在具体的实施方式中，含有序列肽：QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR(MBP (147-170)，SEQ ID NO：3)的MBP肽还包括在肽N-端和/或C-端的1-50个额外氨 基酸。在另一个实施方式中，MBP(147-170)肽还包括在肽N-端和/或C-端的1-25 个额外氨基酸。在另一个实施方式中，MBP(147-170)肽还包括在肽N-端和/或C- 端的1-10个额外氨基酸。在其它实施方式中，MBP(147-170)肽还包括在肽N-端和 /或C-端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或多个额外氨基酸。

本文提供的MBP肽可以在以下方面进行说明，如核心肽序列(P_x)、可选的N- 端侧翼序列(Rⁿ)、和可选的C-端侧翼序列(R^c)。在某些实施方式中，在MBP肽 P_x、Rⁿ、和R^c部分中氨基酸总数小于250。在另一个实施方式中，氨基酸总数小于 100。在另一个实施方式中，氨基酸总数小于50。在其它实施方式中，氨基酸总数小 于250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、145、140、135、 130、125、120、115、110、105、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、 89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、 70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、 51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、 32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、 13、12、11、10、9、8或7。在一个实施方式中，氨基酸总数是6-250。在另一个实 施方式中，氨基酸总数是6-100。在另一个实施方式中，氨基酸总数是6-50。在其它 实施方式中，氨基酸总数是10-250、10-100、10-50、15-250、15-200、15-175、15-150、 15-125、15-100、15-90、15-80、15-75、15-70、15-65、15-60、15-55、15-50、15-45、 15-40、15-35、15-30、15-25或15-20。

在一个实施方式中，核心肽序列(P_x)具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列与 MBP(43-64)或MBP(115-170)的至少6个连续氨基酸相同或基本相同，优选MBP (46-62)、MBP(124-139)或MBP(147-170)的至少6个连续氨基酸。在具体实施 方式中，P_x具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：1-3其中之一具有至 少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的同一性。

在一个实施方式中，Rⁿ和R^c分别为1-250个氨基酸。在具体实施方式中，Rⁿ和 R^c的组合为1-250个氨基酸。在一个实施方式中，MBP肽具有N-端侧翼区(Rⁿ)和 C-端侧翼区(R^C)。在另一实施方式中，MBP肽具有N-端侧翼区(Rⁿ)，并不具有 C-端侧翼区(R^C)。在另一个实施方式中，MBP肽具有C-端侧翼区(R^C)，不具有 N-端侧翼区(Rⁿ)。

D.肽合成

本文所公开MBP肽可通过任意合适的方法合成，例如，通过固相合成，其包含 固相肽合成。常规合成肽的固相方法可以是以N-α-保护的氨基酸酸酐为起始物，N- α-保护的氨基酸酸酐制备成结晶形式或在溶液中新制得，以及用于在N-端添加连续 氨基酸。当添加每个残基时，用酸处理生长中的肽(在固体支持物上)以除去N-α- 保护基团，洗涤数次以除去残留的酸并且促进肽端在反应介质中的可达性。然后将肽 与活化N-保护的氨基酸对称酸酐反应，并对固体支持物进行洗涤。在每个添加残基 的步骤中，可重复氨基酸添加反应以完成总共两次或三次的独立添加反应，从而提高 反应的生长的肽分子百分比。通常情况下，1-2次反应循环用于添加前12个残基，且 2-3次反应循环用于添加剩余的残基。

在完成生长的肽链后，将保护的肽树脂用强酸处理，例如液态氢氟酸或三氟乙酸， 以从支持物中解封闭和释放肽。为制备酰胺肽，将肽从树脂上切割之后，选择合成中 所用树脂支持物以供给C-端酰胺。除去强酸后，可将肽萃取到1M乙酸溶液中，并 且冻干。通过凝胶过滤的初始分离可将肽隔离，以除去肽二聚体和较高分子量聚合物， 并且还可除去不需要的盐。部分纯化肽可通过制备型HPLC色谱进一步纯化，通过氨 基酸组成分析、质谱分析法以及分析型HPLC确定肽的纯度和同一性(例如在两个不 同的溶剂系统中)。

类似地，本文所公开的MBP肽可通过在合适的宿主细胞中表达以及从细胞培养 中纯化制备。在本领域中有许多已知的肽表达系统。合适的宿主菌株的实例包括

但不限于：真菌或酵母种，例如曲霉属、木霉属、酵母属、毕赤酵母属、假丝酵 母和汉逊酵母属；细菌种，如沙门氏菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、红球菌属、链 霉菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、甲基单胞菌属、甲基杆菌属、产碱杆菌属、集胞 藻属、鱼腥藻属、硫杆菌属、甲烷杆菌属、克雷伯氏菌属、伯克氏菌属、鞘脂单胞菌 属、短杆菌属、棒状杆菌属、分支杆菌属、节杆菌属、诺卡氏菌属、放线菌属和丛毛 单胞菌属；哺乳动物细胞，如人类细胞系、仓鼠细胞系和啮齿动物细胞系；以及昆虫 细胞系，如昆虫杆状病毒表达系统。

IV.MBP肽载体

A.导言

本发明的MBP肽链接到载体以供需要的受试对象施用。合适载体的选择将取决 于许多因素，如：采用的具体施用途径、待递送的肽用量、用量频率、前期治疗功效、 治疗疾病或症状的严重程度以及受试对象疾病的当前状况。

可将MBP肽载物以共价或非共价方式链接到载体上。例如，MBP肽可通过共价 键、离子键、静电相互作用、疏水性相互作用、范德华力、嵌入、束缚或载体物理包 埋与载体相关联。

在一个实施方式中，链接到MBP肽的载体是纳米颗粒。纳米颗粒的非限制性实 例包括：脂质体、胶束、嵌段共聚物胶束、聚合物囊泡、类脂质体囊泡、脂质包覆的 纳米泡、树形分子、金属颗粒(例如氧化铁颗粒或金颗粒)和二氧化硅颗粒。该肽载 物可以以封装、嵌入、表面负载或束缚的方式结合到纳米颗粒载体。

相比于单独施用治疗剂，使用纳米颗粒递送治疗剂具有几个优点。例如，纳米颗 粒可用于屏蔽其它不稳定的治疗剂(如天然肽或多核苷酸)对细胞内和/或细胞外的 损害。纳米颗粒还可以起到减少或消除治疗剂毒效的作用。因此，可通过纳米颗粒制 剂递送更高剂量的潜在有害或有毒的治疗剂。

纳米颗粒可链接到水溶性或高分子量的非免疫原性聚合物以提高脂质体的血清 半衰期(例如，参见，美国专利号5013556、5676971和6132763，其内容在此全文 引入作为参考，用于所有目的)。合适水溶性聚合物的非限制性实例包括：聚(亚烷 基二醇)，如聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇和丙二醇共聚物等、 聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙酰胺)、 聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、多糖、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚唑啉、 聚(N-丙烯酰基吗啉)、聚(环氧烷)聚合物、聚(马来酸)、聚(DL-丙氨酸)、多 糖，例如聚唾液酸或羧甲基纤维素、右旋糖酐、淀粉或淀粉衍生物，如羟乙基淀粉 (HES)、透明质酸和壳聚糖、聚(甲基)丙烯酸酯以及任意上述物质的组合。

在某些实施方式中，MBP肽载体进一步链接到靶向官能基。在其他实施方式中， 链接到MBP肽的载体是靶向官能基。在具体实施方式中，(1)相比于没有链接到靶 向官能基的MBP肽，靶向官能基增加了递送至细胞(例如，免疫细胞)的MBP肽； 和/或(2)相比于没有链接到靶向官能基的MBP肽，增加了摄取到细胞(例如，免 疫细胞)中的MBP肽。在具体实施方式中，靶向官能基特异性地结合到一类或一种 细胞，例如，包含特定细胞表面抗原的免疫细胞。

B.脂质体

在具体实施方式中，MBP肽载体是脂质体。使用脂质体递送治疗剂是本领域所 公知的技术(综述参见Chrai，R.Murari，和I.Ahmad.Liposomes(综述)。第二部分： Drug delivery systems.BioPharm.15(1):40，42–43，49(2002)，其内容在此全文引入作 为参考，用于所有目的)。脂质体组合物的实例包括美国专利号：4983397、6476068、 5834012、5756069、6387397、5534241、4789633、4925661、6153596、6057299、5648478、 6723338和6627218；美国专利申请公开号：2003/0224037、2004/0022842、 2001/0033860、2003/0072794、2003/0082228、2003/0212031、2003/0203865、 2004/0142025和2004/0071768；国际专利公开号：WO 00/74646、WO 96/13250和 WO 98/33481；Papahadjopolulos D.等(Proc Natl Acad Sci U.S.A.(1991)88: 11460-11464)，Allen和Martin(Semin Oncol(2004)31：5-15(增刊13))，和Weissig 等(Pharm.Res.(1998)15:1552-1556)，其内容在此全文引入作为参考，用于所有目 的。

在一些实施方式中，脂质体包含磷脂，例如，磷脂酰胆碱。磷脂可以是天然存在 的、半合成的或合成的。在一些实施方式中，磷脂是非天然存在的磷脂酰胆碱。在一 些实施方式中，所述磷脂是阳离子磷脂。在其他实施方式中，磷脂是阴离子磷脂。在 其它实施方式中，所述磷脂是中性磷脂。示例性的磷脂包括但不限于，磷脂酰胆碱 (PC)、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。

在一些实施方式中，磷脂是磷脂酰胆碱。磷脂酰胆碱的非限制性的实例包括：2,3- 二棕榈酰-sn-甘油基-l-酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷 脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、 蛋磷脂酰胆碱(EPC)以及氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)。

在一些实施方式中，脂质体包括阳离子脂质。如本文所用，阳离子脂质是指一类 分子，该类分子包括，至少一个，最常见为两个的脂肪酸链和带正电的极性端基。虽 然术语“阳离子脂质”也旨在包括具有其它长度脂肪酸链的脂质，但是典型的阳离子 脂质具有十二烷基(C₁₂)或十六烷基(十六基，C₁₆)的脂肪酸链。阳离子脂质的非 限制性实例包括：DOTAP(1,2-二酰基-3-三甲基铵丙烷)、DOPE(二油酰磷脂酰乙 醇胺)、DOTMA([2,3-双(油酰基)丙基]三甲基氯化铵)、DOGS(双十八烷基氨基 甘氨酰精胺)、DODAB(双十八烷基溴化二铵)、DODAC(十八烷基氯化二铵)、DOSPA (2,3-二油酰氧基-N-[精胺羧氨基乙基]-N-N-二甲基-1-丙烷铵)、DC-Chol(3β[N- (n’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇，二油酰)、DOIC(1-[2-(油酰氧基) -乙基]-2-油酰基-3(2-羟乙基)咪唑啉氯化物)、DOPC(二油酰磷脂酰胆碱)和DMRIE (二肉豆蔻酰丙氧基二甲基羟乙基溴化铵)。

在某些实施方式中，脂质体进一步包括可赋予脂质体的脂质双层以额外流动性的 胆固醇、胆固醇类似物和/或胆固醇衍生物。可用于本文脂质体中的胆固醇类似物和 衍生物的非限制性实例包括5-胆甾烯、5-孕烯-3β-醇-20-酮、4-胆甾烯-3酮和5-胆甾 烯-3-酮。在某些实施方式中，胆固醇在脂质体中的浓度为大约0.01-25mol％。在某些 实施方式中，胆固醇在脂质体中的浓度为大约0.1-10mol％。在其它实施方式中，胆 甾醇在脂质体中的浓度为大约0.01mol％、0.02mol％、0.03mol％、0.04mol％、 0.05mol％、0.06mol％、0.07mol％、0.08mol％、0.09mol％、0.1mol％、0.2mol％、 0.3mol％、0.4mol％、0.5mol％、0.6mol％、0.7mol％、0.8mol％、0.9mol％、1mol％、 2mol％、3mol％、4mol％、5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％、10mol％、 11mol％、12mol％、13mol％、14mol％、15mol％、16mol％、17mol％、18mol％、 19mol％、20mol％、21mol％、22mol％、23mol％、24mol％、25mol％或更高。

在一个具体的实施方式中，脂质体包括：链接于靶向官能基的脂质。靶向官能基 (可链接到用于形成脂质体的脂质)的非限制性实例包括：糖基(例如，甘露糖或含 有一个或多个甘露糖残基、甘露糖类似物或衍生物的碳水化合物)、肽(例如，细胞 受体的配体)、多肽(例如，抗体或其功能性片段)和核酸(例如，适配体或 )。

在一个实施方式中，其中与靶向官能基链接的脂质的最终浓度至少是脂质体的总脂 质含量的0.01％。在另一个实施方式中，与脂质体中靶向官能基链接的脂质浓度至少是 总脂质含量的0.1％。在另一个实施方式中，与脂质体中靶向官能基链接的脂质浓度至 少是总脂质含量的1％。在另一个实施方式中，与靶向官能基链接的脂质浓度至少是脂 质体的总脂质含量的5％或10％。在其它实施方式中，与靶向官能基链接的脂质浓度大 约是脂质体的总脂质含量的0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、 0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、 1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、 35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％ 或100％。

在一个具体的实施方式中，脂质体包含链接到一个或多个甘露糖残基(即甘露糖 基化脂质体)的脂质。甘露糖基化脂质的非限制性实例包括：ManDOG脂质(Espuelas 等，Bioorg Med Chem Lett.2003年8月4日；13(15)：2557-60，其内容在此全文引 入作为参考，用于所有目的)、四甘露糖基-3-L-赖氨酸-二油酰甘油脂质(Espuelas等， 同上)和甘露糖基化磷脂酰肌醇(Barratt等(1986)Biochim.Biophy.Acta，862:153-164， 其内容在此全文引入作为参考，用于所有目的)。

在某些实施方式中，本发明所述脂质体的平均直径约为50-500nm。例如，脂质 体平均直径可以是以下范围，例如约50-400nm、50-300nm、50-250nm、50-225nm、 50-200nm、50-175nm、75-500nm、75-400nm、75-300nm、75-250nm、75-225nm、 75-200nm、100-500nm、100-400nm、100-300nm、100-250nm、100-225nm、100-200nm。 在具体实施方式中，脂质体的平均直径大约为100-200nm。

脂质体可通过本领域中许多公知技术制备，公知技术包括挤压、逆相蒸发、超声、 搅拌以及水溶液中自组装(综述，参见，Torchilin VP，Weissig V(2003)Liposomes:a  practical approach.Practical approach series，第264卷，第2版，牛津大学，其内容在 此全文引入作为参考，用于所有目的)。此外，众所周知，制备脂质体的方法还可以 用于制备脂质体包封载物的组合物。

脂质体组合物制备方法的非限制性的实例在以下国际专利公开中有所说明：WO 1999/65465和WO 2010/052326；美国专利号：7381421、7604803、8075896、7790696、 7384923、7008791和美国专利申请公开号：2009/0068254和2008/0317838(其内容 在此全文引入作为参考，用于所有目的)。形成肽脂质体组合物的示例性方案的方法 包括五个步骤：步骤1)通过有机溶剂蒸发形成干燥不规则脂质层(氯仿中的脂质)； 步骤2)再水合干燥不规则脂质层形成多层MLV脂质体；步骤3)通过高压均化使 MLV脂质体生成SUV脂质体；步骤4)通过冷冻干燥将SUV脂质体和肽混合液的 混合物与过量糖一起脱水；步骤5)将SUV脂质体和肽混合液的脱水混合物以及过 量的糖再水合成尺寸约为100-200nm的SUV脂质体。

Ⅴ.靶向官能基

A.导言

为了增强它们的疗效，此处所述的MBP肽组合物可以链接到靶向官能基。靶向 官能基可共价或非共价地链接到MBP肽，例如，通过共价键、离子键、静电相互作 用、疏水作用，或物理包埋。在某些实施方式中，链接可通过链接基团或载体结构介 导。靶向官能基的实例包括，但不限于，糖基(例如，甘露糖或含一个或多个甘露糖 残基、类似物，或其衍生物的碳水化合物)、肽(例如，细胞受体的配体)、多肽(例 如，抗体或其功能性片段)，以及核酸(例如，适配体或)。

当相关联时，与载物单独的效力相比，靶向官能基提高MBP肽的效力。在一个 实施方式中，靶向官能基改善相关的MBP肽至体内位置或细胞类型的递送；和/或改 善MBP肽至体内细胞或位置的摄取。在一个特定的实施方式中，靶向官能基改善了 相关的MBP肽至免疫细胞(例如，B细胞或APC)的递送；和/或使免疫细胞(例如， B细胞或APC)摄取的MBP肽增加。

当共价地或非共价地链接到一个或多个MBP肽，靶向官能基可以：(1)与未链 接到靶向官能基的MBP肽相比，输入细胞(例如，免疫细胞)的MBP肽增加至少 10％；和/或(2)与未链接到靶向官能基的MBP肽相比，细胞摄取的MBP肽(例如， 免疫细胞)增加至少10％。在一个具体的实施方式中，免疫细胞是B-细胞或抗原递 呈细胞(APC)。在一个实施方式中，靶向官能基(1)增加了递送；和/或(2)与未 链接到靶向官能基的MBP肽相比，细胞摄取的MBP肽增加至少25％。在另一个实 施方式中，靶向官能基(1)增加了递送；和/或(2)与未链接到靶向官能基的MBP 肽相比，细胞摄取的MBP肽增加至少50％、75％或100％。在又一个实施方式中，靶 向官能基(1)增加了递送；和/或(2)与未链接到靶向官能基的MBP肽相比，细胞 摄取的MBP肽增加至少2倍。在其它实施方式中，靶向官能基(1)增加了递送；和 /或(2)与未链接到靶向官能基的MBP肽相比，细胞摄取的MBP肽增加至少4倍、 5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、 75倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、 800倍、900倍或1,000倍。

B.糖残基

在一个实施方式中，靶向官能基包含碳水化合物部分(例如，糖残基)。在某些 实施方式中，糖基可以是单糖、二糖，或多糖。糖基可以是天然存在的，天然存在的 糖的类似物，或天然存在的糖的衍生物。可以用作靶向官能基的糖基的非限制性实例 包括：甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、核糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、唾液酸、 N-乙酰葡糖胺、蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、曲二糖、黑曲霉 糖、异麦芽糖、β,β-海藻糖、α,β-海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦 芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二酮糖、甘露二糖、蜜二糖、车前二糖、芸香糖、芸香酮糖、 木二糖、其类似物，或其衍生物。

甘露糖衍生物和类似物的非限制性实例包括1-脱氧甘露伊霉素、甲基-α-D-吡喃 甘露糖苷、2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)、2-脱氧-2-氟代-甘露糖(2-FM)，和2-脱氧-2- 氯代-甘露糖(2-CM)，以上任何一种都可以与脂质缀合。

C.抗体

在另一个实施方式中，如本文所定义，靶向官能基包括抗体，或其功能片段。在 一个实施方式中，抗体特异性结合细胞表面抗原。在一个具体的实施方式中，抗体特 异性结合一种存在于免疫细胞上的细胞表面抗原。在一个更具体的实施方式中，抗体 结合到一种存在于B细胞或抗原递呈细胞(APC)上的细胞表面抗原。在一个特定实 施方式中，抗体特异性结合到一种存在于细胞表面上的甘露糖受体。

细胞表面抗原可以通过链接到MBP肽的抗体或其链接的载体进行靶定，细胞表 面抗原的这些非限制性实例包括：下列细胞的表型标记：NK细胞(例如，CD16和 CD56)；辅助性T细胞(例如，TCRαβ、CD3和CD4)；细胞毒性T细胞(例如，TCRαβ、 CD3和CD8)；γδT细胞(例如，TCRγδ和CD3)；以及B细胞(MHC-II类、CD19 和CD21)。细胞表面分子也可包括碳水化合物、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白或任何其 它存在于相关细胞表面上的分子。

D.适配体

在另一实施方式中，靶向官能基包括适配体。在一个实施方式中，适配体特异性 结合细胞表面抗原。在一个具体的实施方式中，适配体特异性结合到免疫细胞上存在 的细胞表面抗原。在更具体的实施方式中，该适配体结合到存在于B细胞或抗原递 呈细胞(APC)上的细胞表面抗原。在一个特定的实施方式中，适配体特异性结合到 存在于细胞表面上的甘露糖受体。

细胞表面抗原可以通过链接到MBP肽的适配体或其链接的载体进行靶定，细胞 表面抗原的这些非限制性实例包括：下列细胞的表型标记：NK细胞(例如CD16和 CD56)；辅助性T细胞(例如，TCRαβ、CD3和CD4)；细胞毒性T细胞(例如，TCRαβ、 CD3和CD8)；γδT细胞(例如，TCRγδ和CD3)；以及B细胞(MHC-II类、CD19 和CD21)。细胞表面分子也可包括碳水化合物、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白或任何其 它在相关细胞表面上存在的分子。

Ⅵ.治疗组合物

A.导言

在一个方面，本发明提供了一种用于治疗多发性硬化(MS)的治疗组合物，该 组合物包括：如本文所定义的链接到载体的髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽。在一个实施 方式中，MBP肽包括MBP(43-64)(SEQ ID NO:11)或MBP(115-170)(SEQ ID NO:12) 的至少6个连续的氨基酸。一般而言，MBP肽的长度由6-100个氨基酸组成。在一 个实施方式中，MBP肽的长度由6-50个氨基酸组成。在另一个实施方式中，MBP 肽的长度由6-25个氨基酸组成。在其它实施方式中，MBP肽包括约6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100，或更多个氨基酸。 在一个实施方式中，载体是脂质体。在一个更具体的实施方式中，载体包含靶向官能 基并且是甘露糖基化脂质体。

B.载体组合物

在一个实施方式中，组合物包含至少两个MBP肽，它们各自链接到载体。在一 个实施方式中，两个MBP肽链接到单一载体(例如，包封在单一脂质体内)。在另一 实施方式中，每个MBP肽链接到单独载体(例如，包封在单独脂质体内)，并且各自 的MBP-载体复合物在施用前被混合。

在一个实施方式中，组合物包括：第一MBP肽，其包含链接到第一载体的SEQ  ID NO:1的至少6个连续的氨基酸，以及第二MBP肽，其包含链接到第二载体的SEQ  ID NO:2的至少6个连续的氨基酸。在一个具体的实施方式中，第一MBP肽包含SEQ  ID NO:1的氨基酸序列，并且第二MBP肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在另一 个特定实施方式中，第一MBP肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，并且第二MBP 肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。

在一个实施方式中，组合物包括：第一MBP肽，其包括链接到第一载体的SEQ  ID NO:1的至少6个连续的氨基酸，以及第二MBP肽，其包括链接到第二载体的SEQ  ID NO:3的至少6个连续的氨基酸。在一个具体的实施方式中，第一MBP肽包含SEQ  ID NO:1的氨基酸序列，并且第二MBP肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一个 更具体的实施方式中，第一MBP肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，并且第二 MBP肽由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。

在一个实施方式中，组合物包括：第一MBP肽，其包含链接到第一载体的SEQ  ID NO:2的至少6个连续的氨基酸，以及第二MBP肽，其包含链接到第二载体的SEQ  ID NO:3的至少6个连续的氨基酸。在一个具体的实施方式中，第一MBP肽包括SEQ  ID NO:2的氨基酸序列，并且第二MBP肽包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在另一 个更具体的实施方式中，第一MBP肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成，并且第二 MBP肽由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。

在一个实施方式中，组合物包括至少三个MBP肽，它们各自链接到载体。在一 个实施方式中，所有三个MBP肽链接到单一载体(例如，包封在单一脂质体内)。在 另一实施方式中，每个MBP肽链接到单独载体(例如，包封在单独脂质体内)，各自 的MBP-载体复合物在施用前被混合。

在另一个实施方式中，组合物包括：第一MBP肽，其包含链接到第一载体的SEQ  ID NO:1的至少6个连续的氨基酸，以及第二MBP肽，其包含链接到第二载体的SEQ  ID NO:2的至少6个连续的氨基酸，以及第三MBP肽，其包含链接到第三载体的SEQ  ID NO:3的至少6个连续的氨基酸。在一个具体的实施方式中，第一MBP肽包含SEQ  ID NO:1的氨基酸序列，第二MBP肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且第三 MBP肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在另一个更具体的实施方式中，第一MBP 肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，第二MBP肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组 成，并且第三MBP肽由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。

在一个方面，本发明提供了一种用于治疗多发性硬化的组合物，该组合物包括： 如本文所定义的MBP肽，所述肽链接到包含靶向官能基的载体。在一个具体的实施 方式中，包含靶向官能基的载体增加：(1)输入免疫细胞的肽；或(2)与在没有靶 向官能基的情况下链接到载体的肽相比，免疫细胞摄取的肽。在一个具体实施方式中， 载体包括脂质体。在另一个具体的实施方式中，靶向官能基包括甘露糖基化脂质。

在本文所述的组合物的某些实施方式中，载体共价或非共价地链接到靶向官能 基。在一个实施方式中，靶向官能基(1)与不链接到靶向官能基的MBP肽相比，增 加了输入细胞(例如，免疫细胞)的MBP肽；和/或(2)与不链接到靶向官能基的 MBP肽相比，增加了细胞(例如，免疫细胞)摄取的MBP肽。在一个具体的实施方 式中，细胞是免疫细胞。在一个更具体的实施方式中，免疫细胞是B细胞或抗原递 呈细胞(APC)。

C.脂质体载体组合物

在本发明的具体实施方式中，本文所述治疗组合物包括脂质体载体。因此，本发 明提供了用于治疗MS的组合物，该组合物包含脂质体包封的MBP肽。在一个具体 的实施方式中，脂质体链接到靶向官能基。在一个更具体的实施方式中，靶向官能基 是存在于脂质体双层中的甘露糖基化脂质。

在一个具体的实施方式中，脂质体链接到甘露糖靶向官能基，即，甘露糖基化脂 质体。在某些实施方式中，包含甘露糖基化脂质体的脂质的至少0.01％将缀合到至少 1个甘露糖残基。在另一个实施方式中，包含甘露糖基化脂质体的脂质的至少0.1％ 将缀合到少至1个甘露糖残基。在另一个实施方式中，包含甘露糖基化脂质体的脂质 的至少1％将缀合到至少1个甘露糖残基。在其它实施方式中，包含甘露糖基化脂质 体的脂质的至少0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、 0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、 5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、 55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％将缀合到至少1个甘 露糖残基。

脂质体组合物可以根据本领域已知的方法配制。脂质体制剂可以包括以下一个或 多个：缓冲剂(例如，醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲 液或酒石酸盐缓冲液)；糖(例如海藻糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、右旋糖或 果糖)；糖醇(例如，山梨醇、麦芽糖醇、拉克替醇、甘露醇或丙三醇)、酒精(例如， 乙醇或叔丁醇)；盐(例如，氯化钠、氯化钾、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾)；抗氧化 剂(例如，谷胱甘肽)。

D.靶向官能基

在某些实施方式中，靶向官能基是糖基(例如，甘露糖或含一个或多个甘露糖残 基的碳水化合物)；肽(例如，细胞受体的配体)、多肽(例如，抗体或其功能片段)； 或核酸(例如适配体或)。在一个具体实施方式中，靶向官能基是甘露糖 残基。

在一个实施方式中，靶向官能基：(1)与未链接到靶向官能基的MBP肽相比， 递送到细胞(例如，免疫细胞)的MBP肽增加了至少10％；和/或(2)与未链接到 靶向官能基的MBP肽相比，使摄入细胞(例如，免疫细胞)的MBP肽增加至少10％。 在一个具体的实施方式中，免疫细胞是B-细胞或抗原递呈细胞(APC)。在一个实施 方式中，靶向官能基(1)增加了递送；和/或(2)与未链接到靶向官能基的MBP肽 相比，使细胞摄取的MBP肽增加至少25％。在另一个实施方式中，靶向官能基(1) 增加了递送；和/或(2)与未链接到靶向官能基的MBP肽相比，使细胞摄取的MBP 肽增加至少50％、75％或100％。在又一个实施方式中，靶向官能基(1)增加了递送； 和/或(2)与未链接到靶向官能基的MBP肽相比，使细胞摄取的MBP肽增加了至少 2倍。在其它实施方式中，靶向官能基(1)增加了递送；和/或(2)与未链接到靶向 官能基的MBP肽相比，使细胞摄取的MBP肽增加了至少4倍、5倍、6倍、7倍、8 倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、150 倍、200倍、250倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍，或 1000倍。

在一个方面，本发明提供了一种用于治疗MS的组合物，如本文所定义，该组合 物包含共价链接到靶向官能基的MBP肽(例如，其中所述载体是靶向官能基)。在某 些实施方式中，靶向官能基共价地直接链接到MBP肽。例如，可将靶向官能基链接 在MBP蛋白质的N-端或C-端、赖氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺侧链的伯胺基，丝氨 酸或苏氨酸侧链的羟基，或半胱氨酸侧链的自由硫醇基。在某些实施方式中，直接链 接到MBP肽的靶向官能基是糖基(例如，甘露糖残基或含有一个或多个甘露糖残基、 其类似物或衍生物的碳水化合物)、肽(例如，细胞受体的配体)、多肽(例如，抗体 或其功能片段)，或核酸(例如，适配体或)。在一个具体实施方式中， 靶向官能基是甘露糖残基。

E.联合治疗

目前还不存在治愈多发性硬化的疗法。然而，已经批准几种治疗形式用于控制 MS相关的症状。这些疗法包括：芬戈莫德，一种鞘氨醇1-磷酸盐受体调节剂，用于 隔绝淋巴节的淋巴球，从而阻止它们促进自体免疫反应；干扰素β-1a和β-1b，其很 可能可以减少MS复发率，并通过其抗炎特性减缓MS患者的伤残进展；醋酸格拉替 雷，一种非干扰素、非甾族免疫调节剂，其是MBP中发现的四种主要的氨基酸—— 谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)，和酪氨酸(Tyr)的无规聚合物；米 托恩醌，一种用于治疗继发进展型MS的II型拓扑异构酶抑制剂；以及，那他珠单抗， 一种针对细胞粘附分子α4-整合素的人源化单克隆抗体。

另外，使用下述治疗可以为诊断患有，或有风险罹患MS的患者提供一些治疗益 处：(1)施用批准用于治疗复发缓解型MS(RRMS)的醋酸格拉替雷(GA)。GA 是Glu、Lys、Ala、Tyr合成的无规共聚物，其诱导Th2调节性T细胞群体有能力穿 过BBB并且产生抗炎细胞因子IL-4、IL-6、IL-10，以及脑源性神经生长因子(Ahroni R.等人，Proc Natl Acad Sci USA 2003；100:14157-62)；(2)施用与T细胞受体(TCR) 相互作用的所谓的“变异性肽配体”(APL)。APL携带改性的(Luca ME等人，J  Neuroimmunol 2005；160:178-87)、突变的(Katsara M.等人，J Med Chem 2009； 52:214-8)或限制的(Warren KG等人，Eur J Neurol 2006；13:887-95)TCR-结合基 团，并且能够部分地激活T细胞，将表型Th1切换至Th2，并且在某些情况下诱导T 细胞无反应性。MBP肽MBP(82-98)，一种来源于MBP的致脑炎片段的APL，示 出了在HLA-DR2-DR4单倍型的患者中有希望抑制MS进展。然而，基于这种肽的药 物组合物在III期临床试验中失败(Fontoura和Garren，Results Probl Cell Differ 2010； 51:259-85)。一种MBP(83-99)肽的双突变诱导IL-4应答，并拮抗IFN-γ应答(Katsara  M等人，J Neuroimmunol 2008；200:77-89)；(3)施用IFNβ；(4)单克隆抗体，例 如，利妥昔单抗(抗CD20)针对B细胞(Hauser SL等人，N Engl J Med 2008； 358:676-88)、达克珠单抗(抗CD25、IL-2受体的α亚基)消除活化的T细胞(Rose  JW等人，Ann Neurol 2004；56:864-7)和阿伦单抗(抗CD52，功能未知的糖蛋白呈 现在所有成熟的淋巴球和单核细胞上)(Coles A.等人，Clin Neurol Neurosurg 2004； 106:270-4)；(5)口服治疗，例如磷酸化形式的FTY720(SP1-关联的G-蛋白质-偶联 受体的抑制剂)、特立氟胺(T细胞增殖的抑制剂)、BG-12(Th2-细胞因子的诱导物)、 拉喹莫德(T细胞和巨噬细胞的抑制剂进入CNS、Th2/Th3变动触发)、克拉屈宾(脱 氧胞苷激酶的基质，干扰脱氧核糖核酸的修复和淋巴球死亡)(所有详见Fontoura和 Garren，Results Probl Differ 2010；51:259-85)；(6)通过TCR高变区灭活T细胞注 射或接种以刺激TCR-特异性逆调节的CD8+细胞；(7)免疫系统的耐受性：通过自 身抗原的“鼻”或“口服耐受”的诱导、或通过BHT-3009质粒的DNA-接种，该BHT-3009 质粒编码整个MBP分子，并触发T细胞和自身抗体对几种髓鞘素抗原显著的耐受。 (8)最近提出的新型特异性B细胞靶向消耗治疗(Stepanov AV等人，PLoS One； 6:e20991)。

在一个方面，本发明提供用于诊断患有或可能患有多发性硬化的患者的组合治 疗。在一个实施方式中，该治疗包括本文所述MBP肽组合物的联合给药和先前确定 的治疗剂，例如，芬戈莫德、干扰素β-1a、干扰素β-1b、醋酸格拉替雷、米托恩醌、 用于治疗继发进展型MS的II型拓扑异构酶抑制剂，以及抗-α4-整合素抗体。

在一个实施方式中，联合给药包括同时或相继施用链接到载体的抗原MBP肽和 第二治疗剂。在另一个实施方式中，共同给药包括施用具有第一药物(MBP肽组合 物或所述替代疗法)的第一完整治疗周期，随后施用具有其它疗法的完整治疗方案。 在该实施方式中，这两种药物的施用不重叠，更确切地说，彼此相对循环治疗。

Ⅶ.多发性硬化的治疗

A.导言

在一个方面，本发明提供了治疗有需要的受治对象的多发性硬化(MS)的方法， 如本文所述，通过将链接到载体的B-细胞表位MBP肽施用给受用者。在一个具体实 施方式中，该方法包括施用脂质体包封的MBP肽给有需要的受治对象，MBP肽包括 与SEQ ID NOS:1-3其中之一基本相同的序列。

在一个实施方式中，该方法包括：施用治疗性髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽，其包 括链接到载体(例如，脂质体)的MBP(43-64)(SEQ ID NO:11)或MBP(115-170) (SEQ ID NO:12)的至少6个连续的氨基酸。一般而言，MBP肽的长度由6-100个 氨基酸组成。在一个实施方式中，MBP肽的长度由6-50个氨基酸组成。在另一个实 施方式中，MBP肽的长度由6-25氨基酸组成。在其它实施方式中，MBP肽由约6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100， 或更多个氨基酸组成。在一个实施方式中，载体是脂质体。在一个更具体的实施方式 中，载体是一种甘露糖基化脂质体。

在一个具体实施方式中，该方法包括：将MBP肽施用给有需要的受治对象，MBP 肽包括链接到载体的序列GGDRGAPKRGSGKDSHH(MBP(46-62)；SEQ ID NO:1) 的至少6个连续的氨基酸。在一个更具体的实施方式中，MBP肽包含SEQ ID NO:1 的氨基酸序列。在更具体的实施方式中，MBP肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。 在一个实施方式中，载体是脂质体。在一个更具体的实施方式中，脂质体是甘露糖基 化脂质体。

在另一具体的实施方式中，所述方法包括：将MBP肽施用给有需要的受治对象， MBP肽包括链接到载体的序列GFGYGGRASDYKSAHK(MBP(124-139)；SEQ ID NO:2)的至少6个连续的氨基酸。在一个具体的实施方式中，MBP肽包括SEQ ID NO:2 的氨基酸序列。在更具体的实施方式中，MBP肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。 在一个实施方式中，载体是脂质体。在更具体的实施方式中，脂质体是甘露糖基化脂 质体。

在另一具体实施方式中，所述方法包括：将MBP肽施用给有需要的受治对象， MBP肽包括链接到载体的序列QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR(MBP(147-170)； SEQ ID NO:3)的至少6个连续的氨基酸。在一个具体的实施方式中，MBP肽包含 SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在更具体的实施方式中，MBP肽由SEQ ID NO:3的氨 基酸序列组成。在一个实施方式中，载体是脂质体。在更具体的实施方式中，脂质体 是甘露糖基化脂质体。

在另一个具体的实施方式中，该方法包括：将至少两种MBP肽施用给有需要的 受治对象，每个相应的MBP肽包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3 的至少6个连续的氨基酸，MBP肽链接到载体。在更具体的实施方式中，MBP肽各 自包含选自SEQ ID NOS:1-3的氨基酸序列。在更具体的实施方式中，MBP肽各自由 选自SEQ ID NOS:1-3的氨基酸序列组成。在一个实施方式中，载体是脂质体。在更 具体的实施方式中，脂质体是甘露糖基化脂质体。

在另一个具体的实施方式中，该方法包括：施用三种MBP肽，每个相应的MBP 肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3的至少6个连续的氨基酸，所 述MBP肽链接到载体。在更具体的实施方式中，MBP肽各自包含选自SEQ ID  NOS:1-3的氨基酸序列。在更具体的实施方式中，MBP肽各自由选自SEQ ID NOS:1-3 的氨基酸序列组成。在一个实施方式中，载体是脂质体。在更具体的实施方式中，脂 质体是甘露糖基化脂质体。

在某些实施方式中，受治对象已被诊断患有多发性硬化。在一个实施方式中，受 治对象已经被诊断患有复发缓解型多发性硬化(RRMS)。在另一个实施方式中，受 治对象已经被诊断患有继发进展型多发性硬化(SPMS)。在另一个实施方式中，受治 对象已经被诊断患有原发进展型多发性硬化(PPMS)。在另一个实施方式中，受治对 象已经被诊断患有进展复发型多发性硬化(PRMS)。

在一个实施方式中，治疗包括：在急性症状发作期间或紧接之后施用MBP肽组 合物。在一个实施方式中，急性症状发作是初始发作。在另一个实施方式中，急性症 状发作是复发发作。在某些实施方式中，受治对象可以在急性症状发作期间被联合施 用静脉注射皮质类固醇(例如，甲泼尼龙)。在某些实施方式中，受治对象已经被诊 断患有原发进展型、继发进展型或复发缓解型MS。在一个实施方式中，治疗将减轻 急性发作的严重程度或改善受治对象的一种或多种生理或心理症状。

在另一个实施方式中，所述治疗包括：在受治对象的MS症状缓解期间施用MBP 肽组合物。在某些实施方式中，所述受治对象已被诊断患有继发进展型或复发缓解型 MS。在一个实施方式中，治疗将预防出现急性发作，延迟出现急性发作，减轻随后 急性发作的严重性，或改善受治对象的一种或多种生理或心理症状。

在另一个实施方式中，所述治疗包括：在受治对象进展衰退期间施用MBP肽组 合物。在某些实施方式中，所述受治对象已被诊断患有继发进展型、原发进展型或进 展复发型MS。在一个实施方式中，治疗将预防出现急性发作，延迟出现急性发作， 减轻随后急性发作的严重性，减慢病症的进展，阻止病症的进展，或改善受治对象的 一种或多种生理或心理症状。

在另一个实施方式中，治疗包括：将MBP肽组合物施用到被诊断具有增加的 MS患病风险的受治对象。在某些实施方式中，受治对象将具有一个或多个MS的风 险因子，包括但不限于，MS家族史，病症生物标记的上调或下调(例如，白介素-6、 一氧化氮和一氧化氮合酶、骨桥蛋白、胎球蛋白-A，和抗MBP的自身抗体)，以及 MS的遗传标记。在某些实施方式中，给有需要的受治对象的MBP肽组合物的预防 性给药将预防病症，延迟病症的发作，防止最初的急性发作，延迟发生最初急性发作， 减轻病症的严重性，或减轻最初急性发作的严重性。

在某些实施方式中，受治对象以前接受过MS治疗。在其它实施方式中，受治对 象以前没有接受过MS治疗。

B.给药

本发明的MBP肽组合物可以根据任何已知的施用途径给药，例如局部、肠溶、 胃肠外、静脉内、皮下、真皮下、肌内、腹腔内、吸入、硬膜外、套管插入术(例如， 静脉内、经鼻、口服或颅内插管)、直达中枢神经系统的给药，或者任何其它类似的 给药途径。所述选择用于特定治疗的给药途径取决于，例如，药物组合物、待递送的 治疗剂的用量、所治疗的病症状态；临床试验，诸如特定制剂的功效和特定制剂的安 全性，提供的结果，和期望的患者依从性。在一个具体的实施方式中，MBP肽组合 物皮下给药。

在某些实施方式中，施用MBP肽组合物，使得该组合物递送到或累积在中枢神 经系统中。在一个实施方式中，组合物直接施用于中枢神经系统(CNS)，例如通过 脊髓硬膜外、鼻内给药(综述参见，Liu X.，Expert Opin Drug Deliv.2011年12月； 8(12):1681-90和Wen MM.，Discov.Med.2011年6月；11(61):497-503，其内容在此 全文引入作为参考，用于所有目的)，或药物传递系统的移植(综述参见，Tresco和 Winslow，Crit.Ref.Biomed.Eng.2011；39(1):29-44，其内容在此全文引入作为参考， 用于所有目的)。

由于对CNS直接施用治疗剂存在很多挑战，包括潜在致命感染的风险，该组合 物也可以施用到CNS外部。以这种方式递送的治疗剂必须通过血脑屏障(BBB)进 入到CNS。已经提出了几种策略来增强治疗剂穿过BBB的通道(参见，Hossain S等 人，Curr Drug Deliv.2010年12月；7(5):389-97，其内容在此全文引入作为参考，用 于所有目的)。例如，在其表面使用显示对BBB具有特异性的BBB受体的配体、肽 或抗体的载体系统(综述参见，Costantino L.，Future Med Chem.2010年11月； 2(11):1681-701和Craparo等人，CNS Neuroscci.Ther.2011年12月；17(6):670-7，其 内容在此全文引入作为参考，用于所有目的)，或嵌合肽，其包括：融合到BBB转运 载体的MBP肽，例如，内源性肽、改性蛋白质或肽模拟物单克隆抗体(MAb)，MAb 在内源性内皮受体系统上经RMT穿过BBB(参见，Pardridge，W.M.，Mol.Interv.， 2003，3(2)，90-105，其内容在此全文引入作为参考，用于所有目的)。

在一个实施方式中，治疗包括定期给药，例如，在给定的一段时间内，每月一次、 每月两次、每周一次、每周两次、每周三次、每隔一天、每天，或一天两次。根据患 者的治疗方案和病症状态，治疗周期可持续至少1个月，或至少2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11或12个月。在适当情况下，治疗周期可以持续至少1年，或至少2、3、 4、5、6、7、8、9、10或更多年。由熟练的医生对患者治疗的效果按需要监控并调 节，例如，为了提高效力或降低副作用。

患者给药量的变化将取决于许多因素，包括：给药频率；疾病的严重程度(例如 多发性硬化)；病况的子类型(例如，复发缓解型MS、继发进展型MS、原发进展型 MS和进展复发型MS)；病情阶段(例如，初始发作、复发和缓解)；受治对象的体 型和容忍性；采用的施用途径；副作用的风险；不利的药物相互作用的风险；以及对 可分别由熟练医师很容易地确定的先前治疗的应答。

如上文所讨论的，许多因素将导致如何组成恰当的用量，包括给药的频率。在一 个实施方式中，本文提供的MBP肽组合物的给药量可以是约0.01mg/kg至约 1000mg/kg。在其它实施方式中，用量可以是约0.05mg/kg至约500mg/kg。在另一个 实施方式中，用量可以是约0.1mg/kg至约250mg/kg。在另一个实施方式中，用量可 以是约0.25mg/kg至约100mg/kg。在另一个实施方式中，用量可以是约0.5mg/kg至 约50mg/kg。在另一个实施方式中，用量可以是约1mg/kg至约25mg/kg。在其它实 施方式中，用量可以是约0.1mg/kg至约10mg/kg、约5mg/kg至25mg/kg、约20mg/kg 至约50mg/kg、约50mg/kg至约100mg/kg、约100mg/kg至约250mg/kg，或约200mg/kg 至约500mg/kg。在一个实施方式中，每天施用所述剂量。在另一个实施方式中，每 隔一天、每三天、每四天、每五天、每六天或每七天施用所述剂量。在一个实施方式 中，每周施用一次所述剂量。在另一个实施方式中，每两周施用一次所述剂量。在其 它实施方式中，每三周、每四周、每五周、每六周、每七周、每八周、每九周、每十 周、每十一周或每十二周施用所述剂量。

Ⅷ.实施例

实施例1通过超声作用制备含有MBP肽的脂质体

将45g的磷脂混合物(含有1重量份的甘露糖化DOG脂质(ManDOG)和99 重量份的2,3-二棕榈酰基-sn-甘油基-1-磷脂酰胆碱)溶解于450mL的氯仿，并置于 1L真空蒸发器烧瓶中。在真空下蒸发氯仿以在烧瓶壁上形成脂质膜。蒸发后，用氮 气充满烧瓶，将800mL的注射用水(WFI)缓慢地加入其中。将烧瓶放置在超声浴 中30分钟以破坏预先形成的脂质体。超声作用后重新形成的脂质体形成脂质体的水 性乳液。

将0.75g的MBP肽混合物(含有等量的GGDRGAPKRGSGKDSHH(SEQ ID  NO:1；MBP)、GFGYGGRASDYKSAHK(SEQ ID NO:2；MBP2)，和 QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR(SEQ ID NO:3；MBP3)以及过量乳糖(乳糖与 脂质之比为3:1))溶解在40mL注射用水中。将脂质体乳液加入到MBP肽溶液，并 将混合物搅拌30分钟，得到尺寸在100nm和200nm之间的脂质体乳液和未包封的 MBP肽。然后将得到的单层脂质体的乳液冻干。

下面的步骤是在受控条件下再水合，接着离心洗涤所得到的SUV脂质体以将未 掺入物质除去。洗涤的球团重悬于PBS中以达到所需的剂量体积。根据反相高压液 相色谱(HPLC)，使用在C18柱上施加的乙腈的线性梯度估计肽的掺入量。在25℃ 下，通过PBS或适当的介质将20μl的分散体稀释至所需的体积，在Brookhaven ZetaPlus电位分析仪上测定脂质体的z平均直径和电动电势。控制没有肽(媒介物) 的脂质体和缺乏甘露糖基化脂质的脂质体用同样的方法得到，除了分别加入MBP肽 和ManDOG。

实施例2经由分解制备含有MBP肽的脂质体

将45g的磷脂混合物(含有1重量份的甘露糖化DOG脂质(ManDOG)和99 重量份的2,3-二棕榈酰基-sn-甘油基-1-磷脂酰胆碱)溶解于450mL的氯仿，并置于 1L真空蒸发器烧瓶中。在真空下蒸发氯仿以在烧瓶壁上形成脂质膜。蒸发后，用氮 气充满烧瓶，将800mL注射用水缓慢地加入其中。将所得混合物转移至流动式粉碎 机的接收器，粉碎机的每搏输出量压力设定为150MPa。每次加载将100ml的混合物 加到流动式粉碎机中，从粉碎机的接收器中收集得到脂质体乳液。

将0.75g的MBP肽混合物(含有等量的GGDRGAPKRGSGKDSHH(SEQ ID  NO:1；MBP1)，GFGYGGRASDYKSAHK(SEQ ID NO:2；MBP2)，和 QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR(SEQ ID NO:3；MBP3)以及过量乳糖(乳糖与 脂质之比为3:1))溶解在40mL注射用水中。将脂质体乳液加入MBP肽溶液，并将 混合物搅拌30分钟，得到尺寸在100nm和200nm之间的脂质体乳液和未包封的MBP 肽。然后将得到的单层脂质体的乳液冻干。

下面的步骤是在受控条件下再水合，接着通过离心洗涤所得到的SUV脂质体以 除去未掺入物质。洗涤的球团重悬于PBS中以达到所需的剂量体积。根据反相HPLC， 使用施加在C18柱上的乙腈的线性梯度估计肽的掺入量。在25℃下，通过PBS或适 当的介质将20μl分散体稀释至所需的体积，在Brookhaven ZetaPlus电位分析仪上测 定脂质体的z平均直径和电动电势。控制没有肽(媒介物)的脂质体和缺乏甘露糖基 化脂质的脂质体通过同样的方法得到，除了分别加入MBP肽和ManDOG。

实施例3含有MBP肽的脂质体的含水制剂

将100mL的磷酸盐缓冲液(FBR)加入到1000mg的冻干MBP-肽的脂质体中， 按照实施例1描述的方式在无菌条件下制备，并搅拌。加入β-胡萝卜素，然后将其作 为抗氧剂加入到组合物中，最终浓度为0.01％。然后将脂质体组合物分散到水解I类 玻璃容器中，处于无菌条件和氮气氛中。该容器随后被用橡皮塞密封并装上铝盖。

实施例4含有MBP肽的脂质体的冻干制剂

向按实施例1方法制备的1000mg冻干的MBP肽的脂质体中，在无菌条件下加 入2mg的固体α生育酚。100mg所得的干混合物被分散到水解I类玻璃容器，处于 无菌条件和氮气氛。该容器随后被用橡皮塞密封并装上铝盖。在使用之前，在每个容 器中加入1-2mL的WFI，将干燥的MBP的脂质混合物重组，并摇动1-2分钟以形成 均匀脂质体乳液。

实施例5采用脂质体包封的MBP肽治疗DA大鼠中的EAE

为了在质量为220-250g(12-14月龄)的DA大鼠中诱导实验性过敏性脑脊髓炎 (EAE)，乳化在浓度为10％(m/v)的完全弗氏佐剂(Difco，美国)中的10μg髓磷 脂碱性蛋白的脑基因肽片段ARTTHYGSLPQKSQRSQ(SEQ ID NO:4；Anaspec，美 国)皮下注射到前肢。将大鼠称重，并且每天监测EAE的神经学症状。每个速率的 EAE症状表现根据以下评分：(0)-EAE症状的缺失；(1)-尾巴肌肉弹性降低；(2) -减小翻正反射；(3)-轻度麻痹；(4)-完全麻痹；和(5)-濒死或死亡。中间症状通 过增加或减小0.5个单位值来评分。EAE诱导6天后，将动物随机分成若干组(每组 12只动物)。

在诱导后的6到11天之间，对每一个相应的组中的大鼠进行皮下注射实施例2 中描述的脂质体制剂(乳化在磷酸盐溶液中，pH 7.4)、醋酸格拉替雷阳性对照制剂 (GA；copaxone，Teva制药工业有限公司，以色列)、原型肽DENPVVIIFFKNIVTPRT (SEQ ID NO:5)，或磷酸盐缓冲液(pH 7.4)安慰剂。配制该肽、醋酸格拉替雷，和 脂质体制剂，然后立即使用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)给药。每天给每只动物施用0.1mL 的浓度为150μg的每种组合物。测试结果列于表2：

表2.原型、公开的脂质体、安慰剂和醋酸格拉替雷对DA大鼠的EAE病程的效 果。

如表2所示，与原型肽或醋酸格拉替雷的组合物(比较在第20天的平均EAE得 分)相比，MBP肽的脂质体组合物的施用通过减小在DA大鼠中EAE进展的强度和 速率以提供显著提高的治疗益处。

实施例6采用脂质体包封的MBP肽治疗诊断患有多发性硬化的女性人类受治对 象

一位女性患者(30岁)被诊断为患有多发性硬化(脑脊髓形式，进展过程)，先 前施用皮质类固醇、β-干扰素和醋酸格拉替雷治疗，每一种方法经过证实都是无效 的，因为她的神经功能缺陷和认知损伤继续恶化。受治对象的MBP抗体的血清水平 测定为10⁷单位/mL，患者的T-淋巴球刺激指数(SI)测量为6.5。

征得适当的同意，则如实施例3所制备的脂质体MBP的三肽组合物经皮下施用， 用量为200mg，每隔一周进行，持续6个月。在治疗的过程中，观察到患者1.5单位 (EDSS比例)的神经功能缺陷的缓解。抗MBP的IgG抗体的血清水平降低到检测 不到的水平。并且T-淋巴球的SI在6个月后测定为2。

这些结果表明，通过施用本文所述的脂质体MBP的肽组合物可以有效治疗人类 的MS。

实施例7采用脂质体包封的MBP肽治疗诊断患有多发性硬化的男性人类受治对 象

一位男性患者(36岁)被诊断为患有多发性硬化(脑脊髓形式、缓解过程)，处 于复发阶段，先前曾接受重复性皮质类固醇治疗。该患者显示MS症状已有三年。在 治疗时，患者出现了：当向右看时出现摆动性眼球震颤、自动肌腱反射、腿部S<D、 自动上腹壁反射、不存在中间和下腹壁反射、两侧巴彬斯基征、足痉挛(多表现在右 足)、四肢没有不全性麻痹、肌肉张力不变、步态失调、Romberg站立平衡缺失、当 进行跟-胫测试时共济失调，以及尿潴留。患者的神经功能缺陷在EDSS规模上的值 为6。

该患者也患有暂时性半视神经乳头的眼内黄化。在研究完患者的PBMC，关于 MBP的T-淋巴球活性测定为刺激指数(SI)7.45。血清IgG抗体的水平为75单位/mL。

征得患者的同意，原型肽组合物可以按500mg的用量每两周给药一次。每次注 射后7天，在患者的周边(静脉的)的血液中取样，以便确定相对于MBP的T-淋巴 球活性的变化，以及自身抗体水平。经过7周，患者临床表现出轻微的MS进展。在 第四个星期，患者IgG自身抗体水平增加到112单位/mL，T-细胞SI加倍。

在采用原型肽的初始疗程之后，患者同意接受上述脂质体MBP三肽组合物的治 疗。对该患者施用100mg的组合物，每两周一次，持续十二周(总共6次注射)。

执行三周的脂质体MBP三肽的治疗措施，开始出现症状缓解。到第8周时，患 者的IgG自身抗体的水平下降到25单位/mL，T-细胞SI低于治疗之前测量水平三倍。 临床上，随着患者排尿和步态的正常化，他能够在Romberg站立中保持平衡，很容 易地通过跟-胫测试，并且在EDSS规模上的神经功能缺陷值下降到5。

这些结果表明，通过施用本文所述的脂质体MBP肽组合物可以有效治疗人类 MS。

实施例8多发性硬化的相关啮齿动物模型的鉴定

可通过髓鞘素抗原免疫在许多物种中诱导EAE，这用作多发性硬化(MS)的模 型。虽然这些MS模型用于许多研究，但并不是与MS病症完全相关。例如，一旦治 疗人类MS患者，在EAE动物模型示出了所提出的MS疗法的疗效的大量研究不能 转化为有益效果，甚至引起恶化(Hohlfeld和Wekerle，Proc Natl Acad Sci，美国，2004； 101:14599-606)。因此，仔细检查EAE啮齿动物模型以识别更接近地匹配MS患者中 MBP自身抗体(autoAb)光谱的系统。

预先制备一种MBP表位库，其代表融合硫氧还蛋白载体蛋白质的神经抗原的片 段(Belogurov AA等人，J Immunol 2008；180:1258-67，其内容在此全文引入作为参 考，用于所有目的)。据报道，结合到MBP表位库的autoAb的方式可以被认为是分 子标记，或MS中B细胞应答的快照。为了鉴定与MS最相关的啮齿动物模型，在三 种啮齿动物中诱导EAE：SJL和C57BL/6小鼠，以及DA大鼠(图1B)。MBP表位 库通过使用抗MBP和抗原癌基因单克隆抗体进行杂交试验(图1A)以确定EAE诱 导的啮齿动物模型的抗MBP自身抗体结合方式。然后将该结合方式与为12位人类 MS患者确定的抗MBP的自身抗体结合方式对比。

所有的动物研究都在Assaf Harofeh医学中心(Zerifin，Israel)动物设施中采用 批准的标准动物饲养惯例进行。对8-9周的Dark Agouti(DA)雌性大鼠进行EAE诱 导。简言之，在与CFA，(不完全弗氏佐剂(IFA)，Sigma)和1mg MT(H37RA菌 株；Difco Laboratories，Detroit，MI)以比率1:1混合的盐水中，在大鼠尾巴的基部 皮内注射总体积为200μl的含有50μg MBP(63-81)(ANASPEC)。出现MS症状的 动物计入研究。在类似的条件下，用不同脂质体制剂(表3)、醋酸格拉替雷或安慰 剂(媒介物)对大鼠进行治疗，持续6天。所有制剂都是通过每天一次皮下注射给药。 跟踪动物直到EAE诱导后第28天。在所有研究期內，每日记录临床体征评分。分值 等级如下：0-正常，1-尾巴软弱无力，2-后腿软弱无力或麻痹，3-后腿麻痹，拖动后 肢，4-完全麻痹，不能移动，5-死亡。

SPF雌性SJL小鼠，6-8周龄，根据所建立的方案进行免疫(Coligan JE，Current  protocols in immunology.[纽约]：Wiley，1996，增刊19，第5.1单元，以及增刊21， 第2.8单元)，在含有2mg/ml结核杆菌的完全弗氏佐剂中，每只小鼠注射50μg的牛 的MBP。SPF雌性小鼠C57BL/6，6-8周龄，根据所建立的方案进行免疫(Oliver AR 等人，J Immunol 2003；171:462-8)，在含有0.5mg/ml结核杆菌的完全弗氏佐剂中， 每只小鼠注射100μg的MOG的重组胞外域。在第二次免疫后14和28天之间，对具 有显著的临床症状小鼠实施安乐死，收集其血清进行分析。

从城市医院#11的莫斯科多发性硬化症中心获取12位复发缓解型MS患者的 10mL血液样品。所述MS患者在23岁到61岁之间(平均32.2岁)。它们的扩展残 疾状态量表(EDSS)分数范围为从0至4(中间值2.0)。将EDSS按0至10评分， 较高的分数指示严重的残疾。在取血液样品前至少1个月，这些患者都没有接受皮质 类固醇治疗(Kurtzke JF，Neurology 1983；33:1444-52)。根据俄罗斯联邦卫生部的规 定，所有患者都签署了知情同意书，并由城市医院#11的伦理委员会批准。

为了确定来自EAE诱导的啮齿动物模型和人类MS患者的血清中抗MBP自身抗 体结合方式，ELISA试验按如下步骤进行。在100mM的pH为9.0的碳酸盐/碳酸氢 盐缓冲液中，在微量滴定板(MaxiSorp-Nunc)的奇数列孔中涂覆有50μl的10μg/ml 的MBP溶液或重组MBP肽。这些板用ELISA板密封器(Costar)密封并在4℃下温 育过夜，然后用含有0.15％吐温-20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤(300μl/孔)三次。 在pH为9.0的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中，用250μl的2％的牛血清白蛋白(BSA) (Sigma)封堵所有孔，并在37℃下温育1小时。用含有0.15％吐温-20的PBS洗涤 该板。在PBS(含有0.15％的吐温-20和0.5％的BSA)中稀释血清抗体，最终稀释为 1:1000-1:50000，并将50μl的稀释样品加入到板的每个孔中。大鼠抗MBP单克隆抗 体(ab7349，Abcam)用作对照。在37℃下将板温育1小时，用含有0.15％吐温-20 的PBS洗涤三次。在每个孔中，将缀合到1:4000稀释的辣根过氧化物酶(A9037， Sigma)的50μl的山羊抗完整的抗大鼠IgG加入到缓冲液中，在37℃下温育1小时。 用含0.15％吐温-20的PBS洗涤5次后，向每个孔中加入50μl四甲基联苯胺，并在暗 处保存5-15分钟。用50μl/孔的10％磷酸终止所述反应。使用酶标仪Varioscan(Thermo， 美国)测定OD₄₅₀值。

关于autoAb应答：在C57BL/6小鼠中鉴定一个免疫显性区域MBP(124-147)； 在SJL小鼠中鉴定两个免疫显性区域MBP(24-44)和MBP(72-139)；以及在DA 大鼠中鉴定两个免疫显性区域MBP(40-60)和MBP(107-170)。最后两个免疫显性 区域与人类MS方式相关联，包括两个片段MBP(43-64)和MBP(115-170)，说明 EAE诱导的DA大鼠中看到的免疫应答与人类MS的模型显著相关。选择三种肽用于 进一步分析：MBP(46-62)(“MBP1”)；MBP(124-139)(“MBP2”)；和MBP(147-170) (“MBP3”)，这些在MS患者和DA大鼠中最具免疫显性。重要的是，Bielekova等 人报道的高亲和性髓磷脂-特异性CD4+T细胞(Bielekova等，J Immunol 2004； 172:3893-904，其内容在此全文引入作为参考，用于所有目的)对与本研究中鉴定的 MBP片段重叠的MBP肽111-129和146-170具有反应性，证明了这些T-细胞和B- 细胞表位之间的交叉反应性。

实施例9MBP 63-81免疫的EAE DA大鼠释放识别致脑炎的和C-端MBP肽的抗 MBP自身抗体

以前，只有GPBP(62-84)，和GPBP(68-88)(在较小程度上)，显示出能够诱 导DA大鼠中的EAE(Miyakoshi A.等人，J Immunol 2003；170:6371-8)。然而，假 定致脑炎的MBP肽(81-104)在MS评估中起重要作用(Aharoni R.等人，J  Neuroimmunol 1998；91:135-46)，

可再生地导致C-端MBP片段和MBP致脑炎区域的高水平自身抗体的免疫方案 是所需要的。为了确保表位扩展(MS的标志)包括在啮齿动物模型的EAE发病机 理中，本研究使用的匀浆不含脊髓匀浆。

简单地说，DA大鼠用肽MBP(63-81)免疫，以便实现所需的EAE病理。对采 自免疫后DA大鼠的血清抗体的分析显示对三个MBP片段的自身抗体反应增强： MDHARHGFLPRH(SEQ ID NO:6)；QDENPVVHFFKNIV(SEQ ID NO:7)和 IFKLGGRDSRSGSPMARR(SEQ ID NO:8)。多克隆IgG抗MBP自身抗体的特异性 测定是根据与MBP表位库的结合和基于该肽重叠的假定的进一步理论计算(图2A)。 在EAE DA大鼠中没有鉴定出血清自身抗体针对MBP(63-81)的显著活性。由于 MBP(63-81)肽被用作抗原，这表明在DA大鼠中EAE进展期间包括表位扩散。这 一观察也是根据一个早先的发现：Sercarz等人确定MBP(62-75)(DA大鼠中主要 的致脑炎肽)是非免疫显性的(Sercarz EE等人，Annu Rev Immunol 1993；11:729-66， 其内容在此全文引入作为参考，用于所有目的)。

为了定量鉴定的MBP表位的autoAb(自动抗体)识别，并在体外确定它们的序 列，通过表面等离子体共振测定与免疫的DA大鼠隔离的多克隆血清抗MBP抗体对 生物素化MBP肽的亲和力(图2B)。所述全长MBP蛋白(1.5x10^-8)的有效解离常 数测定为纳摩尔级，MBP致脑炎片段和C-末端片段的解离常数也被测定为纳摩尔级， 分别为9.6x10^-9和8.4x10^-9，证实它们的同一性为主要的B细胞表位。与 MDHARHGFLPRH(SEQ ID NO:6)肽的结合未检出，因此，本研究进一步的评估中 排除了其作为EAE进展的生物标记。

所有表面等离子体共振测量均在BiaCore T-200仪器(GE Healthcare，美国)上 进行。生物素化MBP肽(50μg/ml)(列于图2中)和MBP分别固定在SA和CM-5 芯片上。所有步骤都是根据制造商的建议进行。在所有测量过程中，HBS-EP缓冲液 的流速保持在10μl/min。在两个芯片上测试抗体(50μg/ml)，标准结合/解离时间为 300/300s。使用BiaCore T-200评估软件1.0计算解离常数。

实施例10——施用包封在甘露糖基化SUV脂质体中的MBP衍生B细胞表位显 著改善了MS大鼠模型中的EAE

先前使用与本文提供的不同的包封髓磷脂自身抗原治疗Lewis大鼠的EAE(参 见，St Louis J.等，J Neuroimmunol 1997；73:90-100；以及Avrilionis和Boggs，J Neuroimmunol 1991；35:201-10，本参考文献的内容在此全文引入作为参考，以用于 各种目的)。同时，Nagelkerken组表明施用甘露糖基化APL M-PLP139-151诱导了对 SJL小鼠的EAE的肽特异性耐受性(Luca ME等，J Neuroimmunol 2005；160:178-87， 其内容在此全文引入作为参考，用于所有目的)。

最新鉴定的B细胞MBP肽抗原包封在表面具有甘露糖残基的小型单层囊泡 (SUV)脂质体中。该方法的主要优点是脂质体内部存在自然形态的免疫显性的未修 饰肽，而表面暴露的甘露糖增强了向抗原呈递细胞(APC)的递送。APC表面具有 高水平的甘露糖受体，从而增强甘露糖基化脂质体颗粒向细胞溶质内的胞吞作用 (Keler T.等，Expert Opin Biol Ther 2004；4:1953-62，其内容在此全文引入作为参考， 用于所有目的)。另一方面，施用缺乏甘露糖的阳离子脂质体可以显著增强抗体应答， 如Durova等描述的用于“抗HIV的疫苗”(Durova OM等，Mol Immunol 2009；47:87-95， 其公开在此全文引入作为参考，用于所有目的)，并且应该避免用于自身耐受性诱导。

脂质体由蛋磷脂酰胆碱(PC)和1摩尔％甘露糖基化DOG(ManDOG)的混合 物组装而成(Durova OM，同上)。SUV脂质体的组装如图3所示：(1)在有机溶剂 蒸发过程中形成不规则的脂质层，随后进行重新水合以形成若干层多层囊泡(MLV) 脂质体；(2)高压均化形成空SUV；(3)冻结干燥具有肽的SUV脂质体——该阶段 肽位于折叠SUV脂质体之间；以及(4)在第二次重新水合期间，将肽包封到SUV 脂质体中，平均直径约为60-100nm，其表面含有1.0％甘露糖残基。该研究使用了四 种制剂：各B细胞表位MBP肽(MBP、MBP2和MBP3)以及所有三种肽的混合物 (按质量比1:1:1)。

小型单层囊泡(SUV)由蛋磷脂酰胆碱(PC)和甘露糖基化DOG(Espuelas S. 等，Synthesis of an amphiphilic tetraantennary mannosyl conjugate and incorporation into  liposome carriers，2003Bioorg Med Chem Lett.，8月4日；13(15):2557-60，其内 容在此全文引入作为参考，用于所有目的)(1:100摩尔比)通过高压均化制备(Durova OM，同上)。简单地说，CHCl₃中的脂质混合物(100mg/ml)在真空下干燥，且重 悬于Milli-Q水中，使最终脂质浓度达到50mg/ml，然后进行高压均化(20000psi)。 产生的SUV与肽混合(脂质与肽的比率为330:1)且与过量的糖混合(乳糖与脂质的 比率为3:1)，随后冻结干燥。在控制条件下再水合后，产生的SUV脂质体通过离心 分离洗涤以除去未掺入物质。洗涤的球团重悬于PBS中以达到所需的剂量体积。根 据反相HPLC，使用施用在C18柱上的乙腈的线性梯度估计肽的掺入量。通过使用1 mM PBS或适当的介质将20μl分散体稀释至所需体积，在25℃下在Brookhaven  ZetaPlus分析仪上测定脂质体的z平均直径和zeta潜力。

为了测试四种制剂的治疗潜力，对呈现诱导EAE的DA大鼠，皮下注射四种甘 露糖基化脂质体制剂之一、醋酸格拉替雷(阳性对照)、游离的(未包封)MBP1肽 (阴性对照)以及空甘露糖基化脂质体(媒介物对照；表3)。

表3.该研究中涉及的脂质体特性和DA大鼠实验组。

第一次出现EAE临床症状时开始对每只大鼠进行治疗。如表4所示，使用脂质 体MBP1和MBP1/2/3肽制剂治疗显著降低EAE诱导的DA大鼠的最高和累积病症 评分。此外，与使用空脂质体媒介物治疗的组(3/17)相比，使用脂质体MBP肽治 疗的所有组的死亡率有所降低(MBP2SUV-1/11；所有MBP SUV-1/54)。使用游离 MBP1治疗的组中出现1例死亡(1/15)。

表4.包埋到甘露糖基化SUV脂质体中的MBP肽对DA大鼠中EAE进展的影响。

¹p<0.05从对照组观察到的统计学上的显著差异；用于非参数统计的单因素方差 分析：Wilcoxon

²p>0.05不能从对照组观察到的统计学上的显著差异；用于非参数统计的单因素 方差分析：Wilcoxon

³四分位差，圆括号()中的值。

为每一治疗组测定平均病症评分和神经胶质过多症/脱髓鞘比率，如图4所示。 可以看出，在初期发作中，使用MBP1脂质体制剂治疗最大程度地降低了最高病症评 分(图4A)。使用MBP2和MBP3脂质体制剂治疗限制了缓解期内病症的进展(图 4C和4D)。施用所有三种MBP肽的混合物的脂质体制剂显著改善了长期的EAE， 从而减轻总体疾病状况(图4E)。

使用游离MBP1肽治疗没有产生任何有益效果(图4G)，而醋酸格拉替雷治疗导 致类似于使用MBP1/2/3SUV制剂治疗(图4F)的EAE改善速率。然而，醋酸格拉 替雷治疗并不能使EAE在初期发作后完全恢复，正如使用脂质体MBP1/2/3SUV制 剂治疗的大鼠一样。这些数据与代表性苏木素与伊红染色以及计算的神经胶质过多症 /脱髓鞘评分一致(图4的右图)。此外，MBP1和MBP1/2/3SUV显著降低了中位数 最高病症和中位数累积病症评分，显示出其良好的治疗潜力(表4)。

实施例11——脂质体MBP肽通过下调Th1细胞因子以及诱导CNS中的BDNF产 生抑制EAE进展

为了研究使用脂质体包封的MBP肽治疗后EAE诱导的DA大鼠的免疫状态，对 于抗MBP抗体和CNS细胞因子染色，分析如实施例10中所述的与被治疗大鼠隔离 的血清(图5)。与使用媒介物阴性对照治疗的大鼠的血清相比，可以观察到，使用 脂质体包封的MBP肽治疗的大鼠的血清中抗MBP autoAb浓度显著降低(图5A)。 对所鉴定的主MBPB细胞表位，以及对全长MBP具有反应性的自身抗体具有特异性 的自身抗体的水平。值得注意的是，任何脂质体制剂中都不存在MBP(81-103)表 位，然而识别此表位的自身抗体浓度降至与识别全长MBP蛋白质的自身抗体的浓度 相同。因此，可以认为，血流中致病抗体的简单中和不能解释所观察到的作用。

由于B细胞和T细胞表位的重叠，本文所述MBP肽组合物可以通过涉及自体反 应T细胞的机制部分地起作用(Belogurov A.等，Bioessays 2009；31:1161-71，其内 容在此全文引入作为参考，用于各种目的)。为了研究这种可能性，在如实施例10(图 5B)所述被治疗的EAE诱导的DA大鼠样品上进行Th1细胞因子的染色。可以发现， 使用脂质体MBP肽制剂治疗的大鼠中的IL-2和IFNγ水平均明显下调(表5)，表明 所设计的制剂发挥了抗炎药物的功能。还可以观察到，使用脂质体MBP肽组合物治 疗的EAE诱导的DA大鼠中的脱髓鞘有所降低。该观察结果与产生的BDNF增多相 关(图5B)，这表明脂质体包埋的MBP肽通过功能类似于醋酸格拉替雷的机制起作 用，其是已知的上调BDNF表达(Aharoni R等，Proc Natl Acad Sci U S A 2003； 100:14157-62)。

表5.响应于脂质体包埋的MBP肽的施用的出现EAE的大鼠中的血清抗MBP 自身抗体滴度和CNS细胞因子状况。

组织学分析和细胞因子染色的方法如下。收集动物的脊髓，嵌入石蜡中，切成薄 片并用H&E和luxol坚牢蓝(LFB)染色。组织学参数如下：神经胶质过多症等级(评 分等级0-3；0代表不存在神经胶质过多症，1代表轻度神经胶质过多症(多达5-10 个细胞)，2代表中度神经胶质过多症(10-50个细胞/病灶)以及3代表重度神经胶质 过多症(多于50个细胞/病灶)。脱髓鞘评分等级分为0-3；0代表不存在脱髓鞘，1 代表轻度脱髓鞘，2代表中度脱髓鞘，以及3代表重度脱髓鞘。对IL-2、IFN和BDNF 细胞因子的染色根据制造商的方案进行。

本研究鉴定了EAE诱导的DA大鼠中的两个MBP免疫显性区域，这两个区域在 人MS患者中也被鉴定。当包封在甘露糖基化脂质体中时，施用这些免疫显性区域对 应的肽显著降低DA大鼠中的EAE，从而减轻初次发作并增强恶化的恢复。据发现， 这些组合物下调Th1细胞因子，诱导BDNF表达，并抑制抗MBP Ab的产生(表5)。 在不受理论约束的情况下，一种达到该治疗效果的可能的作用机制是，载有MBP肽 的脂质体表面存在的甘露糖残基增加APC细胞对脂质体包封的MBP肽的摄取，反过 来导致增加对髓磷脂碱性蛋白的耐受性和随后的病症改善的诱导。观察到的有益效 果，即脂质体包封的MBP片段具有DA大鼠中的病症进展，伴随EAE诱导的DA大 鼠和人类MS患者之间的免疫相似性，显示了MS治疗的新型治疗模式。

实施例12——MS大鼠模型中的脂质体包封的MBP肽的疗效(DA-EAE-28-01)

为了评价用于治疗MS的MBP B细胞表位肽，对EAE诱导的DA大鼠进行研 究。本研究的目的包括：1)确定MBP1肽的疗效；2)测定SUV包封是否能产生附 加的治疗效果；3)测定基于MSL的SUV制剂是否能产生附加的治疗效果；4)测定 加入MBP1的侧翼区是否能在SUV中的混合模式下产生附加的益处；5)测定加入 MBP1的侧翼区是否能在基于MSL的SUV中的混合模式下产生附加的益处；6)通 过使用雌性Dark Agouti(DA)大鼠中的急性EAE模型，比较SUV MSL制剂中的 MBP1/MBP1FL/MBP1FR活性。

被评估的七种制剂分别以冻干粉的形式提供，并在4℃下储存。按照表6，用注 射用水进行各组日剂量的再水合。MBP肽制剂重悬于注射用水中(Cure Medical)， 且用盐水将醋酸格拉替雷(Teva LTD)稀释至最终浓度达到150μg/mL。连续6天通 过皮下注射对每个受试动物施用测试制剂。

表6.正在调查研究中的用于MBP肽制剂的重悬方案。

9周龄的重125-145克的Dark Agouti(DA)雌性大鼠(Harlan Laboratories,Inc.) 被用作测试对象。在本研究中使用的动物到达时，检查它们的健康状态。只有健康状 况良好的动物适应实验室条件并被用于本研究。动物可自由采食蛋白质啮齿动物饲料 (Teklad)且可自由接近饮用水。将动物饲养在受控环境中，温度为20-24℃，相对 湿度为30-70％，以及光/暗周期为12小时/12小时。动物被随机分配到它们各自的测 试组。经伦理行为委员会(Committee for Ethical Conduct)审查后，这项研究在Care  and Use of Laboratory Animals of the Assaf Harofeh医学中心进行，Beer Yaakov，伦理 委员会编号：68/2009。

对于EAE的诱导，在与CFA，(IFA，Sigma)和1mg Mt以比率1:1混合的盐水 中，在大鼠尾巴的基部皮内注射总体积为200μl的含有50μg MBP(63-81) (ANASPEC)的接种物(strain H37RA；Difco Laboratories，Detroit，MI)。

免疫24小时后开始每日评估大鼠。在免疫后第8天，超过50％的大鼠出现麻痹 的迹象。显示MS症状的动物被分成9组，开始治疗。在治疗之前，从每组的两只大 鼠中收集血液。在免疫后的第9天和第10天，60只大鼠中的55只出现麻痹的迹象。

EAE诱导后7-10天，54只动物被分成9组(每组6只大鼠)，并在治疗开始前 从每组的两只大鼠中收集血液。根据表7，连续6天每天一次用制剂对每组大鼠进行 治疗。通过皮下注射到腹部侧面的下部区域中的方式施用该制剂。完成最后一次注射 24小时后，从所有大鼠中收集血液。在EAE诱导后第28天，保持和评估动物。在 研究期间，每天分配临床评分。EAE诱导后28天，处死动物，并从大鼠的心脏收集 血浆和血清。对动物灌注4％PFA，收集脑和脊髓，并将其固定在4％甲醛中。

表7.研究试验组和治疗方案。

在所有研究时期，分别观察动物，并每天记录临床症状一次。观察结果包括皮毛、 眼睛、呼吸速率、发声、麻痹、活动和行为模式的变化。按照表8中的标准，每天对 每只动物的MS相关麻痹迹象进行评分。在所有研究时期，每天测定每只动物的体重。 麻痹评分大于1的所有动物每天通过管饲法饲喂针头摄入2ml的水和2ml的再湿润 蛋白质啮齿动物饲料(Teklad)。

表8.研究试验组和治疗方案。

生存阶段的血液采集：从活大鼠的眼窝窦收集血液。将血液收集在两种类型的管 中：EDTA管和2mL微量离心管。通过ELISA进一步评估分离的每只动物的血浆和 血清中的细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ和TGF-β浓度。终止阶 段的血液采集：处死动物后，立即从大鼠的心脏收集血液，将血液收集在两种类型的 管中：EDTA管和2mL微量离心管。将血清和血浆分离，并储存在-20℃下。

在处死动物后，灌注0.5L的4％PFA。血液采集后，立即用20mL盐溶液洗涤 血管系统，并使用180-200mmHg经由右心室灌注0.5L的PFA。收集每只动物的脑 和脊髓，并将其固定在4％甲醛中。将组织进行修剪，包埋在石蜡中，切成具有大约 5微米的厚度，并用苏木素与伊红(H&E)和PAS染色。

结果

如表9中所总结，使用游离MBP1治疗的组(第1组；1/6)、(第2组；1/6)以 及(第3组；2/6)，使用醋酸格拉替雷治疗的组(第VIII组；2/6)，以及使用WFI 治疗的组(第IX组；2/6)出现死亡率。相反，使用MBP制剂治疗的组(分别为第 IV-VII组)没有大鼠死亡。

表9.54个EAE诱导的DA大鼠中的死亡率。

与其它组相比，在治疗后第3天和第4天，在使用甘露糖基化脂质体中的B细 胞表位肽MBP1/MBP1FL/MBP1FR的制剂治疗的大鼠中观察到统计上显著的麻痹评 分的降低(图6A；(x))。

在驯化期间，可以发现所有动物的体重增加都在通常预期值的范围内。在病症高 峰期，观察到所有组的动物出现体重减轻。病症高峰期后，所有组的动物出现体重增 加。对于任何体重测量，治疗组和对照组之间未发现统计上的显著差异(图7)。

治疗前后，用测试制剂治疗的组之间，IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ 和TGF-β水平上未检测到统计上的显著差异。用MBP肽制剂治疗的组和对照组之间 的细胞因子水平上的差异比较统计上不显著。

为了评估用制剂I-IX治疗的EAE诱导的大鼠中的髓鞘形成，一位病理学家盲目 地进行组织学研究，即，不知道哪些动物用何种物质治疗。将结果与未治疗动物的组 织学研究比较。

简单地说，所有载玻片用HE、碘酸雪夫氏(PAS)和坚牢蓝(LFB)染色剂染 色。选取组织学参数以表征损伤的性质。神经胶质过多症的评分为0-3，且根据下面 的标准进行评分：0＝无神经胶质过多症，1＝轻度神经胶质过多症(多达5-10个细 胞)，2＝中度神经胶质过多症(10-50个细胞/病灶)以及3＝严重神经胶质过多症 (多于50个细胞/病灶)。脱髓鞘的评分为0-3，且根据下面的标准进行评分：0＝无 脱髓鞘，1＝轻度脱髓鞘，2＝中度脱髓鞘以及3＝严重脱髓鞘。如果存在其它损伤 的话，也应注意。

对从每组随机选择的2只动物的脊髓的组织病理学分析显示所有被分析的大鼠 都存在神经胶质过多症。然而，与其它组的动物相比，在组IV中的动物(包封在甘 露糖基化脂质体中的MBP1/MBP1FL/MBP1FR)和组V中的一只大鼠(包封在未改 性的脂质体中的MBP1/MBP1FL/MBP1FR)中观察到髓鞘形成出现了明显改善。示例 性H&E染色模式如图8A-C中所示。

该研究表明，施用共同包封在甘露糖基化脂质体中的B细胞表位肽MBP1、 MBP1FL和MBP1FR导致MS啮齿动物模型中统计学上显著的麻痹减轻。本研究检 验了各种肽序列的疗效：脂质体(肽与脂质比率为1:330的条件下，1％摩尔甘露糖基 化脂质组合物)制剂中的MBP1、MBP1FL和MBP1FR。与各个单独的肽(第2、3、 6和7组)和阴性对照(第9组)相比，所有三种肽的脂质体制剂具有显著有效应答 (第4组)。通过比较，缺乏1％摩尔甘露糖脂质的脂质体组合物中的三种肽(第5 组与第4组)没有表现出显著的疗效，这表明通过加入甘露糖基化脂质增强了应答。 整体病症评分可与单独的MBP1肽(第1组)或脂质体制剂(第2组)相比；然而， 对从每组中随机选择的2只大鼠中采集的脊髓的神经胶质过多症和髓鞘形成的组织 病理学分析显示出低脱髓鞘评分，表明单独的MBP1肽的脂质体制剂具有改善的病理 结果(第2组)。通过施用所有三种MBP肽获得最好的(即最低的)脱髓鞘评分(第 4组)，还使整体病症评分得到明显改进。

实施例13——脂质体包封的MBP肽在MS大鼠模型中的疗效(DA-EAE-28-02)

为了进一步评估用于治疗MS的MBP B细胞表位肽，对EAE诱导的DA大鼠进 行研究。测试MBP肽MBP1、MBP1FL、MBP1FR、MBP2和MBP3的各种组合的甘 露糖基化脂质体制剂在MS EAE诱导的DA大鼠模型中的治疗潜力，如上所述。

八种MBP肽制剂分别以冻干粉的形式提供，并在4℃下储存。按照表10，每天 用注射用水进行各制剂的再水合。MBP肽制剂重悬于注射用水(Cure Medical)中， 且用盐水将醋酸格拉替雷(Teva LTD)稀释至最终浓度达到450μg/mL。连续6天通 过皮下注射对每只受试动物施用测试制剂。

表10.正在调查研究中的用于MBP肽制剂的重悬方案。

8-9周龄重110-145克的Dark Agouti(DA)雌性大鼠(Harlan Laboratories,Inc.) 被用作测试对象。在本研究中使用的动物到达时，检查它们的健康状态。只有健康状 况良好的动物适应实验室条件并被用于本研究。动物可自由采食饲料且可自由接近饮 用水。将动物饲养在受控环境中，温度为20-24℃，相对湿度为30-70％，以及光/暗 周期为12小时/12小时。动物被随机分配到它们各自的测试组。经伦理行为委员会 (Committee for Ethical Conduct)审查后，这项研究在Assaf Harofeh实验室动物护理 和使用(Care and Use of Laboratory Animals of the Assaf Harofeh)医学中心进行，Beer Yaakov，伦理委员会编号：830_b2451_6。

对于EAE的诱导，在与CFA，(IFA，Sigma)和1mg Mt以比率1:1混合的盐水 中，在大鼠尾巴的基部皮内注射总体积为200μl的含有50μg MBP(63-81) (ANASPEC)的接种物(strain H37RA；Difco Laboratories，Detroit，MI)。

免疫24小时后开始每日评估大鼠。在免疫后第9天，超过50％的大鼠出现麻痹 的迹象。显示MS症状的动物被分成9组，开始治疗。在治疗之前，从每组的两只大 鼠中收集血液。在免疫后的第9天和第11天，60只大鼠中的54只出现麻痹的迹象。

EAE诱导后9-11天，54只动物被分成10组(每组5-6只大鼠)，并在治疗开始 前从每组的两只大鼠中收集血液。根据表11，连续6天每天一次用制剂对每组大鼠 进行治疗。在EAE诱导后第28天，保持和评估动物。在研究期间，每天分配临床评 分。EAE诱导后28天，使用异氟烷处死动物。处死动物后，立即从大鼠的心脏收集 血液。将血清和血浆分离，并储存在-20℃下。对动物灌注4％PFA，收集脑和脊髓， 并将其固定在4％甲醛中。

表11.研究试验组和治疗方案。

在所有研究时期，分别观察动物，并每天记录临床症状一次。观察结果包括皮毛、 眼睛、呼吸速率、发声、麻痹、活动和行为模式的变化。按照表8中的标准，每天对 每只动物的MS相关麻痹迹象进行评分。在所有研究时期，每天测定每只动物的体重。 麻痹评分大于1的所有动物每天通过管饲法饲喂针头摄入2ml的水和2ml的再湿润 蛋白质啮齿动物饲料(Teklad)。

结果

如表12中所总结，使用游离的脂质体包封的MBP2治疗的组(第V组；1/6)， 使用醋酸格拉替雷治疗的组(第IX组；1/5)以及使用WFI治疗的组(第X组；1/5) 中每组有1只大鼠死亡。

表12.54只EAE诱导的DA大鼠中的死亡率。

与水对照组(第X组)相比，在治疗后第2天和第3天，在使用高剂量的脂质 体包封的MBP1肽治疗的大鼠(第IV组)中观察到统计上显著的麻痹评分的降低(图 10(Δ))。

在驯化期间，可以发现所有动物的体重增加都在预期值的范围内。在病症高峰期， 观察到所有组的动物出现体重减轻。病症高峰期后，所有组的动物出现体重增加。施 用脂质体包封的MBP肽的组和对照组之间未发现统计上的显著差异(图11)。

除第2组以外，该研究测试了单一脂质体制剂(1％摩尔甘露糖脂质组合物以及 1:330肽与脂质比率)，并且检测了各种B细胞表位MBP肽及其组合的疗效。值得注 意的是，与阴性对照相比，观察到用200μg(标称的)脂质体包封的MBP(46-62) 治疗的大鼠(第4组)出现统计上显著的麻痹减轻。此外，与醋酸格拉替雷治疗的大 鼠(第9组)相比，在治疗后第4天和第5天，观察到用200mg脂质体包封的MBP (46-62)治疗的大鼠(第4组)出现非统计上显著的麻痹差异(倾向)。

本研究中观察到的病症严重度状况具有明显的原发阶段和复发阶段。当比较用相 同剂量(50μg/天)的脂质体包封的单一MBP肽治疗的大鼠的结果时，发现在原发 病症阶段施用MBP(46-62)(第III组)能获得最佳治疗效果，而在复发病症阶段施 用脂质体包封的MBP(124-139)(第V组)或MBP(147-170)(第VI组)能获得 最佳治疗效果。因为在两个阶段施用高剂量的脂质体包封的MBP(46-62)(第4组) 都是最有效的，所以并不认为该偏差是绝对的，并且其可以被肽剂量抵消。可能由于 每种肽各自的低剂量，含有多个MBP肽的脂质体制剂的治疗效果更难解释。关于在 不同的肽与脂质比率的条件下相同肽制剂的使用(比较第I组和第II组)，没有观察 到总体病症严重度评分的差异。

实施例14——脂质体包封的MBP肽在MS大鼠模型中的疗效(DA-EAE-28-05)。

为了进一步评估用于治疗MS的MBP B细胞表位肽，对EAE诱导的DA大鼠进 行研究。本研究的目的包括：1)进一步鉴定单独的MBP1和MBP1/2/3的脂质体制 剂在MS大白鼠模型中产生治疗效果；2)检测不同用量和肽与脂质比率的脂质体MBP 制剂的治疗作用。

四种被评估的MBP肽制剂分别以冻干粉的形式提供，并在4℃下储存。按照表 13，将每种制剂在注射用水中再水合。用盐水将醋酸格拉替雷(Teva LTD)稀释至最 终浓度达到720μg/mL。连续6天通过皮下注射对每只受试动物施用测试制剂。

表13正在调查研究中的用于MBP肽制剂的重悬方案。

8-9周龄的重110-145克的Dark Agouti(DA)雌性大鼠(Harlan Laboratories,Inc.) 被用作测试对象。在本研究中使用的动物到达时，检查它们的健康状态。只有健康状 况良好的动物适应实验室条件并被用于本研究。动物可自由采食饲料且可自由接近饮 用水。将动物饲养在受控环境中，温度为20-24℃，相对湿度为30-70％，以及光/暗 周期为12小时/12小时。动物被随机分配到它们各自的测试组。经伦理行为委员会 (Committee for Ethical Conduct)审查后，这项研究在Care and Use of Laboratory  Animals of the Science in action LTD进行，Rehovot.，伦理委员会编号：IL-10-11-109。

对于EAE的诱导，在与CFA，(IFA，Sigma)和1mg Mt以比率1:1混合的盐水 中，在大鼠尾巴的基部皮内注射总体积为200μl的含有50μg MBP(63-81) (ANASPEC)的接种物(strain H37RA；Difco Laboratories，Detroit，MI)。

免疫24小时后开始每日评估大鼠。在免疫后的第6-10天，50只大鼠中的42只 出现麻痹的迹象。显示MS症状的动物被分成7组(每组6只大鼠)，开始治疗。根 据表14，连续6天每天一次用制剂对每组大鼠进行治疗。通过皮下注射到腹部侧面 的下部区域中的方式施用该制剂。完成最后一次注射24小时后，从所有大鼠中收集 血液。在EAE诱导后第28天，保持和评估动物。在研究期间，每天分配临床评分。 EAE诱导后28天，处死动物，并从大鼠的心脏收集血浆和血清。对动物灌注4％PFA， 收集脑和脊髓，并将其固定在4％甲醛中。

表14.研究试验组和治疗方案。

在所有研究时期，分别观察动物，并每天记录临床症状一次。观察结果包括皮毛、 眼睛、呼吸速率、发声、麻痹、活动和行为模式的变化。按照表8中的标准，每天对 每只动物的MS相关麻痹迹象进行评分。在所有研究时期，每天测定每只动物的体重。

结果

在本研究中，EAE诱导后28天之前没有大鼠死亡。

与水对照组(第1组)相比，在治疗后第1-4天，在使用以下制剂治疗的大鼠中 观察到统计上显著的麻痹评分的降低：MBP1肽制剂(肽与脂质比率为1:330；第2 组)以及MBP1/2/3肽制剂(肽与脂质比率为1:330；第3组)和(肽与脂质比率为 1:110；第5组)(图12)。与水对照组(第1组)相比，观察到用醋酸格拉替雷治疗 的大鼠(第6组和第7组)出现非统计上显著的麻痹差异(倾向)。

在驯化期间，可以发现所有动物的体重增加都在预期值的范围内。在病症高峰期， 观察到所有组的动物出现体重减轻。病症高峰期后，所有组的动物出现体重增加。施 用脂质体包封的MBP肽的组和对照组之间未发现统计上的显著差异(图13)。

本研究表明，用脂质体配制的B细胞表位肽MBP1和共脂质体配制的B细胞表 位肽MBP1/2/3治疗能在MS大鼠模型中获得统计上显著的治疗效果。在肽与脂质的 比率较高时，MBP1/2/3的共制剂似乎比单独的MBP1肽能提供更好的治疗剂。相反， 在肽与脂质的比率较低时，单独的MBP1制剂似乎比MBP1/2/3共制剂能提供更好的 治疗剂。然而，在这两种情况下，脂质体配制的MBP1肽比醋酸格拉替雷(一种被批 准用于治疗复发缓解型多发性硬化的治疗剂)提供更好的治疗效果。

应当理解，在此描述的实施例和实施方式仅用于说明的目的，并且各种针对其 中的修改或变化对本领域的技术人员来说将是显而易见的且将被包括在本申请以及 所附权利要求的精神和范围中。在本文中引用的所有出版物、专利和专利申请在此全 文引入作为参考，以用于各种目的。