石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP及其编码基因在抗鱼类神经坏死病毒方面的应用

技术领域：

本发明属于基因工程领域，具体涉及石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP及其编码基因在抗鱼 类神经坏死病毒方面的应用。

背景技术：

翻译控制肿瘤蛋白(Tranlationally Controlled Tumor Protein,TCTP)，又称P21、P23以及 fortilin。对TCTP蛋白序列研究分析发现，TCTP蛋白亚基具有2个典型的特征序列，TCTP1 和TCTP2，并且带有一个微管结合区(Gachet et al.,1999)和Ca²⁺结合区域(Kim et al.,2000)。

石斑鱼，隶属于鲈形目(Perciformes)、鮨科(Settauida)、石斑鱼亚科(Epinephelina)。 广泛分布于印度洋和太平洋的热带海域，我国南海及东海南部均有分布，其中南海较多，常 年均可捕获，以春、夏季为渔获旺季。据鱼类学家研究记载，石斑鱼属种类较多，全世界有 400种以上，我国产的石斑鱼亚科有13属，79种，但目前仅有约6种石斑鱼可人工饲养，石 斑鱼肉质鲜美蛋白含量高，是一种经济价值很高的食用鱼类，也是我国创汇的优良鱼类品种 (陆忠康,1996)。从20世纪90年代开始，石斑鱼养殖进入了产业化养殖阶段。随着石斑鱼 饲养密度的增加，鱼体抵抗病原的侵袭和感染的能力有所降低，从而使一些鱼类疾病频繁爆 发，造成了重大的经济损失。由于病毒具有的独特生物学特性和鱼类特有的水生环境特点， 使得鱼类病毒性疾病具有很强的传染性、致病性和严重的破坏力，已经成为鱼类重要的致病 病源之一。鱼类神经坏死病毒(nervous necrosis virus，NNV)，是一种世界范围内流行的海水 鱼类病毒病，主要发生在海水鱼类种苗生产阶段，是近几年来石斑鱼苗种培育中危害最大的 病原，鱼苗死亡率高达90％以上，给石斑鱼养殖业的发展带来严重的危害。目前对鱼类病害 的防治，主要是采用抗生素和化学药物，造成了药物残留、耐药性及环境污染等严重问题。 为此，开展鱼类免疫抗病的基础研究及研制新型抗病基因工程制品已经成为当务之急。翻译 控制肿瘤蛋白TCTP广泛存在于动物、植物和真菌中，参与多种生物学过程，具有多种生物 学功能，如抗凋亡、抗病毒等(Thaw et al.,2001)，应用潜力很大。目前，石斑鱼TCTP对 神经坏死病毒的抗病毒作用还未见报道。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP在抗鱼类神经坏死病毒方面 的应用。本发明利用病毒滴度和实时定量PCR检测了石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP对NNV 病毒复制的抑制作用。

所述的石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的第二个目的是提供石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP的编码基因Ec-TCTP在抗鱼 类神经坏死病毒方面的应用。

所述的石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP的编码基因Ec-TCTP，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明是通过以下步骤来检测石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP及其编码基因对鱼类神经 坏死病毒复制的抑制作用的：

(1)、根据已知的石斑鱼Ec-TCTP基因cDNA全长序列，设计如下构建真核表达载体 的特异性引物：

pcDNA-TCTP-S：CCCAAGCTTATGATCATCTACAGGTGCA

pcDNA-TCTP-R：CGGGATCCTTAGCATTTCTCTTCCACCAG

引物pcDNA-TCTP-S含有限制性内切酶HindⅢ识别位点，pcDNA-TCTP-R含有限制性 内切酶BamHI识别位点；

(2)、提取石斑鱼肝脏组织RNA，并以RNA为模板用反转录酶合成cDNA，再以石斑 鱼cDNA为模板，采用步骤(1)中设计的特异性引物，在PCR扩增体系中对Ec-TCTP基因 的cDNA进行扩增，同时回收纯化Ec-TCTP基因片段；

(3)、使用HindⅢ和BamHI对步骤(2)纯化得到的Ec-TCTP基因片段进行双酶切获 得带有两个酶切位点的Ec-TCTP基因，同时用HindⅢ和BamHI对真核表达载体pcDNA3.1 进行双酶切，连接转化大肠杆菌，抽质粒进行PCR和双酶切检测，确定真核重组表达载体构 建成功；

(4)、培养石斑鱼脑细胞(GB)，转染去内毒素质粒pcDNA3.1和pcDNA3.1-Ec-TCTP， 用G418筛选过表达细胞系；

(5)、NNV感染稳定筛选的细胞系，于12和24小时收集样品，提取RNA，反转录成 cDNA，利用实时定量PCR检测Ec-TCTP对NNV病毒复制的作用，同时检测病毒滴度变化。

所述的真核表达载体为pcDNA3.1。

本发明的石斑鱼Ec-TCTP是一种具有抗病毒功能的翻译控制肿瘤蛋白基因，用该基因构 建真核表达载体，并将表达载体通过转染方法导入石斑鱼脑细胞中，得到能过量表达Ec-TCTP 的稳定细胞，具有提高细胞对病毒感染的耐受能力；经实验证明了石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白 确实具有抑制RNA病毒复制的特点，石斑鱼Ec-TCTP基因克隆和功能分析的研究将对进一 步研究和开发抗病功能蛋白具有重要的科学价值和应用价值。

附图说明：

图1为石斑鱼肝组织RNA电泳检测图，1和2泳道为RAN；

图2为Ec-TCTP基因扩增电泳图，M为DL2000，1-7泳道为PCR产物；

图3为真核重组表达载体pcDNA3.1-Ec-TCTP PCR检测电泳图，M为DL2000，1-3泳 道为菌落PCR产物，4泳道为对照；

图4为稳定筛选GB细胞系，1为GB细胞，2为稳定筛选pcDNA3.1细胞系，3为稳定 筛选pcDNA3.1-Ec-TCTP细胞系；

图5为PCR检测稳定筛选细胞系，1为对照，2为pcDNA3.1，3为pcDNA3.1-Ec-TCTP；

图6为病毒滴度检测Ec-TCTP基因对病毒复制的影响，其中，pcDNA3.1和 pcDNA3.1-Ec-TCTP的显著性差异用one-way ANOVA分析，分别用**表示(p<0.01)(N ＝3)；

图7为NNV感染稳定筛选细胞系后的RNA检测图，1-2为pcDNA3.1细胞系12和24 小时样品，3-4为pcDNA3.1-Ec-TCTP细胞系12和24小时样品；

图8为NNV病毒CP和RdRp基因的表达，其中，A为NNV病毒CP基因的表达，B 为NNV病毒RdRp基因的表达；pcDNA3.1和pcDNA3.1-Ec-TCTP的显著性差异用one-way  ANOVA分析，分别用**表示(p<0.01)(N＝3)。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制.

实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚 合酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，感受态细胞、宿 主菌及质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂和反转录 酶购自invitrogen公司，其余试剂均为国产分析纯；PCR仪为Veriti^TM 96孔PCR仪购自ABI(美 国Applied Biosystems by Life Technologies)仪器，琼脂糖电泳系统购自北京六一仪器厂，蛋白 质电泳购自BiaRad。抗生素及培养基等均为分子生物学以及基因工程实验室常用国产试剂。

所有引物序列均在英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。本发明实施例中所用方法如无 特别说明均为常规方法。

实施例1：

真核重组表达载体pcDNA3.1-Ec-TCTP的构建

首先根据已经报道的TCTP序列(JN413677)，设计一对引物，并以石斑鱼肝组织提取 RNA，反转录cDNA为模板扩增，PCR扩增得到Ec-TCTP基因的序列，回收并纯化Ec-TCTP 全长基因片段；利用HindIII和BamHI对空载体pcDNA3.1进行双酶切，回收纯化Ec-TCTP 基因片段以及载体大片段pcDNA3.1，然后连接、化学法转化DH5α菌株获得重组质粒 pcDNA3.1-Ec-TCTP。具体构建过程如下：

一、石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP基因Ec-TCTP的cDNA扩增

1、RNA提取

根据实验室已经报道的Ec-TCTP(JN413677)基因cDNA全长序列，设计如下构建真核 重组表达载体的特异性引物：

pcDNA-TCTP-S：CCCAAGCTTATGATCATCTACAGGTGCA

pcDNA-TCTP-R：CGGGATCCTTAGCATTTCTCTTCCACCAG

下划线标注分别为酶切位点HindIII和BamHI。

同时以石斑鱼肝组织为材料，使用Trizol法提取总RNA，具体操作如下：用液氮将0.1g 石斑鱼肝组织研磨成粉末以后，加入1ml Trizol提取液，室温放置5min，使其充分裂解，再 加入氯仿，振荡混匀15分钟，室温放置15min。4℃12000g离心15min。加入0.5ml异丙醇 混匀，室温放置5-10min。4℃12000g离心10min，加入1ml 75％乙醇，温和振荡离心管，悬 浮沉淀。4℃8000g离心5min，室温晾干。加入50ul DEPC H₂O待溶解充分后测O.D值定量 RNA浓度。RNA提取的结果如图1所示。

2、cDNA合成

以RNA为模板，用III反转录酶合成cDNA，具体步骤为：总RNA 2μl (约5μg)、Oligo(d T)₂₀1μl、10mM dNTP 1μl、DEPC处理水补足总体积13μl；65℃处 理5min后，转至冰上10min；加入5×第一链缓冲液4μl、0.1MDTT 1μl、RNA酶抑制剂1μl， 1μl反转录酶(invitrogen)，25度5min后，50℃反应60min后；70℃15min使反转录酶失活， 得到cDNA序列。

3、扩增Ec-TCTP基因的cDNA序列

以反转录总cDNA为模板、使用引物pcDNA-TCTP-S和pcDNA-TCTP-R进行PCR扩增 Ec-TCTP基因。PCR的20μl体系为：Ex-Taq缓冲液(10×)2.5μl、Ex-Taq0.2μl、cDNA模 板1μl、10mM dNTP 0.4μl、10μM pcDNA-TCTP-S引物1μl、10μM pcDNA-TCTP-R引物1μl、 使用ddH₂O补足20μl。反应条件为：94℃2min，30个循环，94℃变性30s，60℃退火30s， 72℃有延伸30s，72℃反应5min。将PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳 检测(如图2所示)。

电泳后，对目的条带进行回收，回收使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Axygen DNA片段纯 化试剂盒)具体操作步骤参照产品说明书。取3μl用于琼脂糖凝胶电泳检测。

二、回收DNA片段后，使用BamHI和HindIII对质粒pcDNA3.1和目的片段进行双酶 切分别获得Ec-TCTP基因和pcDNA3.1双酶切片段，电泳回收纯化后，分别在16℃连接16h， 获得真核重组表达载体pcDNA3.1-Ec-TCTP。

具体操作如下：向0.5ml的离心管中分别加入质粒DNA(100ng/μl)2μl、BamHI (Takara)0.5μl、HindIII 0.5μl、10×K buffer 2μl，使用ddH2O补足20μl；37℃反应8h；使 用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收Ec-TCTP基因和pcDNA3.1载体，将回收片段进行连接， 其具体步骤为：Ec-TCTP DNA 3μl(约300ng)、pcDNA3.1载体1μl(100ng/μl)、Ligation  Solution I 4μl，金属浴中16℃过夜连接。

使用化学法将pcDNA3.1-Ec-TCTP大肠杆菌DH5α中，具体步骤为：将感受态大肠杆菌 大肠杆菌DH5α 100μl加入6μl质粒体系中；混合液冰浴20min，42℃热刺激90s，冰浴2 min；加入900μl SOC液体培养基，37℃、150rpm摇床培养60min；然后在超净台上吸取 300μl转入带有Amp抗性、IPTG、X-Gal的LB平板上，用无菌三角玻璃棒涂布均匀；37℃ 过夜培养；挑取白斑于加有Amp抗性液体LB培养基中37℃、200rpm摇床培养12h；提取 质粒，进行电泳检测。利用引物pcDNA-TCTP-S和pcDNA-TCTP-R对菌液进行PCR扩增， 所有扩增条件和之前菌落PCR相同(结果如图3所示)。

过量表达Ec-TCTP稳定细胞系的筛选

1、细胞培养

(1)、冻存细胞的复苏：石斑鱼脑细胞GB细胞株保存于液氮之中，在使用之前，从液 氮中取出，并且将其转移到培养液中培养。实验准备：将水浴锅温度调至37℃，将有血清的 培养液(即完全培养液)置于其中预热。并且在记录本中查到所要复苏的细胞存于液氮罐中 的位置；准备好超净台内的所需的一些仪器。从液氮罐中取出所要的细胞，立即置于37℃水 浴锅中，使其快速解冻；将冻存管及培养液瓶外表面用75％酒精擦拭后放入超净工作台；将 细胞悬液移到10ml离心管中，并加入2-3ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，用封口膜密封； 1000rpm离心3min；吸去上清，加入2-3ml培养液，吹打均匀，使细胞悬浮；将细胞悬液移 到25cm²培养瓶，补加少量培养液；拧松培养瓶盖，置于25℃的培养箱中培养。

(2)、细胞的传代：培养的细胞生长到一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代 谢物逐步积累(可见到培养液变黄)，并且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的 继续生存，这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，进行传代。将消化液和培养液从冰 箱中取出，37℃解冻和预热；吸出培养液，缓缓加入约1.5ml的消化液；置于37℃消化2-5min， 期间在显微镜下观察，消化至细胞收缩变圆、部分脱落即可加入约4ml消化液终止消化，防 止消化过度；用吸管轻轻吹洗培养瓶有细胞的一面，以使细胞脱落干净，将细胞悬液转移至 10ml离心管内，密封；1000rpm离心3min，期间用培养液再清洗一下培养瓶；吸去上清，加 入约2ml培养液，吹打均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中，置于培养箱中培养。

(3)、细胞的冻存：当细胞生长到一定程度的时候，可以将一部分冻存起来，长期保存， 以备下次需要用的时候可以使用。将冻存液、消化液和培养液从冰箱中取出，37℃解冻和预 热；细胞经过消化、离心收集；大约10⁶个细胞加入1ml冻存液，用吸管吹打，使细胞分散 成单细胞悬液；加入到冻存管中，通常1.8ml的冻存管不加超过1.5ml的细胞悬液；在冻存 管上标明细胞名称和冻存日期，用纱布包裹后，置于4℃0.5h，然后置于-20℃2h，再置于 -80℃过夜；第二天将细胞置于液氮中；记下冻存管存放的位置，作好冻存记录。

2、重组质粒的转染

(1)铺板：传代三到四次后达到细胞良好的状态的时候，可以按照约1×10⁵个细胞/孔的 细胞密度接种于24孔板中。将消化液和培养液从冰箱中取出，37℃解冻和预热；吸出培养液， 缓缓加入约1.5ml的消化液；置于37℃消化2-5min，期间在显微镜下观察，消化至细胞收缩 变圆、部分脱落即可加入两吸管消化液终止消化，防止消化过度；用吸管轻轻吹洗培养瓶有 细胞的一面，以使细胞脱落干净，将细胞悬液转移至10ml离心管内，密封；1000rpm离心3min， 期间用培养液再清洗一下培养瓶；吸去上清，加入约2ml培养液，吹打均匀，吸取10μl到 细胞计数板上，在显微镜下计数，并且计算细胞的密度；预先在孔中放入一块1cm×1cm的 盖玻片；用完全培养液稀释细胞悬液，在24孔板的每个孔加入0.5ml。

(2)转染：铺板过后大约24h，细胞完全贴壁，且密度达到大约70％的时候，即可以进 行转染，转染的时候，在50μl稀释液中加入0.8-1μg的质粒；在50μl稀释液中加入2μl的 Lipofectamine2000，轻轻地吹打均匀，在室温下放置5min；将质粒稀释液和脂质体稀释液混 合，轻柔吹打均匀，室温下放置20min；吸去24孔板每个孔中的细胞培养液，沿孔壁加入 0.5ml的无血清培养液；将混合液加入到每个加了无血清培养液的孔中，每个孔约加100μl， 轻柔晃动，使之混合；放在25℃的培养箱中培养6-8h后将无血清培养液更换成完全培养液。

3、筛选稳定表达细胞系

利用引物pcDNA-TCTP-S和pcDNA-TCTP-R构建了Ec-TCTP基因的真核重组表达质粒 pcDNA3.1-Ec-TCTP。采用去内毒素质粒微量提取试剂盒(Omega,USA)提取真核表达重组 质粒和空载体质粒pcDNA3.1(+)，然后使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)将所提取的 质粒分别转染培养在24孔板中的GB细胞，转染后48h，将转染的细胞按1:3的比例稀释后 传代，并在培养液中加入终浓度为800μg/mL G418(Amresco)进行筛选培养。每隔3天更 换培养液一次，按上述浓度加入G418继续筛选。经过约4周的筛选培养后，用PCR方法进 行稳定转染细胞的检测，引物采用载体pcDNA3.1的通用引物T7和BGH，结果如图4所示。 筛选得到的稳定细胞系分别命名为pcDNA3.1-Ec-TCTP和pcDNA3.1，结果如图5所示。

T7：TAATACGACTCACTATAGGG

BGH：TAGAAGGCACAGTCGAGGC

石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP对病毒复制的影响实验

将稳定细胞系pcDNA3.1-Ec-TCTP和pcDNA3.1传至24孔板，每孔接种约1×10⁵个细胞。 16-24h后，细胞长满单层。弃去培养液，每孔接入0.5MOI的NNV，置于25℃下吸附1h， 期间每隔15min轻轻摇动细胞板一次。吸附完毕后，弃去孔中病毒，然后用新鲜培养基500 μl漂洗一次，接着加入培养基后继续培养。在感染后12和24h，分别收取感染后的细胞培养 物，每个时间点实验组和对照组分别收取三个重复孔，然后置于-20℃冻存。将收取的样品冻 融三次，然后采用TCID50方法对其滴度进行测定(如图6所示)。同时，收取平行实验样 品用于后续总RNA提取(如图7所示)，检测病毒核心基因转录情况(如图8所示)。