由穿山龙和刺五加为药材的中药复方制剂中6个化学成分的定量分析方法

技术领域

本发明涉及一种中药复方制剂中6个化学成分的定量分析方法。

背景技术

由穿山龙和刺五加为药材的中药复方制剂主要药效成分包括薯蓣皂苷(薯蓣皂苷元)、延 龄草苷、甲基薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷、紫丁香苷(刺五加苷B)、刺五加苷E、 异嗪皮啶、槲皮素、绿原酸、紫丁香树脂苷等。众所周知，中药复方制剂均以多种有效成分共 同发挥药效作用，现有的质控标准多以单一成分的含量为指标来评价中药质量，难以体现生产 过程中多种有效成分的转移情况，质量难于控制。薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷和伪原薯蓣皂苷属于 甾体皂苷，其紫外吸收属于末端吸收，紫外检测条件下色谱峰基线波动很大，溶剂峰对目标峰 造成很大的干扰，由于中药复方制剂的复杂性，采用二极管阵列检测器(DAD)检测方法无 法使目标峰与杂质峰达到基线分离。而异嗪皮啶、紫丁香苷和绿原酸由于其结构不具有选择性， 采用蒸发光散射检测器(ELSD)无法有效分离，且响应很小。

目前将甾体皂苷类化合物与有机酸和黄酮类同时进行定量测定未见文献报道。本方法将双 波长DAD检测和ELSD检测串联使用，将由穿山龙和刺五加为药材的中药复方制剂预处理制 成待测样品，待测样品注入高效液相色谱仪进行检测，获得待测样品的高效液相色谱图；根据 待测样品和各个对照品的高效液相色谱图中相应吸收峰的峰面积，以外标法计算待测样品中薯 蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、绿原酸、紫丁香苷和异嗪皮啶的含量。

发明内容

本发明的目的是提供由穿山龙和刺五加为药材的中药复方制剂中6个化学成分的定量分 析方法。

本发明的技术方案概述如下：

由穿山龙和刺五加为药材的中药复方制剂中6个化学成分的定量分析方法,包括如下步 骤：

(1)配制混合对照品溶液：取薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、绿原酸、紫丁香苷和 异嗪皮啶对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含145μg薯蓣皂苷、231μg伪原薯蓣皂 苷、245μg原薯蓣皂苷、81μg绿原酸、57μg紫丁香苷和95μg异嗪皮啶的混合对照品溶液；

(2)配制第一种供试品溶液：取由穿山龙和刺五加为药材的中药复方制剂，研细，过四号筛， 取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为70％～90％的甲醇水溶液10mL， 称定重量，在功率120W、频率40kHz的条件下超声处理50-60min，放冷至室温，再称定重量， 用体积浓度为70％～90％的的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(3)含量测定：分别取步骤(1)获得的混合对照品溶液和步骤(2)获得的第一种供试品溶 液在高效液相色谱检测条件为：C₁₈键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈和体积浓度为0.1％～ 0.5％的甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，检测器为二极管阵列检测器与蒸发光散射检测器联 用进行高效液相色谱检测，获得混合对照品溶液和第一种供试品溶液的高效液相色谱图，以外 标法计算供试品中伪原薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、绿原酸、紫丁香苷和异嗪皮啶的含量；另取步 骤(2)获得的第一种供试品溶液，用体积浓度为70％～90％的甲醇水溶液稀释10倍，在高效 液相色谱检测条件为：C₁₈键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈和体积浓度为0.1％～0.5％的甲 酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，检测器为蒸发光散射检测器进行高效液相色谱检测，获得第 二种供试品溶液的高效液相色谱图，以外标法计算供试品中薯蓣皂苷的含量；所述乙腈用A 表示，所述体积浓度为0.1％～0.5％的甲酸水溶液用B表示。

所述制剂优选为胶囊剂、片剂或颗粒剂。

所述甲醇水溶液的体积浓度优选为85％。

所述甲酸溶液的体积浓度优选为0.1％。

.步骤(3)中梯度洗脱的条件优选为0-10min，12％-15％A；10-20min，15％-25％A；20-30min， 25％-30％A；30-50min，30％-40％A；50-55min，40％-55％A；55-60min，55％A；60-64min， 55％-60％A。

步骤(3)中色谱柱的填充剂的粒径优选为5μm。

步骤(3)中流动相的流速优选为1.0mL/min。

步骤(3)中色谱柱的柱温优选为26℃。

步骤(3)中二极管阵列检测器的检测波长优选为：紫丁香苷254nm，异嗪皮啶和绿原酸 350nm。

步骤(3)中蒸发光散射检测器检测条件优选为：载气流速1.8L/min、蒸气温度为100℃、 雾化温度为40℃。

本发明的方法同时测定由穿山龙和刺五加为药材的中药复方制剂中薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂 苷、原薯蓣皂苷含量、绿原酸、紫丁香苷和异嗪皮啶六种成分含量，可以提高中药复方制剂的 质量控制水平。该方法含量测定方法学验证完全符合要求，本发明的方法操作简便快速，准确 度高、重复性好，可以提高产品的质控水平，能节约检测时间和检测成本。

附图说明

图1是薯蓣皂苷对照品浓度对数与峰面积响应值对数线性关系图；

图2是原薯蓣皂苷对照品浓度对数与峰面积响应值对数线性关系图；

图3是伪原薯蓣皂苷对照品浓度对数与峰面积响应值对数线性关系图；

图4是紫丁香苷对照品浓度与峰面积响应值线性关系图；

图5是绿原酸对照品浓度与峰面积响应值线性关系图；

图6是异嗪皮啶对照品浓度与峰面积响应值线性关系图；

图7是混合对照品溶液的HPLC色谱图，峰a为紫丁香苷，峰b为绿原酸，峰c为异嗪 皮啶，峰d为原薯蓣皂苷，峰e为伪原薯蓣皂苷，峰f为薯蓣皂苷；

图8是方法学验证中专属性考察缺穿山龙阴性对照溶液色谱图，峰a为紫丁香苷，峰b 为绿原酸，峰c为异嗪皮啶；

图9是方法学验证中专属性考察缺刺五加阴性对照溶液色谱图，峰d为原薯蓣皂苷，峰 e为伪原薯蓣皂苷，峰f为薯蓣皂苷；

图10是供试品溶液的HPLC色谱图，峰a为紫丁香苷，峰b为绿原酸，峰c为异嗪皮啶， 峰d为原薯蓣皂苷，峰e为伪原薯蓣皂苷，峰f为薯蓣皂苷；

具体实施方式

由穿山龙和刺五加为药材的中药复方制剂，按质量比为1.5:1的比例称取穿山龙和刺五加， 其中的穿山龙是经水提醇沉后获得的提取物，刺五加用75％乙醇溶液回流提取后获得提取物， 两种提取物合并后浓缩干燥成干浸膏，按干浸膏与药用辅料(磷酸氢钙、硬脂酸镁等)的质量比 为10:1的比例按常规技术制备成胶囊剂、片剂或颗粒剂。

本发明选用Agilent 1260高效液相色谱仪、1260DAD检测器、380-ELSD检测器、Chem  Station色谱工作站。上述仪器的具体型号仅是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发 明，但并不对本发明作任何限制。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

由穿山龙和刺五加为药材的中药复方胶囊剂中6个化学成分的定量分析方法，包括如下步 骤：

(1)配制混合对照品溶液：取薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、绿原酸、紫丁香苷和 异嗪皮啶对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含145μg薯蓣皂苷、231μg伪原薯蓣皂 苷、245μg原薯蓣皂苷、81μg绿原酸、57μg紫丁香苷和95μg异嗪皮啶的混合对照品溶液；

(2)配制第一种供试品溶液：取由穿山龙和刺五加为药材的中药复方胶囊剂，除去胶囊壳， 研细，过四号筛，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为85％的甲醇水 溶液10mL，称定重量，在功率120W、频率40kHz的条件下超声处理50min，放冷至室温， 再称定重量，用体积浓度为85％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(3)含量测定：分别取步骤(1)获得的混合对照品溶液和步骤(2)获得的第一种供试品溶 液在高效液相色谱检测条件为：C₁₈键合硅胶为填充剂的色谱柱，填充剂的粒径为5μm，色谱 柱的柱温为26℃，以乙腈和体积浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，乙腈用A 表示，体积浓度为0.1％的甲酸水溶液用B表示；梯度洗脱的条件为0-10min，12％-15％A； 10-20min，15％-25％A；20-30min，25％-30％A；30-50min，30％-40％A；50-55min，40％-55％A； 55-60min，55％A；60-64min，55％-60％A；流动相的流速为1.0mL/min；检测器为二极管阵列 检测器与蒸发光散射检测器联用进行高效液相色谱检测，二极管阵列检测器的检测波长为：紫 丁香苷254nm，异嗪皮啶和绿原酸350nm，蒸发光散射检测器检测条件为：载气流速1.8L/min、 蒸气温度为100℃、雾化温度为40℃，获得混合对照品溶液和第一种供试品溶液的高效液相色 谱图，以外标法计算供试品中伪原薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、绿原酸、紫丁香苷和异嗪皮啶的含 量；另取步骤(2)获得的第一种供试品溶液，用体积浓度为85％的甲醇水溶液稀释10倍得到 第二种供试品溶液，在高效液相色谱检测条件为：C₁₈键合硅胶为填充剂的色谱柱，填充剂的 粒径为5μm，色谱柱的柱温为26℃，以乙腈和体积浓度为0.1％甲酸水溶液为流动相进行梯度 洗脱，乙腈用A表示，体积浓度为0.1％的甲酸水溶液用B表示；梯度洗脱条件为0-10min， 12％-15％A；10-20min，15％-25％A；20-30min，25％-30％A；30-50min，30％-40％A；50-55min， 40％-55％A；55-60min，55％A；60-64min，55％-60％A；流动相的流速为1.0mL/min；检测器 为蒸发光散射检测器进行高效液相色谱检测，蒸发光散射检测器检测条件为：载气流速 1.8L/min、蒸气温度为100℃、雾化温度为40℃，获得第二种供试品溶液的高效液相色谱图， 以外标法计算供试品中薯蓣皂苷的含量。

实施例2

由穿山龙和刺五加为药材的中药复方包糖衣片剂中6个化学成分的定量分析方法，包括如 下步骤：

(1)配制混合对照品溶液：同实施例1步骤(1)；

(2)配制第一种供试品溶液：取由穿山龙和刺五加为药材的中药复方包糖衣片剂，除去糖衣， 研细，过四号筛，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为70％的甲醇水 溶液10mL，称定重量，在功率120W、频率40kHz的条件下超声处理55min，放冷至室温， 再称定重量，用体积浓度为70％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(3)含量测定：分别取步骤(1)获得的混合对照品溶液和步骤(2)获得的第一种供试品溶 液在高效液相色谱检测条件为：C₁₈键合硅胶为填充剂的色谱柱，填充剂的粒径为5μm，色谱 柱的柱温为26℃，以乙腈和体积浓度为0.3％的甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，乙腈用A 表示，体积浓度为0.3％的甲酸水溶液用B表示；梯度洗脱的条件为0-10min，12％-15％A； 10-20min，15％-25％A；20-30min，25％-30％A；30-50min，30％-40％A；50-55min，40％-55％A； 55-60min，55％A；60-64min，55％-60％A；流动相的流速为1.0mL/min；检测器为二极管阵列 检测器与蒸发光散射检测器联用进行高效液相色谱检测，二极管阵列检测器的检测波长为：紫 丁香苷254nm，异嗪皮啶和绿原酸350nm，蒸发光散射检测器检测条件为：载气流速1.8L/min、 蒸气温度为100℃、雾化温度为40℃，获得混合对照品溶液和第一种供试品溶液的高效液相色 谱图，以外标法计算供试品中伪原薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、绿原酸、紫丁香苷和异嗪皮啶的含 量；另取步骤(2)获得的第一种供试品溶液，用体积浓度为70％的甲醇水溶液稀释10倍，得 到第二种供试品溶液，在高效液相色谱检测条件为：C₁₈键合硅胶为填充剂的色谱柱，填充剂 的粒径为5μm，色谱柱的柱温为26℃，以乙腈和体积浓度为0.3％甲酸水溶液为流动相进行梯 度洗脱，乙腈用A表示，体积浓度为0.3％的甲酸水溶液用B表示；梯度洗脱条件为0-10min， 12％-15％A；10-20min，15％-25％A；20-30min，25％-30％A；30-50min，30％-40％A；50-55min， 40％-55％A；55-60min，55％A；60-64min，55％-60％A；流动相的流速为1.0mL/min；检测器 为蒸发光散射检测器进行高效液相色谱检测，蒸发光散射检测器检测条件为：载气流速 1.8L/min、蒸气温度为100℃、雾化温度为40℃，获得第二种供试品溶液的高效液相色谱图， 以外标法计算供试品中薯蓣皂苷的含量。

实施例3

由穿山龙和刺五加为药材的中药复方颗粒剂中6个化学成分的定量分析方法，包括如下步 骤：

(1)配制混合对照品溶液：同实施例1步骤(1)；

(2)配制第一种供试品溶液：取由穿山龙和刺五加为药材的中药复方制剂颗粒剂，研细，过 四号筛，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为90％的甲醇水溶液10mL， 称定重量，在功率120W、频率40kHz的条件下超声处理60min，放冷至室温，再称定重量， 用体积浓度为90％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(3)含量测定：分别取步骤(1)获得的混合对照品溶液和步骤(2)获得的第一种供试品溶 液在高效液相色谱检测条件为：C₁₈键合硅胶为填充剂的色谱柱，填充剂的粒径为5μm，色谱 柱的柱温为26℃，以乙腈和体积浓度为0.5％的甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，乙腈用A 表示，体积浓度为0.5％的甲酸水溶液用B表示；梯度洗脱的条件为0-10min，12％-15％A； 10-20min，15％-25％A；20-30min，25％-30％A；30-50min，30％-40％A；50-55min，40％-55％A； 55-60min，55％A；60-64min，55％-60％A；流动相的流速为1.0mL/min；检测器为二极管阵列 检测器与蒸发光散射检测器联用进行高效液相色谱检测，二极管阵列检测器的检测波长为：紫 丁香苷254nm，异嗪皮啶和绿原酸350nm，蒸发光散射检测器检测条件为：载气流速1.8L/min、 蒸气温度为100℃、雾化温度为40℃，获得混合对照品溶液和第一种供试品溶液的高效液相色 谱图，以外标法计算供试品中伪原薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、绿原酸、紫丁香苷和异嗪皮啶的含 量；另取步骤(2)获得的第一种供试品溶液，用体积浓度为90％的甲醇水溶液稀释10倍，得 到第二种供试品溶液，在高效液相色谱检测条件为：C₁₈键合硅胶为填充剂的色谱柱，填充剂 的粒径为5μm，色谱柱的柱温为26℃，以乙腈和体积浓度为0.5％甲酸水溶液为流动相进行梯 度洗脱，乙腈用A表示，体积浓度为0.5％的甲酸水溶液用B表示；梯度洗脱条件为0-10min， 12％-15％A；10-20min，15％-25％A；20-30min，25％-30％A；30-50min，30％-40％A；50-55min， 40％-55％A；55-60min，55％A；60-64min，55％-60％A；流动相的流速为1.0mL/min；检测器 为蒸发光散射检测器进行高效液相色谱检测，蒸发光散射检测器检测条件为：载气流速 1.8L/min、蒸气温度为100℃、雾化温度为40℃，获得第二种供试品溶液的高效液相色谱图， 以外标法计算供试品中薯蓣皂苷的含量。

表1是三个不同样品中的薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、绿原酸、紫丁香苷和异 嗪皮啶的含量表；

表1

实施例4

一种由穿山龙和刺五加为药材的中药复方制剂胶囊中薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷、原薯蓣皂 苷、绿原酸、紫丁香苷和异嗪皮啶六种成分的定量分析方法验证，包括如下步骤：

(1)配制对照品溶液：精密称取薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、绿原酸、异嗪 皮啶和紫丁香苷对照品适量，分别置于5mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至5mL，制成各对照品 浓溶液；精密吸取各对照品浓溶液适量于10mL容量瓶中，加甲醇制成每1mL含145μg薯蓣皂 苷、231μg伪原薯蓣皂苷、245μg原薯蓣皂苷、81μg绿原酸、57μg紫丁香苷和95μg异嗪 皮啶的混合对照品溶液；

(2)配制第一种供试品溶液；步骤同实施例1步骤(2)；配制第二种供试品溶液：取第 一种供试品溶液，用体积浓度为85％甲醇水溶液稀释10倍，即得；

(3)选用高效液相色谱仪、二极管阵列检测器、蒸发光散射检测器及色谱工作站配套使 用，分别检测供试品溶液和对照品溶液中的薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、绿原酸、 紫丁香苷和异嗪皮啶的色谱分析图；

线性关系的测定：分别精密吸取步骤(1)配制的各对照品浓溶液适量，混合并加甲醇定 容至10mL容量瓶中，制成每1mL含400μg薯蓣皂苷、630μg伪原薯蓣皂苷、450μg原薯蓣 皂苷、246μg绿原酸、245μg异嗪皮啶和400μg紫丁香苷的混合对照品溶液。精密吸取该混 合对照品溶液0.10、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00mL，分别置于5mL容量瓶中， 加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成系列混合对照品溶液。取上述系列混合对照品溶液各20μl 注入高效液相色谱仪。分别以薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷和原薯蓣皂苷峰面积值的对数为纵坐标， 各对照品溶液浓度(ug/mL)的对数为横坐标；分别以绿原酸、异嗪皮啶和紫丁香苷峰面积值为 纵坐标，各对照品溶液浓度(ug/mL)为横坐标，绘制曲线，如图1-6所示，经线性回归，得 到六种成分的回归方程(n＝6)，如表2所示。结果表明六种成分在各自的范围内线性关系良好。 表2是6种待测成分的回归方程、相关系数和线性范围表。

表2.

其次是精密度的测定：精密吸取步骤(1)配制的混合对照品溶液，连续进样6次，按本 色谱条件测定薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、绿原酸、紫丁香苷和异嗪皮啶对照品的 峰面积响应值，计算RSD；精密吸取第一种供试品溶液，连续进样6次，按本色谱条件测定 伪原薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、绿原酸、紫丁香苷和异嗪皮啶供试品的峰面积响应值，计算RSD； 精密吸取第二种供试品溶液，连续进样6次，按本色谱条件测定薯蓣皂苷供试品的峰面积响应 值，计算RSD；表3是连续进样6次混合对照品溶液的峰面积响应值情况表；表4是连续进 样6次供试品溶液的峰面积响应值情况表；

表3.

表4.

稳定性的测定：分别精密吸取配制后0、2、4、6、12、24h的第一种供试品溶液和第二种 供试品溶液分别进样，按本色谱条件测定峰面积响应值，计算RSD。表5是供试品溶液于配 制后不同时间的峰面积响应值情况表；

表5.

重复性的测定：取同一样品重复制备6份第一种供试品溶液和第二种供试品溶液，按本色 谱条件测定六种成分峰面积，计算六种成分含量及RSD。表6是重复配制的6份供试品溶液 的含量情况表；

表6.

专属性的测定：分别取第一种供试品溶液和第二种供试品溶液、混合对照品溶液和阴性对 照溶液各20uL注入高效液相色谱仪，按本色谱条件测定，记录色谱图，见附图7，8，9，10。 结果表明供试品与对照品在相同时间点出现同一色谱峰，且六种成分峰与其他组分峰可达基线 分离，阴性对照无干扰。

(阴性对照溶液的配制：按样品配方和制备方法，制备不含穿山龙的阴性样品；取阴性样 品，研细，过四号筛，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入85％甲醇10mL，称 定重量，在功率120W、频率40kHz的条件下超声处理50min，放冷至室温，再称定重量，用 甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按样品配方和制备方法，制备不含刺五加的阴性样品；取阴性样品，研细，过四号筛，取 约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入85％甲醇10mL，称定重量，在功率120W、 频率40kHz的条件下超声处理50min，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇 匀，滤过，取续滤液，即得)

加样回收率的测定：取已知含量的样品胶囊内含物0.5g，平行精密称定9份，分别加入相 当于待分析物含量0.8、1.0、1.2倍的伪原薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、绿原酸、异嗪皮啶和紫丁 香苷对照品溶液各3份，按照实施例1步骤(2)方法配制第一种供试品溶液；另取同一批号 已知含量的样品胶囊内含物0.05g，平行精密称定9份，分别加入相当于待分析物含量0.8、1.0、 1.2倍的薯蓣皂苷对照品溶液各3份，按照实施例1步骤(2)方法配制第二种供试品溶液。结 果六种分析物的平均回收率(n＝9)及其相对标准偏差(RSD)见表7所示。表7是加样回收情 况表；

表7.