甾醇衍生物和及其用于治疗牵涉转化的星形胶质细胞的疾病或治疗恶性血液病的用途

本发明涉及新的甾醇衍生物，其制备方法，含有它们的药物组 合物和及其用于治疗牵涉星形胶质细胞转化为癌细胞的疾病，和尤 其是用于治疗多形性成胶质细胞瘤的用途，或用于治疗恶性血液 病，尤其是牵涉转化的髓性细胞，或用于治疗淋巴瘤的用途。

细胞转化相当于从正常真核细胞向无限增生化的细胞和/或癌性 的真核细胞的转换。此后，将同义地使用术语"转化的细胞"或"癌细 胞"。

多形性成胶质细胞瘤(GBM)(也称为IV级星形胶质细胞瘤)是 脑肿瘤，其特征在于将星形胶质细胞转化为癌细胞，尤其是通过I 级、II级和III级胶质瘤。

尽管在肿瘤学领域中实质的科学和治疗的进展，GBM仍然是难 以治愈的癌症。最多，当患者的中位数生命能够延长数月，至多十 五个月，研究者和医生已经很满足了。

在治疗GBM中所面临的问题之一是由干细胞所引起的复发。实 际上，甚至当现有的疗法成功根除大多数肿瘤之时，干细胞常常导 致新的肿瘤的发展(1,2)。

目前的疗法总是由肿瘤的切除术组成(如果肿瘤位置允许这样 的话)，随后适当的放射疗法和/或化学疗法。在化学疗法中，主要 的治疗之一是双重疗法(bitherapy)，其由给予阿瓦斯丁(抑制 VEGF与其受体的结合)和伊立替康(拓扑异构酶I的抑制剂)组成。 PCV类型的三重疗法(它是丙卡巴肼(DNA烷基化试剂)，洛莫司汀 (CCNU；无特异性的烷基化试剂)和长春新碱(抑制微管聚合)的组 合)在目前还很有争议。替莫唑胺(鸟嘌呤烷基化试剂)与放射疗 法组合，显示特别是对于具有过甲基化DNA(hypermethylated  DNA)患者而言增加中位数生存。测试西仑吉肽(抑制某些整联蛋白 受体)和他仑帕奈(阻断AMPA类型的谷氨酸盐通道)的临床试验(III 期)正在进行中。

免疫治疗研究和临床试验具有两种类型：

-适应性免疫治疗，其中将在体外活化的细胞注射进入患者，比 如淋巴因子-活化的杀伤细胞(LAK；II期临床试验)或细胞毒素的T 淋巴细胞(CTL；I期临床试验)，其经颅内注射。目前，观察显示生 存20个月，这是非常边缘的。

-活性的免疫治疗，由使用疫苗(I期)和树突细胞(II期)组成。这 未显示出患者生存的显著改善。这些试验已被停止。

基因疗法，由用腺病毒，逆转录病毒或麻疹病毒作为具有抗-癌 潜力的分子载体组成，显示改善生存仅6至11个月。提出使用神经 元干细胞作为GBM中的药物转运蛋白的细胞疗法仍处于基础研究的 论证阶段。

在最近的数十年已经有些忽略且再次被预期的方法由糖酵解和 氧化磷酸化水平的作用组成。癌细胞增加其消耗葡萄糖，其原因在 于它们倾向于向厌氧代谢修饰它们的代谢，即使氧供给不是限制因 素。这种由Warburg(3)观察到的现象由于过表达HIF(缺氧诱导的因 素)和Myc pro-癌基因。通过灭活丙酮酸脱氢酶，HIF增加丙酮酸向 乳酸的转化(厌氧性地)，这是在需氧呼吸中的关键酶。Myc刺激 生物合成谷氨酰胺，这牵涉厌氧呼吸(4)。

在上下文中，作用于能量代谢的临床试验正在进行中。可能提 及到，如实例(4)：

-二甲双胍：线粒体呼吸系统的复合物I的抑制剂，其依次诱导 AMPK，后者减慢细胞增殖；

-phoretine：用于减少葡萄糖输入的试剂；

-乙酸苯酯：用于减少谷氨酰胺水平的试剂；

-二氯乙酸盐：丙酮酸脱氢酶抑制剂。

除了二氯乙酸盐之外的全部这些分子正在测试(II期临床试验)且 目前还不清楚观察结果。

目前发现靶向星形胶质细胞(GBM来源的细胞类型)能量代谢 的特定方面的甾醇衍生物，能用于治疗多形性成胶质细胞瘤。

本发明的最初的方面由星形胶质细胞(神经胶质来源)的特别的能 量代谢组成，其转化最终导致形成GBM。

实际上，星形胶质细胞同时使用ATP形式的能量供给，其经由 氧化磷酸化(在线粒体中Krebs循环结合电子运输)和经由糖酵解进 行：在后者中，丙酮酸不进入Krebs循环，但是通过类型5的酶乳 酸脱氢酶(LDH)还原为乳酸。除了ATP供给之外，星形胶质细胞使 用糖酵解，其经由乳酸的产生进行，以供给相邻的细胞，神经元， 其中应用神经递质(谷氨酸)。

在下表中，图示地比较星形胶质细胞(正常或癌性)与其它细 胞的能量代谢：

星形胶质细胞的能量代谢是特别的：实际上，线粒体呼吸和糖 酵解一致地起作用。

这是正常星形胶质细胞的特定代谢的二重性，亦即一方面线粒 体呼吸，和另一方面糖酵解，形成用于制备本发明的甾醇衍生物策 略的基础。

实际上，发明人提出了工作假说，根据该假说本发明的甾醇衍 生物定向癌性的星形胶质从糖酵解到线粒体呼吸的能量代谢(一个 会导致它们死亡的过程)。

7β-羟基胆甾醇(7β-OHCH)，具有高抗-癌潜力的分子(5,6)，显示 对下述的显著的细胞毒性：无限增生化的(自发地转化的)大鼠星形胶 质品系(line)(7,8)和"在体外"的GBM(大鼠品系C6)(9)。研究证 实，通过细胞内脂肪酸在C3-OH的7β-OHCH的酯化(形成7β- OHCH-C3-酯)强烈地牵涉母体分子(7β-OHCH)的毒性效果(7， 8，10)。

然而，无论是否在C3-OH酯化，7β-OHCH对"在体外"的GBM 的作用机理远远未曾阐明。最近，对C6品系进行的研究已经显示 7β-OHCH调节筏形基础(raft)的建构和动力学，质膜中的微域， 某些细胞信使起始的位点，包括蛋白质激酶Akt，一种细胞能量代谢 中关键的酶(11)。实际上，氧基甾醇(oxysterol)，通过干扰筏形基 础的建构，会因而影响Akt的活性，特别是在正常细胞转化癌细胞 的期间：Akt调节在这些细胞中捕获的葡萄糖和糖酵解活性。

令人惊讶地，目前发现本发明甾醇衍生物，具有在3位携带取代 基和在7位携带保护基的7β-羟基胆甾醇基础结构，会同时地允许抑 制糖酵解(对于高-级癌性的星形胶质细胞的能量供给是必需的)且 同时，恢复线粒体呼吸(这对于这种细胞也是“致死性的”)。

实际上，该双重作用导致癌细胞的"过热"，从而导致其死亡。

此外，已经显示本发明甾醇衍生物也具有关于干细胞的活性， 从而允许成胶质细胞瘤细胞的全部破坏。

本发明甾醇衍生物关于成胶质细胞瘤的活性也意指它们的用途 能够预期治疗髓性类型的恶性血液病，这归因于髓性细胞的细胞代 谢与星形胶质细胞的细胞代谢的相似性；治疗成神经细胞瘤(具有 与星形胶质细胞相同的胚胎学和细胞来源的神经元)；和治疗黑色 素瘤，其原因在于黑素细胞具有与星形胶质细胞相同的胚胎学来 源，如将随后解释的。

此外，髓性品系和淋巴样品系具有共同来源，亦即多能性干细 胞的事实，意指也可能预期本发明甾醇衍生物用于治疗淋巴瘤的用 途。

本发明因此涉及式(I)化合物

其中

-A代表

-(R₁)_n-基团，其中R₁是通过其C-末端结合的氨基酸残基 (residue)且n＝1或2，各R₁是相同或不同的，其中所述氨基酸的 N-末端能够被-C-(O)-R₂基团取代，其中R₂是单环-或多环C₆-C₁₄芳基 烷基，或被R₃-C(O)-O-或R₃-C(O)-基团取代，其中R₃是C₁-C₆烷基， 所述C₁-C₆烷基是未经取代的或被至少一个选自下述的基团取代： OR，NHR和SR，其中R代表氢，线性C₁-C₁₂烷基或未经取代的C₆- C₁₄芳基；或R₃是C₆-C₁₄芳基或C₅-C₁₄杂芳基基团，所述C₆-C₁₄芳基 或C₅-C₁₄杂芳基基团是未经取代的或被至少一个线性或支化的C₁-C₆烷基取代或被至少一个选自下述的基团取代：OR，NHR和SR，如 前文所定义；或

单环-或多环C₅-C₁₄杂芳基烷基，其能够包含一个或多个可以相 同或不同的杂原子，所述单环-或多环C₅-C₁₄杂芳基烷基是未经取代 的或被至少一个线性或支化的C₁-C₄烷基取代；单环-或多环C₆-C₁₄芳 基烷氧基基团或单环-或多环C₅-C₁₄杂芳基烷氧基基团，其能够包含 一个或多个可以相同或不同的杂原子，所述单环-或多环C₆-C₁₄芳基 烷氧基基团或单环-或多环C₅-C₁₄杂芳基烷氧基基团是未经取代的或 被至少一个线性或支化的C₁-C₄烷基取代，或

-C(O)-NH-R₄或-C(S)-NH-R₄基团，其中R₄是氢；C₁-C₁₂烷基， 所述C₁-C₁₂烷基是线性或支化的，未经取代的或被至少一个选自下述 的基团取代：OR，NHR和SR，如前文所定义；C₆-C₁₄芳基基团，所 述C₆-C₁₄芳基基团是未经取代的或被至少一个线性或支化的C₁-C₆烷 基取代或被至少一个选自下述的基团取代：OR，NHR和SR，如前 文所定义；酰基基团；甲酰基基团；磺酰基基团；亚磺酰基基团； 或另外R₄代表烯丙基基团或糖残基；

-C(O)-OR₅基团，其中R₅是C₁-C₁₂烷基，所述C₁-C₁₂烷基是线性 或支化的，未经取代的或被至少一个选自下述的基团取代：OR， NHR和SR，如前文所定义；

-C(O)-R₆基团，其中R₆是包含1或2个杂原子的饱和的C₅-C₁₄杂 环，所述C₅-C₁₄杂环是未经取代的或被至少一个线性或支化的C₁-C₆烷基取代或被至少一个选自下述的基团取代：OR，NHR和SR，如 前文所定义；或R₆代表线性或支化的C₁-C₁₂烷基，所述C₁-C₁₂烷基是 未经取代的或被至少一个选自下述的基团取代：OR，NHR和SR， 如前文所定义；C₆-C₁₄芳基基团或C₅-C₁₄杂芳基基团，所述C₆-C₁₄芳 基基团或C₅-C₁₄杂芳基基团是未经取代的或被至少一个线性或支化的 C₁-C₆烷基取代或被至少一个选自下述的基团取代：OR，NHR和 SR，如前文所定义；或另外的糖残基。

-B代表-C(O)-R₇基团，其中R₇是氢；C₁-C₁₂，优选C₁-C₆，烷 基，其是线性或支化的，未经取代的或被至少一个选自下述的基团 取代：OR，NHR和SR，如前文所定义；C₆-C₁₄芳基基团，所述C₆- C₁₄芳基基团是未经取代的或被至少一个线性或支化的C₁-C₆烷基取 代或被至少一个选自下述的基团取代：OR，NHR和SR，如前文所 定义；或R₇代表OR₈，其中R₈是线性或支化的C₁-C₁₂烷基，优选线性 或支化的C₁-C₆烷基。

烷基表示线性或支化的C₁-C₁₂基团比如甲基，乙基，丙基，异 丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，异戊基，仲-戊基， 叔-戊基，新-戊基，己基，异己基，仲-己基，叔-己基，庚基，辛 基，壬基，癸基，十一烷基或十二烷基基团，其中线性或支化的C₁- C₆烷基是优选的。

芳基基团表示不饱和的，单环或多环的碳环，C₆-C₁₄基团，比如 苯基，萘基，茚基，蒽基基团和更特别的是苯基基团。

杂芳基基团表示不饱和的，单环或多环的，C₅-C₁₄基团，其包含 可以相同或不同的一个或多个杂原子，和更特别的是嘌呤或嘧啶 碱。

"杂原子"意指氧，氮或硫原子。

"糖残基"意指，例如，葡萄糖，核糖或阿拉伯糖类型的单元。

有利的氨基酸残基是，例如，甲硫氨酰基，甘氨酰基或丙氨酰 基单元。

优选的式(I)化合物是那些，其中满足至少一个下述条件：

-A代表-(R₁)_n-基团，其中R₁是氨基酸残基和n＝1或2；

-A代表-(R₁)_n-基团，其中R₁是氨基酸残基，n＝1或2和所述氨基 酸的N-末端被芳基烷氧基羰基基团，尤其是苄氧基羰基取代；或被 R₃-C(O)-O-或R₃-C(O)-基团取代，其中R₃是C₁-C₆烷基，所述C₁-C₆烷 基是未经取代的或被至少一个选自下述的基团取代：OR，NHR和 SR，如前文所定义；或R₃是C₆-C₁₄芳基或C₅-C₁₄杂芳基基团，所述 C₆-C₁₄芳基或C₅-C₁₄杂芳基基团是未经取代的或被至少一个线性或支 化的C₁-C₆烷基取代，或被至少一个选自下述的基团取代：OR， NHR和SR，如前文所定义；

-A代表连接至甘氨酰基残基(glycinyl radical)的丙氨酰基残 基，所述丙氨酰基残基任选在其N-末端被芳基烷氧基羰基基团，尤 其是苄氧基羰基取代；

-A代表连接至甘氨酰基残基的甲硫氨酰基残基，所述甲硫氨酰 基残基任选在其N-末端被芳基烷氧基羰基基团，尤其是苄氧基羰基 取代；

-A代表-C(O)-R₆基团，其中R₆是2,2-二甲基-1,3-二氧戊环 (dioxolane)基团，或线性或支化的C₁-C₆烷基，所述2,2-二甲基- 1,3-二氧戊环基团，或线性或支化的C₁-C₆烷基是未经取代的或被至 少一个选自下述的基团取代：OR，NHR和SR，如前文所定义；C₆- C₁₄芳基基团或C₅-C₁₄杂芳基基团，所述C₆-C₁₄芳基基团或C₅-C₁₄杂 芳基基团是未经取代的或被至少一个线性或支化的C₁-C₆烷基取代， 或被至少一个选自下述的基团取代：OR，NHR和SR，如前文所定 义；或另外的糖残基。

有利地，B代表酰基基团，其中所述烷基是C₁-C₆，尤其是乙酰 基或烷氧羰基基团，其中所述烷基是C₁-C₆，尤其是叔-丁氧羰基基 团。

B还能够，尤其是，代表C₁-C₆烷基，所述C₁-C₆烷基是未经取代 的或被至少一个选自下述的基团取代：OR，NHR和SR，如前文所 定义；或C₆-C₁₄芳基基团，所述C₆-C₁₄芳基基团是未经取代的或被至 少一个线性或支化的C₁-C₆烷基取代或被至少一个选自下述的基团取 代：OR，NHR和SR，如前文所定义。

优选的式(I)化合物如下：

-7-((叔-丁氧羰基)氧基)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚烷-2-基)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基2- (2-(((苄氧基)羰基)氨基)-乙酰氨基)丙酸盐/酯(分子1.a)；

-7-乙酰氧基-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚烷-2-基)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基2- (2-(((苄氧基)羰基)氨基)-乙酰氨基)丙酸盐/酯(分子1.b)；

-7-((叔-丁氧羰基)氧基)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚烷-2-基)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基 2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-羧酸盐/酯(carboxylate)(分子2.a)；

-7-乙酰氧基-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚烷-2-基)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基 2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-羧酸盐/酯(分子2.b)。

通过包括下述步骤的方法，式(I)化合物能够得自胆甾醇：

-用下述保护基保护胆甾醇3位的羟基官能团：比如，例如，酰氧 基R₉-C(O)-基团，其中R₉基团是取代的或未经取代的C₁-C₆烷基，或 取代的或未经取代的芳基基团，尤其是芳基烷氧基羰基基团，

-在7位引入酮官能团，

-将酮官能团还原为羟基官能团,

-在7位羟基官能团上引入保护基，相应于B基团，比如，例如酰 基，芳基或烷氧羰基基团，或酰氧基R₁₀-C(O)基团，其中R₁₀是取代 的或未经取代的C₁-C₆烷基，芳基，所述芳基是未经取代的或被至少 一个线性或支化的C₁-C₆烷基取代，或C₅-C₁₄杂芳基，所述C₅-C₁₄杂 芳基是未经取代的或被至少一个线性或支化的C₁-C₆烷基取代或被至 少一个选自下述的基团取代：OR，NHR和SR，如前文所定义，

-在3位脱保护羟基官能团。

在3位脱保护羟基官能团之后，所述羟基官能团能够被所希望的 基团A取代。

在7位引入的酮官能团能够通过通常的氧化方法进行。

能够通过例如Luche's方法进行，选择性地在β位，将酮官能团 还原为羟基官能团，其中在氯化铈七水合物存在下使用NaBH₄(12)。

本发明也涉及包含至少一种式(I)化合物和药学上可接受的媒介 物的药物组合物或药物。

本发明的药物组合物由脂质体制剂组成，包含至少一种式(I)化 合物。脂质体能够通过各种本领域技术人员已知的技术产生。能够 使用各种组成脂质体的脂质[Medical Application of Liposomes(1986) edited by Kunio Yagi，Japan Scientific Societies Press，Tokyo， Karger]。

另选地，所述脂质体能够由所谓的"改善的"脂质体组成，所述" 改善的"脂质体具有主要地40至80nm的粒度分布和含有随时间稳 定的组成或由所谓的"浓缩的"脂质体组成，所述"浓缩的"脂质体具 有相同的粒度分布但是包含更高浓度的活性分子，尤其是高于所述" 改善的"脂质体50％浓度的活性分子。

能够通过包括下述步骤的制备方法获得"改善的"脂质体：

-在有机溶剂中接触要包含在脂质体中的活性分子和接触磷脂，

-在氮气流下蒸发溶剂从而获得脂质膜，

-在有机溶剂中溶解脂质，

-在氮气流下蒸发所述溶剂和在含水缓冲剂中溶解脂质膜，

-在超声浴中超声，

-通过挤出获得囊泡。

优选，在约20℃的温度，超声进行10次脉冲/分钟。能够在具 有200nm的孔径尺寸的PVDF-类型的膜上进行挤出。

能够通过包括下述步骤的制备方法获得"浓缩的"脂质体：

-在有机溶剂中接触要包含在脂质体中的活性分子和一定量的磷 脂，所述磷脂的量高于通常技术中使用的磷脂的量，显著地两次通 常的量，

-在减压下蒸发溶剂从而获得脂质膜，

-在有机溶剂中溶解脂质膜，

-在减压下蒸发所述溶剂和在含水缓冲剂中溶解脂质膜，

-在超声浴中超声，

-通过挤出获得囊泡。

优选，在约20℃的温度，超声进行20次脉冲/分钟。能够在具 有200nm的孔径尺寸的PVDF-类型膜上进行挤出。

优选，蒸发在约3kP(30毫巴)之下的压力和在25℃的浴温度进 行。优选使用旋转式蒸发仪。

相对于磷脂的活性分子的量能够是，例如，大约15％，按重 量％表示。

本发明优选的药物由装载有至少一种式(I)化合物的脂质体组 成。

优选，式(I)化合物构成包含在本发明药物组合物中的唯一的活 性成分，尤其是当所述药物组合物是脂质体时。包含至少一种式(I) 化合物的所述脂质体能够通过下述给予：例如，通过口服途径或通 过肠胃外途径。

另选地，式(I)化合物能够与另外的活性成分，比如例如抗癌的 试剂，尤其是阿瓦斯丁，伊立替康，替莫唑胺或紫杉醇衍生物组合 使用。

本发明的药物组合物能够以任意适宜的形式用于口服给药或用 于肠胃外给药，尤其是通过本领域技术人员已知的注射，输注或吸 入。

尤其是，所述药物组合物能够是单独的至少一种式(I)化合物或 与另外的活性成分组合的至少一种式(I)化合物的药学上可接受的溶 液，尤其是含醇的溶液，所述溶液能够通过倾注(transfusion)或输 注给予至患者。

所述药物组合物能够，尤其是，适于给药通过口服或舌下的途 径。除通常的药物形式之外，例如片剂，胶囊，粉末，颗粒剂，溶 液，乳液，口服悬浮液，滴剂，糖浆剂，等，本发明的口服药物组 合物包含式(I)化合物与胆汁盐的复合物，或例如，式(I)化合物与磷 脂，比如磷脂酰胆碱的组合，其呈脂质体的或非脂质体形式。

式(I)化合物，用于治疗牵涉转化的星形胶质细胞的疾病，尤其 是治疗多形性成胶质细胞瘤或IV级星形胶质细胞瘤(GBM)，也是本 发明的主题。尤其是，在治疗场所，式(I)化合物能够直接注射进入 大脑皮质。

本发明也涉及通过给予有效量的至少一种式(I)化合物治疗牵涉 转化的星形胶质细胞的疾病，尤其是治疗多形性成胶质细胞瘤或IV 级星形胶质细胞瘤(GBM)。

本发明也涉及治疗其它癌，亦即髓性类型的恶性血液病和淋巴 瘤，成神经细胞瘤以及黑色素瘤。

式(I)化合物用于治疗髓性类型的恶性血液病，也是本发明的主 题。

本发明也涉及通过给予有效量的至少一种式(I)化合物治疗髓性 类型的恶性血液病。

髓性类型的恶性病理学状况从正常髓性细胞发展。目前，这种 细胞类型在正常状态具有的能量代谢相当类似于星形胶质细胞的能 量代谢：它从线粒体呼吸和从糖酵解(乳酸途径；LDH)产生能量 (13)。在髓性来源的癌的情况下，癌细胞从糖酵解产生它们的能量。 对于GBM而言，式(I)化合物的抗-癌活性会归因于抑制LDH(糖酵 解)，和因而由高度迸发的线粒体呼吸引起的细胞过热。

式(I)化合物用于治疗淋巴瘤，也是本发明的主题。

本发明也涉及通过给予有效量的至少一种式(I)化合物治疗淋巴 瘤。

实际上，由于髓性品系和淋巴样品系具有共同来源(它们是多 能性造血干细胞)，式(I)化合物对髓性类型的恶性血液病的活性意 指它们的用途还能够预期用于治疗淋巴瘤。

式(I)化合物，及其在治疗成神经细胞瘤中的用途也是本发明的 主题。

本发明也涉及通过给予有效量的至少一种式(I)化合物治疗成神 经细胞瘤。

关于成神经细胞瘤(主要影响颅外交感的神经系统)，式(I)化 合物显示抗-肿瘤活性，因为与星形胶质细胞一样，一方面神经元具 有相同胚胎学来源，亦即外胚层，和另一方面细胞来源，亦即神经 上皮细胞(14)。简言之，星形胶质细胞和神经元都是神经细胞和同样 易受式(I)化合物影响。

式(I)化合物用于治疗黑色素瘤，也是本发明的主题。

本发明也涉及通过给予有效量的至少一种式(I)化合物治疗黑色 素瘤。

实际上，黑素细胞(黑色素瘤的来源)衍生自神经嵴，其本身 衍生自外胚层(14)。由于星形胶质细胞和神经元也衍生自外胚层，和 式(I)化合物显示抗-GBM和抗-成神经细胞瘤活性，这些化合物也可 能具有关于黑色素瘤的抗-癌特性。

根据备选方案，所述治疗是顺序的治疗，所述治疗包括至少一 个给予第一式(I)化合物的步骤和至少一给予不同于第一式(I)化合物 的第二式(I)化合物的步骤。

下述实施例说明本发明，但是不是对其限制。

部分I涉及化学合成。

实施例1和2涉及制备合成中间体用于制备式(I)化合物。实施 例3至6涉及制备式(I)化合物。

部分II涉及式(I)化合物的生物学活性。

I/化学合成

实施例1：制备7β-乙酰基胆甾醇(化合物1.4)

反应图解示于图1.

1)制备化合物1.1

使用下述试剂：

将胆甾醇苯甲酸酯，二噁烷/水混合物，亚氯酸钠和N-羟基邻苯 二甲酰亚胺按那样的次序放置于配有冷凝器的1-升三颈烧瓶中。该 混合物在50℃加热6h。通过在己烷/Et2O 8/2中的二氧化硅板TLC (TLC硅胶60F254，Merck)检测反应的进程。

当形成速率达到可接受的值，将粗制反应混合物倾入10％的亚 硫酸钠溶液(500ml)，然后用醚萃取。获得的有机相用碳酸氢钠的饱 和的溶液洗涤，然后用水和最终用盐水洗涤。然后该有机相在硫酸 钠上干燥，过滤且然后减压蒸发。

然后通过从乙醇中重结晶纯化获得的有色油性残余物。在获得 的白色固体不具有足够的纯度，通过硅胶色谱法(二氧化硅SDS 60A，35-70μm)再次纯化。通过在二氯甲烷中溶解该油状物获得固 体沉积物。在98/2己烷/乙酸乙酯至90/10范围的洗脱液中进行纯 化。产物以白色固体形式获得。

收率：23％

分析：通过在CDCl₃中的¹H NMR，BRUKER 400MHz分析。 HPLC柱正相CHIRALCEL O-DH(ODH0CE-CE026柱)，洗脱液 9/1己烷/iProH，20分钟，波长190nm。

保留时间6.682分钟，HPLC纯度99.2％。

¹H NMR(CDCl₃，400.13MHz)：δ0.71(s，3H，CH₃)，0.89 (dd，6H，2CH₃)，0.94(d，3H，CH₃)，1.02-2.78(m，26H)，1.27 (s，3H，CH₃)，4.99(m，1H，CH)，5.76(d，1H，CH)，7.44-8.05 (m，5H，CHAr)。

2)制备化合物1.2

使用下述试剂：

酮胆甾醇苯甲酸酯，THF/MeOH溶剂混合物和水合氯化铈放置 于500-ml烧瓶中。然后用冰浴冷却粗制反应混合物至0℃，然后缓 慢地加入硼氢化钠。观察到气体发射，冰浴保持1h，然后在环境温 度搅拌18h。通过在80/20己烷/EtOAc洗脱液中的TLC(TLC硅胶 60F254，Merck)检测进程。如果形成的速率不充分的，加入0.5当 量的硼氢化钠。

将50ml的水和200ml的二氯甲烷加入粗制反应混合物。在转 移至分液漏斗之后，回收有机相。用DCM再次萃取水相。组合有机 相，用1N盐酸溶液然后用饱和的NaCl溶液洗涤。

然后有机相在硫酸钠上干燥，过滤和减压蒸发，得到稍微有色 的油状物，其自发地结晶。

通过在DCM中溶解残余物获得固体沉积物。在9/1己烷/EtOAc 洗脱液中的硅胶柱(二氧化硅SDS 60A，35-70μm)上纯化该粗制产 物。产物以白色固体形式获得。

收率：89％

分析：通过在CDCl₃中的¹H NMR，BRUKER 400MHz分析。 HPLC柱正相CHIRALCEL O-DH(ODH0CE-CE026柱)，洗脱液 9/1己烷/iProH，20分钟，波长190nm。

保留时间7.076分钟，HPLC纯度98.8％。

¹H NMR(CDCl₃，400.13MHz)：δ0.63(s，3H，CH₃)，0.79 (dd，6H，2CH₃)，0.85(d，3H，CH₃)，0.89-2.43(m，27H)，1.04 (s，3H，CH₃)，3.81(d，1H，CH)，4.81(m，1H，CH)，5.29(d， 1H，CH)，7.34-7.99(m，5H，CHAr)。

3)制备化合物1.3

使用下述试剂：

将7-β-羟基胆甾醇苯甲酸酯，吡啶，然后乙酸酐放置于100-ml 烧瓶。在环境温度搅拌该混合物16h。通过在9/1己烷/EtOAc洗脱 液中的TLC(TLC硅胶60F254，Merck)监测进程。

粗制反应混合物减压蒸发。与乙酸乙酯进行两次共蒸发。获得 的残余物在乙酸乙酯中溶解。这样获得的有机相用1N盐酸洗涤，在 硫酸钠上干燥然后减压蒸发。

获得的白色固体在下一步直接使用，无需额外的纯化。

收率：100％

分析：通过在CDCl₃中的¹H NMR，BRUKER 400MHz分析。 HPLC柱正相CHIRALCEL O-DH(ODH0CE-CE026柱)，洗脱液 9/1己烷/iProH，20分钟，波长190nm。

保留时间4.972分钟，HPLC纯度99.6％。

¹H NMR(CDCl₃，400.13MHz)：δ0.63(s，3H，CH₃)，0.79 (dd，6H，2CH₃)，0.84(d，3H，CH₃)，0.91-2.41(m，26H)，1.06 (s，3H，CH₃)，1.95(s，3H，CH₃乙酰基)，4.78(m，1H，CH)， 4.99(d，1H，CH)，5.21(s，1H，CH)，7.33-7.98(m，5H， CHAr)。

4)制备化合物1.4

使用下述试剂：

在甲醇中的7-β-乙酰基胆甾醇苯甲酸酯和1％氢氧化钠溶液放置 于100-ml烧瓶中。在环境温度搅拌该混合物直至完全溶解。通过在 7/3己烷/EtOAc洗脱液中的TLC(TLC硅胶60F254，Merck)监测进 程。

为了完成反应，粗制混合物能够在40℃加热，在这种情况下每 20分钟通过TLC监测进行。

加入200ml的乙酸乙酯和50ml的水，随后转移至分液漏斗和 分离相。用乙酸乙酯再次萃取水相。组合有机相，在硫酸钠上干 燥，过滤然后减压蒸发，得到油性残余物。

在乙酸乙酯中溶解残余物以便制备固体沉积物。在范围是9/1至 7/3的己烷/EtOAc洗脱液中的硅胶柱(二氧化硅SDS 60A，35-70μm) 上进行纯化。期望的产物以无色油状物的形式获得，其自发地结 晶，得到白色固体。用100％乙酸乙酯洗涤柱以便回收形成的7-β-羟 基胆甾醇。

收率：38％

分析：通过在CDCl₃中的¹H NMR，BRUKER 400MHz分析。 HPLC柱正相CHIRALCEL O-DH(ODH0CE-CE026柱)，洗脱液 9/1己烷/iProH，20分钟，波长190nm。

保留时间6.186分钟，HPLC纯度91.7％。

¹H NMR(CDCl₃，400.13MHz)：δ0.62(s，3H，CH₃)，0.78 (dd，6H，2CH₃)，0.85(d，3H，CH₃)，0.86-2.28(m，27H)，1.03 (s，3H，CH₃)，1.96(s，3H，CH₃乙酰基)，3.47(m，1H，CH)， 4.94(td，1H，CH)，5.13(t，1H，CH)。

实施例2：制备7β-叔丁基氧基羰基胆甾醇(化合物1.6)

反应图解示于图2。

化合物1.6制备自来自实施例1的化合物1.2。

1)制备化合物1.5

使用下述试剂：

将7-β-羟基胆甾醇苯甲酸酯，溶剂，2,6-二甲基氨基吡啶然后叔 丁基氧基羰基酸酐放置于100ml单-颈烧瓶。在环境温度搅拌该混合 物直至完全溶解。在8/2己烷/EtOAc洗脱液中的TLC监测进程。

加入50ml的EtOAc和10ml的水。这样获得有机相的在硫酸 钠上干燥，过滤然后减压蒸发，得到油性残余物。

在EtOAc中溶解残余物以便制备固体沉积物。在95/5己烷 /EtOAc洗脱液中的硅胶柱上进行纯化。

分析：通过在CDCl₃中的¹H NMR分析。

¹H NMR(CDCl₃，400.13MHz)：δ0.59(s，3H，CH₃)，0.77 (dd，6H，2CH₃)，0.84(d，3H，CH₃)，0.86-1.98(m，24H)，1.09 (s，3H，CH₃)，1.41(s，9H，3CH₃，叔-丁氧羰基)，2.42(m，2H， CH₂)，4.80(m，1H，CH)，4.91(d，1H，CH)，5.18(s，1H， CH)，7.34-7.97(m，5H，CHAr)。

2)制备化合物1.6

使用下述试剂：

将在甲醇中的7-β-叔丁基氧基羰基胆甾醇苯甲酸酯和1％氢氧化 钠溶液放置于50ml单-颈烧瓶中。在环境温度搅拌该混合物直至完 全溶剂化的。通过在7/3己烷/EtOAc洗脱液中的TLC监测进程。为 了完成反应，粗制混合物能够加热至40℃。

加入100ml的EtOAc和20ml的水。水相再次用EtOAc萃取。 组合有机相，在硫酸钠上干燥，过滤然后减压蒸发，得到油性残余 物。

在EtOAc中溶解残余物以便制备固体沉积物。在范围是9/1至 7/3己烷/EtOAc洗脱液中的硅胶柱上进行纯化。用100％EtOAc洗 涤柱以便回收形成的7-β-羟基胆甾醇。

分析：通过在CDCl₃中的¹H NMR分析。

¹H NMR(CDCl₃，400.13MHz)：δ0.60(s，3H，CH₃)，0.78 (dd，6H，2CH₃)，0.84(d，3H，CH₃)，0.91-2.29(m，27H)，0.97 (s，3H，CH₃)，1.41(s，9H，3CH₃，叔-丁氧羰基)，3.47(m，1H， CH_B)，4.77(td，1H，CH_C)，5.17(t，1H，CH_A)。

实施例3：制备7-((叔-丁氧羰基)氧基)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基2-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)丙酸酯(分子1.a)

简称(simplified name)：3-苄氧基羰基-甘氨酰基-丙氨酰基-7- β-O-叔丁基氧基羰基-胆甾醇

分子1.制备自中间体化合物1.6。

使用下述试剂：

将80mg(0.16mmol)的7-β-叔丁基氧基羰基胆甾醇，68mg (0.24mmol，1.5当量)的二肽，6ml的溶剂混合物(THF/DCE 1:1)， 50mg(0.24mmol，1.5当量)的DCC，和30mg(0.24mmol，1.5当 量)的DMAP放置于10-ml Wheaton瓶中。粗制反应混合物在环境温 度搅拌24h。通过在7/3己烷/乙酸乙酯洗脱液中的TLC监测进程。

将30ml的乙酸乙酯和10ml的水加入至粗制反应产物。分离有 机相，在硫酸钠上干燥，过滤然后减压蒸发。在乙酸乙酯中溶解获 得的油性残余物以便制备固体沉积物。

在7/3，然后6/4的己烷/乙酸乙酯洗脱液中的硅胶柱上进行纯 化。

分析：通过在CDCl₃中的¹H NMR分析。

¹H NMR(CDCl₃，400.13MHz)：δ0.60(s，3H，CH₃)，0.79 (dd，6H，2CH₃)，0.83(d，3H，CH₃)，0.94-1.88(m，24H)，0.98 (s，3H，CH₃)，1.19(s，3H，CH₃Ala)，1.40(s，9H，3CH₃，叔-丁 氧羰基)，2.27(m，2H，CH₂)，3.83(m，2H，CH₂)，4.47(td，1H， CH Ala)，4.47(m，1H，CH)，4.78(td，1H，CH)，5.07(s，2H， CH₂Gly)，5.22(t，1H，CH)，5.23(m，1H，NH)，6.41(sl，1H， NH)，7.29(m，5H，CHAr)。

实施例4：制备7-乙酰氧基-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基2-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)-乙酰氨基)丙酸酯(分子1.b)

简称：3-苄氧基羰基-甘氨酰基-丙氨酰基-7-β-O-乙酰基-胆甾醇

分子1.b制备自中间体化合物1.4。

使用下述试剂：

将60mg(0.13mmol)的7-β-乙酰基胆甾醇，70mg(0.19mmol， 1.5当量)的二肽，6ml的溶剂混合物(THF/DCE 1:1)，42mg(0.19 mmol，1.5当量)的DCC，和25mg(0.19mmol，1.5当量)的DMAP 放置于10-ml Wheaton瓶中。粗制反应混合物在环境温度搅拌 24h。

通过在7/3己烷/乙酸乙酯洗脱液中的TLC监测进程。

将30ml的乙酸乙酯和10ml的水加入至粗制反应产物。分离有 机相，在硫酸钠上干燥，过滤然后减压蒸发。在乙酸乙酯中溶解获 得的油性残余物以便制备固体沉积物。

在7/3，然后6/4的己烷/乙酸乙酯洗脱液中的硅胶柱上进行纯 化。

分析：通过在CDCl₃中的¹H NMR分析。

¹H NMR(CDCl₃，400.13MHz)：δ0.62(s，3H，CH₃)，0.78 (dd，6H，2CH₃)，0.84(d，3H，CH₃)，0.91-1.83(m，25H)，1.01 (s，3H，CH₃)，1.17(s，3H，CH₃Ala)，1.94(s，3H，CH₃乙酰 基)，2.27(m，2H，CH₂)，3.82(m，1H，CH)，4.47(td，1H，CH Ala)，4.56(m，1H，CH)，4.95(td，1H，CH)，5.06(s，2H，CH₂Gly)，5.17(sl，1H，CH)，5.37(t，1H，CH)，6.49(dl，1H， NH)，7.24(m，5H，CHAr)。

实施例5：制备7-((叔-丁氧羰基)氧基)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-羧酸酯(分子2.a)

简称：3-(S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-羧基-7-β-O-叔丁基氧基 羰基-胆甾醇

1)制备二甲基-1,3-二氧戊环-4-羧酸酯基团

使用下述试剂：

将缩醛，甲醇然后氢氧化锂放置于50-ml烧瓶中。该混合物在环 境温度搅拌16h。

粗制反应混合物减压蒸发。获得的残余物在75ml的水中分散。 然后，该相在0℃用1N盐酸酸化至pH 1，然后用2×100ml的乙酸 乙酯萃取。组合有机相，在硫酸钠上干燥，过滤然后减压蒸发，得 到稍带色的油性残余物。

在结合步骤中直接使用残余物无需额外的纯化。

分析：通过在DMSO，BRUKER 400MHz中的¹H NMR分 析。

¹H NMR(CDCl₃，400.13MHz)：δ1.32(d，3H，CH₃)，1.42 (s，3H，CH₃)，4.14(AB，2H，CH₂)，4.55(dd，1H，CH)，10.30 (sl，1H，OH)，7.24(m，5H，CHAr)。

收率：94％

2)制备分子2.a

分子2.制备自中间体化合物1.4。

使用下述试剂：

将50mg(9.9mmol)的7-β-叔丁基氧基羰基胆甾醇，6ml的溶剂 混合物(THF/DCE 1:1)，和16mg(11.9mmol，1.2当量)的3-(S)-2,2- 二甲基-1,3-二氧戊环-4-羧酸放置于10-ml Wheaton瓶中。

加入24.5mg(11.9mmol，1.2当量)的DCC和14.5mg(11.9 mmol，1.2当量)的DMAP，然后在环境温度搅拌粗制反应混合物 24h。通过在8/2己烷/乙酸乙酯洗脱液中的TLC监测进程。在50℃ 加热2h以便结束反应。

将30ml的乙酸乙酯和10ml的水加入至粗制反应产物。分离有 机相，在硫酸钠上干燥，过滤然后减压蒸发。在乙酸乙酯中溶解获 得的油性残余物以便制备固体沉积物。

在95/5，然后9/1己烷/乙酸乙酯洗脱液中的硅胶柱上进行纯 化。

分析：通过在CDCl₃中的¹H NMR分析。

¹H NMR(CDCl₃，400.13MHz)：δ0.60(s，3H，CH₃)，0.79 (dd，6H，2CH₃)，0.83(d，3H，CH₃)，0.74-1.97(m，25H)，0.98 (s，3H，CH₃)，1.33(s，3H，CH₃缩醛)，1.40(s，9H，3CH₃，叔- 丁氧羰基)，1.42(s，3H，CH₃缩醛)，2.29(m，2H，CH₂)，4.08 (AB，2H，CH₂缩醛)，4.48(ddd，1H，CH缩醛)，4.63(m，1H， CH)，4.78(td，1H，CH)，5.22(d，1H，CH)。

实施例6：制备7-乙酰氧基-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-羧酸酯(分子2.b)

简称：3-(S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-羧基-7-β-O-乙酰基-胆甾 醇

分子2.b制备自中间体化合物1.4。

使用下述试剂：

将胆甾醇，溶剂混合物和酸放置于100-ml烧瓶中。加入DCC 和DMAP，然后在环境温度搅拌粗制反应产物24h。通过在8/2己烷 /EtOAc洗脱液中的TLC(TLC硅胶60F254，Merck)监测进程。

将100ml的乙酸乙酯和50ml的水加入至粗制反应混合物。分 离有机相，在硫酸钠上干燥，过滤然后减压蒸发。

在乙酸乙酯中溶解获得的油性残余物以便制备固体沉积物。硅 胶柱(二氧化硅SDS 60A，35-70μm)在95/5，然后9/1的己烷/EtOAc 洗脱液中。

收率：68％

分析：通过在CDCl₃BRUKER 400MHz中的¹H和¹³C NMR分 析。HPLC柱正相CHIRALCEL O-DH(ODH0CE-CE026柱)，洗脱 液9/1己烷/iProH，20分钟，波长190nm。

保留时间5.291分钟，HPLC纯度98.7％。

¹H NMR(CDCl₃，400.13MHz)：δ0.62(s，3H，CH₃)，0.79 (dd，6H，2CH₃)，0.84(d，3H，CH₃)，0.91-2.30(m，27H)，1.01 (s，3H，CH₃)，1.33(s，3H，CH₃缩醛)，1.42(s，3H，CH₃缩醛)， 1.93(s，3H，CH₃乙酰基)，4.09(AB，2H，CH₂缩醛)，4.48(dd， 1H，CH缩醛)，4.62(m，1H，CH)，4.96(td，1H，CH)，5.18(d， 1H，CH)。

II/生物学活性

A/方案

下述方案用于全部实验：

1)细胞培养物

使用用于细胞培养处理的塑料平底96-孔培养板(NUNC，美 国)(Sigma-Aldrich，ref.114754)；每孔接种在200μl的培养基中的 1500个细胞。在处理时间，100μl的纯的培养基，含有乙醇，或脂 质体的100μl的培养基，或含有活性成分的100μl的培养基加入每 孔；因此，处理之后，全部孔的培养基最终的体积为300μl。

在37℃和在具有5％CO₂和饱和湿度的气氛，在Sanyo温育器 中温育培养物(日本，模型MCO-19AIC-UV)。用倒置显微镜观察细 胞(Nikon Eclipse TS100，日本)和用照相机拍摄照片(配有c型接口 (c-mount)的数字照相机；LABOVER，法国)。培养物顶盖 (hood)是微生物学安全顶盖MSC(thermo SCIENTIFIC，模型 HERA SAFE KS12，法国)。

细胞倍增时间用下式计算：

倍增时间＝(tb-ta)log(2)/(log(b)-log(a))

其中(a)和(b)代表在时间ta和tb(tb>ta)细胞的数量(15)。

通过用胰蛋白酶(牛的胰类型3，Sigma，法国)解离进行转化。 细胞解离在环境温度进行30分钟，其中使用含有0.05％(w/v)胰蛋白 酶的0.04％(w/v)Tyrode KCl溶液。

在解离之后，细胞悬浮于适用于细胞和计数的培养基中(用 THOMA细胞)且在相同的培养基中稀释从而获得每孔1500个细 胞。

a)细胞系

使用下述成胶质细胞瘤细胞：

·C6品系。

C6型细胞系通过Benda等人(16)获自通过N-甲基亚硝脲诱导的 大鼠脑肿瘤。该细胞类型用作"在体外"和"在体内"的模型来评价抗- GBM潜力。品系源自先前的Strasbourg Neurochemistry中心(U44 INSERM和UPR 416CNRS)。

培养基由70％极限必需培养基(MEM；(Fischer Scientifique， ref.61100)和30％Hanks溶液(SIGMA，ref.H 9269)组成。将下述加 入至培养基：最终浓度的5％(v/v)的胎牛犊血清(FCS；Fischer  Scientifique，ref.10108165)，5μg/mL的盐酸环丙沙星抗生素溶液 (EUROMEDEX，ref.UC5074)和2.5μg/mL的Fungizone溶液 (INVITROGEN，ref.15290-026)。该细胞类型的倍增时间是17小 时。

·人类来源的GBM品系

人类成胶质细胞瘤品系(GBM，线U-87MG)和它们的培养基 (Eagle's极限必需培养基或EMEM)得自ATCC(美国，ref.ATCC- HTB-14)。根据ATCC的推荐，开始和保持细胞培养。这些品系一 般"在体外"和"在体内"使用，用于测试抗-GBM潜力。这些品系倍 增时间是16小时。

也使用下述人类细胞原代培养物：

·星形胶质细胞

使用的人类来源的星形胶质细胞得自ScienCell，美国(ref.1800) 以及它们的培养基，由含有2％(v/v)FCS血清的碱性培养基(ref. 0010)，星形胶质细胞生长蛋白(AGS，ref.1852)和青霉素/链霉素的 溶液(ref.0503)组成。这些人类星形胶质细胞的倍增时间是96小时。

·肝细胞

人类来源的肝细胞，它们得自ScienCell，美国(ref.50200)，如 同下述培养基(ref.5201)，其含有10％(v/v)FCS。这些细胞的倍增时 间是24小时。

·肾细胞

人类来源的这些的细胞得自ScienCell，美国(ref.4120)，如同下 述培养基(ref.4101)，其含有10％(v/v)FCS。倍增时间是96小时。

·心脏细胞

人类来源的这些细胞得自ScienCell，美国(ref.6300)，如同下述 培养基，其含有10％(v/v)FCS。倍增时间是72小时。

·骨骼肌肉细胞

人类来源的骨骼肌肉细胞，它们得自ScienCell，美国(ref. 3500)，如同下述培养基(ref.3501)，其含有10％(v/v)FCS。这些细 胞的倍增时间是72小时。

也使用人类来源癌细胞的下述培养物：

·肝癌细胞

它们得自ATCC(ref.ATCC-HB-8065)。培养基由MEM (Gibco，美国；ref.51200)和10％(v/v)FCS组成。倍增时间是60小 时。

·前列腺癌细胞

它们得自ATCC(ref.ATCC-HTB-81)。培养基与用于肝癌品系 的相同。倍增时间是60小时。

·乳腺癌细胞

它们得自ATCC(ref.ATCC-HTB-19)。培养基与用于肝癌品系 的相同。倍增时间是20小时。

·结肠癌(品系HT29/219)

它们得自ECACC收集(Ref.ECACC-85061109)。培养条件基于 在Sigma-Aldrich信息传单内的推荐。

·成神经细胞瘤(品系SH-SY5Y)

它们得自ATCC收集(Ref.ATCC-CRL-2266)。培养条件基于在 ATCC信息传单内的推荐。

·慢性骨髓单核细胞白血病(CMML)

纯化自罹患慢性骨髓单核细胞白血病(CMML)患者的血液样品的 细胞通过Saint Eloi医院的临床血液学中心和生物疗法中心(CHU de  Montpellier)获得。通过在滋养层(feed layer)上的接种技术进行培 养。细胞在滋养层上接种，所述滋养层未受到通过对关注细胞的期 望处理的影响和不大大地改变关注细胞的生理学。CMML细胞在源 自人类胚胎脊髓的细胞系上培养(17)。

对于全部这些培养物，根据供应商的推荐，开始和保持培养。

b)培养物的处理

活性成分溶于无水乙醇(AnalaR，NORMAPUR，VWR，法国) 或呈脂质体溶液的形式，比如在990μl中稀释10μl的储备溶液，然 后加入至培养孔(200μl培养基)得到30.0，15.0，7.5和3.3μM的浓 度(每孔BI-GBM的培养基的最终的体积：300μl)。

当活性成分在乙醇溶液中时，培养基含有3.3％乙醇(v/v)。

2)制备脂质体

a)基础方法通过Werthle等人描述(10)。

简言之，从它们的储备溶液取出测试化合物，亦即本发明化合 物(活性成分)或7β-OHCH-C3-酯(用油酸酯基团在3位酯化的7β-羟 基甾醇衍生物，通过Rakotoarivelo等人的描述合成(18)且用作对 照)，大豆磷脂酰胆碱(Sigma)以及胆固醇基-3-硫酸酯(Sigma)，其中 所述储备溶液在活性成分和7β-OHCH-C3-酯的情况下制备自二氯甲 烷，在磷脂酰胆碱的情况下制备自氯仿:甲醇混合物(9:1，v/v)，和在 胆固醇基-3-硫酸酯的情况下制备自氯仿。对于磷脂酰胆碱，胆固醇 基-3-硫酸酯和7β-OHCH-C3-酯与活性成分而言，摩尔比分别是1 M/0.1M/0.25M。

在蒸发之后，将PBS盐水的溶液(不含Ca²⁺和Mg²⁺，pH7.2 (BioRad))加入至无水化合物。调节缓冲剂的体积和产物的质量使得 20或10μl的脂质体加入至90μl的培养基得到所希望的最终浓度。 通过挤出技术形成脂质体，使用Liposofast(Sodexim，SA Muizon， 法国)。溶液通过聚碳酸酯过滤膜(100nm)41次。通过在22μm  Millipore膜上过滤灭菌脂质体。

对于对其它人类细胞类型"在体外"的活性测试而言，脂质体的 制备以两种不同的方式优化(如上所述)，亦即一方面关于均质的 粒度分布，和另一方面关于活性分子的浓度。

b)获得具有相同粒度分布和具有随时间稳定的组成的脂质体("改 善的脂质体")。

在蒸发溶剂之后，脂质膜再次溶于二氯乙烷:乙醇(3.3:1.5；v:v) 和在氮气流下所述溶液再次蒸发。加入1ml的PBS同时激烈地搅 拌，刮掉脂质残余物使其再次溶解，随后激烈搅拌5分钟，然后在不 超过20℃的温度施用1分钟10次脉冲的超声(Elma，S 60H， Elmasonic)。如上所述挤出和灭菌获得的囊泡(vesicle)，除了溶液 仅通过滤膜两次。

这些脂质体具有40至80nm的粒度分布和含有0.086mg/ml的 分子2.b。

c)获得具有较高浓度的分子2.b的脂质体("浓缩的脂质体")。

对于制备脂质膜而言，磷脂酰胆碱的浓度翻倍；其它化合物的 浓度保持与如上所述的改善的脂质体相同。

产生这些脂质体的操作与改善的脂质体所描述的操作相同，除 了(1)超声是1分钟20个脉冲和(2)用旋转式蒸发仪(Buchi，模型V  850和R 215)，减压蒸发溶剂(约3kPa；30毫巴)。

这些脂质体具有40至80nm的粒度分布和含有0.133mg/ml的 分子2.b。

根据Folch等人的方法(19)，在萃取脂质化合物之后进行组成脂 质体的分子的表征，脂质体的稳定性和脂质体组合成的调查，除了 在萃取之前，在40℃500μl脂质体的溶液与10μl的2％(v:v)Triton  X-100(Sigma)温育18小时。

在根据常规技术的甲基化之后，通过气体色谱法偶联质谱 (GC/MS)进行组成磷脂酰胆碱的脂肪酸的分析。

根据Reineckate(20)的方法，进行磷脂酰胆碱的胆碱基团的表 征。

如下述第5点描述地，通过如上所述HPLC(化合物的制备)或通 过二氧化硅薄-层色谱法定量分子2.b。

在荧光脂质体上测量脂质体的粒度分布和在用表面荧光显微镜 (Axivert，Zeiss)获得图像之后通过Sert程序进行形态测定分析。

荧光脂质体用与改善的或浓缩的脂质体所描述的磷脂酰胆碱的 相同量产生，除了在改善的脂质体的情况下使用的磷脂酰胆碱含有 5.0％荧光磷脂酰胆碱(NBD-PC-油烯基；Avanti；激发/发射＝460 nm/534nm)和在浓缩的脂质体的情况下使用的磷脂酰胆碱含有2.5％ 荧光磷脂酰胆碱。

脂质体在玻璃培养载玻片上沉降，所述载玻片首先包覆有聚-D- 赖氨酸(Sigma，1％在水中，w:v)然后包覆有层粘连蛋白(Sigma， 0.6％在水中)。用戊二醛(Merck)固定脂质体(脂质体:戊二醛:PBS； 15:37.5:97.5，v:v:v)，然后获得图像。

3)活性和毒性的测量

相同的方法用于两种情况。对于活性，使用抗-GBM潜力的试验 化合物，和对于毒性，在"在体外"保持的人类来源的正常细胞上测 试。

使用下述测量方法：

a)细胞计数

使用在照片上的细胞计数方法。

例如，在96-孔板的培养物的情况下和作为所使用的显微镜放大 倍数(物镜×10或×20，目镜×10)，拍摄的照片代表具有直径等于孔径 的1/5的视野。因此，孔中细胞数目的总和等于每照片细胞数目的5 倍。在C6细胞的情况下，该技术与标准技术(细胞层胰酶消化，细 胞离心，在生理学盐水溶液中的细胞悬浮液和用THOMA细胞计数) 相比较。对于两种方法而言，获得的结果是相同的。

b)蛋白质测定

从各孔抽取培养基和每孔加入50μl的Laemmli缓冲剂(0.1ml 的Tris，0.8ml的甘油，1.6mL的10％SDS，8ml q.s.f超纯水)。

在对照孔中，加入10μl的牛血清白蛋白范围的溶液(结晶的 BSA，Sigma)；所述范围是每孔0至20μg。然后，所述孔补充40μl 的Laemmli缓冲剂。最终，加入200μl的BCA试剂的溶液(穿入， 美国；BCA蛋白质测定试剂盒；ThemoScientific，法国)。

在37℃温育培养板30分钟。在570nm，读取各孔光密度和通 过读板器定量(BioRad，美国，iMark Micro读板器12222)。

c)细胞存活率(MTT试验)

该试验使得可能检测细胞呼吸，特别是线粒体呼吸。四唑鎓盐 MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物，Sigma- Aldrich，美国，ref.M5655)的储备溶液用10mg的MTT/ml的PBS 缓冲剂(磷酸盐-缓冲盐水，SIGMA，ref.D 1408)制备。直接将该溶 液加入至各孔的培养基；MTT的最终浓度是25μg/ml。然后在37℃ 温育板至少1小时。

在出现蓝色甲(formazan)颗粒之后(主要通过线粒体的电 子运输产生)，拍摄照片以便计数具有高密度的甲颗粒的细胞； 在U87-MG品系的情况下使用该技术。然后对于该品系和其它培养 物，除去培养基和加入100μl的二甲亚砜(DMSO，SDS CARLO  ERBA，意大利)以溶解甲沉积。

在490nm，读取光密度和用读板器定量(BioRad，iMark Micro 读板器)。

存活率有时也通过锥虫蓝排除技术测定。

4)细胞的免疫标记和获得图像

将抗-CD133(多，Abnova)，抗-GFAP(多，Sigma)，抗-NFL (单，SantCruz)和抗-成纤维细胞(ERTR7，Santa Cruz)一抗稀释至 1/100(在头三个抗体的情况下)和稀释至1/50(在最后一个的情况 下)。

对于检测IDH-R132H(低-级胶质瘤的标记物(21))和CD31(内皮 细胞的标记物(22))而言，所使用的一抗分别得自Clinisciences(小 鼠，稀释1/20)和得自Spring Bioscience(兔，稀释1/250)。

对应于识别一抗的二抗是偶联至过氧化物酶的抗-兔抗体(山羊， Sigma)，偶联至Dylight 488的抗-小鼠抗体(绵羊，Sigma)，偶联至 Dylight 488的抗-小鼠抗体(绵羊，Sigma)和偶联至FITC的抗-大鼠抗 体(兔，Sigma)。稀释分别是1/4000，1/1000，1/4000和1/400。

用过氧化物酶-偶联的二抗检测IDH1-R132H和CD31。它们分 别得自Fischer Scientific(抗-小鼠，稀释1/1000)和得自Sigma(抗- 兔，稀释1/500)。

在PBS中(Fisher Scientific)用0.1％Triton X-100(Sigma)将细胞 透化处理5分钟。在PBS中用2％BSA(Sigma)阻断无特异性的位 点。对于抗-CD133，抗-GFAP，抗-NFL和抗-成纤维细胞抗体而 言，分别在环境温度进行温育1小时，在4℃进行温育48小时，在 4℃进行温育24小时和在环境温度进行温育1小时。在环境温度，进 行温育二抗1h。通过DAB/H₂O₂系统(Sigma)检测，和用光学显微镜 观察CD133阳性细胞。

用底物NOVARED Vector(Eurobio)进行标记物IDH1-R132H 和CD31的比色检测。也通过光学显微技术检测有色的细胞。检测荧 光和获得图像，使用表面荧光显微镜(Axiovert，Zeiss，德国)。

5)脂质的萃取和氧基甾醇(oxysterols)的鉴定

细胞用0.9％NaCl洗涤，机械地收集，悬浮于Tris-HCl缓冲剂 (10mM；pH 7.4)和用Potter(1000r.p.m.和13次往复)匀化。在冰中 进行匀化。在根据Folch等人(19)对1体积的细胞悬浮液加入19体积 的氯仿:甲醇(2:1，v/v)之后，在4℃进行萃取。通过加入0.2体积的 0.74％KCl(w/v)分离有机相和含水相。

在旋转式蒸发仪(Buchi，R-215，瑞士)中蒸发有机相之后，在氯 仿中溶解脂质残余物。TLC层用氯仿:甲醇(1:1，v/v)预洗涤和在 100℃活化1小时。用下述系统洗脱脂质:石油醚(沸点:60-70℃):醚: 乙酸(80:20:1.3，v/v/v)。沉积的标准物(standards)是胆甾醇，7-酮 -胆甾醇，7β-OHCH，7β-OHCH-C3-酯和分子2.b。脂质和标准物用 Maccala试剂检测。对于胆甾醇，7-酮-胆甾醇，7β-OHCH，7β- OHCH-C3-酯和分子2.b而言，Rf值分别是0.21，0.09，0.08，0.27 和0.23。对于各标准物范围是0.5至2μg的校准分开地进行。在扫描 显影的二氧化硅之后，计算关注的斑点相对标准物的强度。

所使用的溶剂AnalAR或HPLC级。

6)分析LDH(乳酸脱氢酶；EC 1.1.1.27)的活性和抑制

LDH活性的测量及其通过常规抑制剂，草氨酸酯(oxamate)(23) 的抑制，经光谱测定方法(24)确证，其中使用赖氏乳杆菌 (Lactobacillus leichmannii)(LL)(Sigma)的纯化LDH作为标准。

然后，LDH活性及其抑制通过"在凝胶中的测定"技术(25)检 测。所使用的活性来源是LDH LL和LDH(部分纯化)，来自人类 GBM品系U87-MG(LDH GBM)。"在凝胶中的测定"在LDH LL和 LDH GBM样品的电泳凝胶上的等电聚焦(IEF)之后进行检测。

a)部分纯化的LDH GBM

在磷酸盐缓冲剂中(50mM，Ph 7.2.Pi)收集的细胞经历若干冷冻 (-20℃)/解冻循环和所述细胞物质是均质的。在4℃于10,000g离心45 分钟之后，收集上清液和在-80℃冷冻含有10％甘油(v:v)的等分试 样。在所希望的时间，在等分试样解冻之后，在Pi中制备的过滤柱 (Biogel P-60，BioRad)上进行色谱法。凝胶的体积是9ml和柱的内 径是0.4cm。在大气压进行洗脱。除去1.4ml的第一级分和在随后 的2ml中收集LDH活度(activity)。该级分(LDH GBM)的蛋白质 组分经下述表征：通过SDS PAGE技术，随后硝酸银染色，或通过 蛋白质印迹。发现LDH的分子量特征(对于亚-单元而言为31kDa， 或对于二聚体中其缔合物(association)而言为62kD)。

b)IEF

将7.5(T％)和2.6(C％)的微型-凝胶倾至Pi(具有两性电解质 (Ampholines)(BioRad))中，使其在冷室预-聚焦之后可以形成7 至5的pH梯度范围。所使用的容器是3型微型-变性蛋白质(mini- protean)(BioRad)。阳极缓冲剂具有2.0的pH和阴极缓冲剂具有 10.0的pH。沉积LDH LL和LDH GBM样品，变性和进行聚焦210 分钟，在冷室中从100V至300V增加电压。

c)LDH活性

通过乳酸盐/酯/NAD/MTT/吩嗪硫酸甲酯系统检测LDH活性(在 IEF凝胶中形成甲类型的沉淀)；该系统描述于参考文献(25)。

加入草氨酸酯(18mM)或分子2.b(乙醇形式(36mM))，使其可 能测量LDH LL和LDH GBM活性的抑制程度。

B/"在体外"抗-GBM活性

B.1.动物模型

在上述的操作条件下(部分II，A)使用C6细胞(大鼠)的培养 物。

实施例7："在体外"对C6细胞培养物(大鼠)的抗-GBM活性

获得的结果概括于下表1以及图3之中。

表1

图3(放大倍数20×10)显示，在第19天和第35天，在分子 1.a(实施例3)的存在下或在分子1.a(实施例3)和然后分子2.a(实施 例5)顺序处理之后，在上述的操作条件下(部分II，A)C6细胞培 养物的外观。

结果(表1)显示，在处理19天之后，分子1.a(乙醇形式)是细 胞毒的。在15μM的1.a和在处理14天之后，细胞数量，蛋白的水 平和MTT测定至少减少30％且达到97％(在第19天)。在处理的 第19天，也观察到对于7.5和3.3μM的1.a而言，呈剂量依赖性和 观察到在15μM相对于对照培养物而言，MTT/细胞比率增加 20％。

为了除去残余的细胞，使用顺序处理。细胞首先用15μM的分 子1.a处理和在处理的第19天，加入浓度为7.5μM的分子2.a。

未观察到有活力的细胞；仅细胞"尸体"附着至细胞培养物的固 体基材(孔的底部)，如图3所示。

概括而言，用分子1.a和然后分子2.a顺序处理显示，针对该细胞 类型的完整的效力。所述观察结果表明，在它们破坏之前增加细胞 的总呼吸(overall respiration)。

B.2.人类模型："在体外"对人类细胞(品系U-87GM)的培养物抗-GBM活性

B.2.1"在体外"模型和结果表示的定义

a)不同的细胞类型的表征

在上述的操作条件下(部分II，A)，培养U-87GM细胞。

培养物由两种细胞组分组成:由表现为正常(非癌性的)细胞组成 的细胞层和由GBM类型细胞组成的细胞聚集体。

图4显示旋光图像(10×10)，其为培养物的特征。能够看见细胞 层(CL)，在该细胞层上半球形的细胞聚集体(CA)变得固定的。图5 (20×10)显示，通过免疫标记，在人类GBM描述的CD133+细胞(干 细胞)，定位在细胞聚集体中而并非在CL中。免疫荧光标记显示， 在CL和CA中(图6和7；20×10)中存在GFAP，即正常星形胶质细 胞的标记物(图6和7；20×10)(26)和在CL和CA中存在神经丝。然 而，仅在CA的情况下发现，成纤维细胞(具有增殖高潜力的细胞) 的特定的标记。在CL和CA中观察到非常少的IDH1-R132H-阳性 细胞。相反地，在CL和CA中存在CD31-阳性细胞。

通过光学显微技术的观察结果清楚地显示CA的细胞很快速地分 裂(最多16h的倍增时间)，而组成CL的细胞具有96小时的倍增时 间。

这些观察结果为已被发展的细胞计数方法(细胞标记的或不含甲 颗粒)提供理由；实际上，在胰酶消化之后计数不能在CL与CA 的细胞之间产生区别。图像也显示仅CA具有GBM特征(短倍增时 间，存在干细胞和成纤维细胞)。因此，获得的结果是那些在CA上 测试的分子的效果。

b)结果表示

结果根据下述参数表示：

(i)本发明分子的效力

-残余的细胞，尤其是干细胞的定量。

-本发明分子随时间的效力

含有本发明分子的培养基用新鲜的培养基替换和检查"从头"细 胞增殖：无"从头"增殖表示包括干细胞的GBM细胞全部破坏。

(ii)分子对GBM细胞的总呼吸的效果。

(iii)比较本发明分子获得的结果与用7β-OHCH-C3-酯(对照)获得 的那些结果。

B.2.2结果

在上述的操作条件下(部分II，A)，使用U87-MG(人类)细胞 的培养物。

7β-OHCH-C3-酯用作对照。

实施例8：脂质体形式的分子2.a(实施例5)"在体外"抗-GBM活性的研究

在下表2中呈现获得的结果。

表2

这些结果是重复三次进行的三组独立实验的平均值。结果表示 为相对于对照的百分比。

观察结果显示，在处理15天之后，15μM的脂质体形式的分子 2.a将GBM细胞(CA)的存在减少为零。

仅保留具有缓慢分裂的细胞(CL)。效果是非剂量依赖性的。乙 醇形式的7β-OHCH-C3-酯未对GBM(CA)起作用(也参见实施例9)， 和仅在脂质体形式，亦即于80μM起作用。它的效力是不佳的，或甚 至降低(在增加脂质体形式的7β-OHCH-C3-酯的剂量时)。

然而，如果在处理的第13天，除去含有7β-OHCH-C3-酯的培养 基且用新鲜的不含有该药物培养基替换，观察到细胞增殖，和平行 地，在两天后MTT试验中出现增加；该增加是40％。而对于分子2.a 并非如此：在不存在该分子的情况下，未观察到细胞增殖。

表2也显示，当大多数细胞消失的时侯(处理的8天)，在MTT/ 细胞中巨大的增加(相对于对照为140％)。而对于脂质体的7β-OHCH- C3-酯并非如此：甚至在80μM，MTT/细胞比率不变。

该观察结果显示，在两种分子之间的不同的作用：总细胞呼吸 增加然后细胞大规模死亡。而对于7β-OHCH-C3-酯并非如此。

实施例9：乙醇形式的分子2.b(实施例6)"在体外"抗-GBM活性的研究

在下表3中提供获得的结果。

表3

这些结果是重复三次进行的三组独立实验的平均值。结果表示 为相对于对照的百分比。高于30μM，7β-OHCH-C3-酯不能溶于乙 醇。

观察结果显示，乙醇形式的分子2.b在30μM是完全有效的：无 GBM细胞保留，甚至在除去活性成分之后也是如此。正如脂质体形 式的分子2.a，细胞呼吸增加然后细胞死亡。对于乙醇7β-OHCH-C3- 酯并非如此，未观察到抗-肿瘤活性。

此外，在22天用新鲜的不含有化合物2.b培养基替换培养基不 导致任何细胞增殖。

实施例10：用A/B过氧化物酶系统免疫标记CD133+干细胞

如上所述(部分II，A)进行免疫标记。

在下表4中提供获得的结果。

表4

这些结果是重复三次进行的两组独立实验的平均值。结果表示 为CD133阳性细胞相对于对照的百分比。这些实验独立于描述于实 施例8和9中的那些。

如在描述于表2和3中的观察结果，相对于未处理的对照细胞， 脂质体形式的7β-OHCH-C3-酯和乙醇形式的分子2.b减少蛋白水平 85％和100％。

结果显示，干细胞被分子2.b完全毁坏。而对于7β-OHCH-C3- 酯，甚至当给予脂质体形式时也并非如此。

图9(CD133⁺细胞的免疫标记)清楚地显示，在处理22天之后它 们消失。而对于脂质体形式的7β-OHCH-C3-酯(图10，CD133⁺细胞 的免疫标记)并非如此；在这种情况下，50％的CD133⁺细胞仍存在于 残余的细胞中。在22天，用新鲜的不含有化合物2.b的培养基替换 培养基不导致出现CD133+干细胞。

实施例11：乙醇形式的分子2.b(实施例6)在人类来源的GBM中"在体外"的结局的研究

在处理24小时或10天之后，对用乙醇形式的30μM的分子2.b 处理的、来自GBM脂质的萃取和分析未显示存在7β-OHCH-C3- 酯，后一时间为引发细胞死亡时的时间。然而，观察到在处理1天 和10天之后分别有0.12％和0.18％的分子2.b转化为7β-OHCH。对 照实验显示，这些很低水平的7β-OHCH不诱导任何GBM死亡。

实施例12：毒性的研究

"在体外"测试对人类来源的各种正常细胞类型的毒性。

a)在星形胶质细胞上

所使用的细胞是人类来源的细胞(ScienCell，美国，ref.1800)， 如上所述(部分II，A)。

星形胶质细胞类型通过存在GFAP(正常星形胶质细胞的标准标 记物)确证(图11；放大倍数×200)。

在30μM，在处理30天之后，分子2.a(脂质体形式)和2.b(乙醇 形式)对正常(非癌性的)人类星形胶质细胞原代培养物无毒性。

b)在其它细胞上

所使用的细胞是人类来源的肝细胞(ScienCell，美国，ref. 50200)，肾细胞(ScienCell，美国，ref.4120)，骨骼肌肉细胞 (ScienCell，美国，ref.3500)和心脏细胞(ScienCell，美国，ref. 6300)，如上所述(部分II，A)。

在30μM，在处理30天之后，分子2.a(脂质体形式)和2.b(乙 醇形式)对人类来源的肝细胞，肾细胞，骨骼肌肉细胞和心脏细胞的 原代培养物无毒性。

实施例13：分子2.b(实施例6)"在体外"对其它癌的活性研究

所使用的癌细胞来自人类来源的肝(ref.ATCC-HB-8065)，前列 腺(ref.ATCC-HTB-81)，乳腺(ref.ATCC-HTB-19)癌细胞，和来自结 肠癌细胞(ECACC-HT29/219)，如上所述。

在30μM和在乙醇形式中，分子2.b显示，对人类来源的肝， 前列腺或乳腺癌细胞的细胞分裂和呼吸无效果。

在15μM，改善的脂质体形式的分子2.b对结肠癌细胞无毒性。

实施例14.改善的脂质体形式的分子2.b"在体外"对慢性骨髓单核细胞白血病(CMML)的活性的研究

白细胞分离自收集于罹患CMML患者的血液样品。在接种滋养 层24小时之后用10μM改善的脂质体形式的分子2.b处理细胞一次 (17)。

结果示于图12的照片中(放大倍数20×10)。

对照是用空脂质体处理的细胞：用字母A标记的左手上部照片 是在处理48小时之后拍摄的和用字母B标记的左手下部照片是在处 理72小时之后拍摄的。

对于用2.b处理细胞而言，用字母C标记的右手上部照片是在处 理48小时之后拍摄的和用字母D标记的右手下部照片是在处理72 小时之后拍摄的。

结果显示，在处理72小时之后，分子2.b显著的效果。相对于 对照，细胞增殖显著地减慢和观察到许多细胞具有坏死的外观。

实施例15.分子1.b和2.b"在体外"对人类成神经细胞瘤(ATCC-CRL-2266)的活性的研究

在开始培养24小时之后，成神经细胞瘤用空脂质体(对照)或用 含有分子1.b或2.b的脂质体处理。细胞用22μM的分子1.b或22 μM的分子2.b处理一次。脂质体形式是浓缩的。

结果示于图13的照片中(放大倍数10×10)。

对于对照细胞而言，用字母A标记的左手上部照片是在处理7 天之后拍摄的和用字母B标记的左手下部照片是在处理28天之后拍 摄的。

对于用浓缩的脂质体的分子1.b处理的细胞而言，用字母C标记 的照片(中间，上部)是在处理7天之后拍摄的和用字母D标记的 照片(中间，下部)是在处理28天之后拍摄的。对于用浓缩的脂质 体的分子2.b处理细胞，用字母E标记的右手上部照片是在处理7天 之后拍摄的。

结果显示，分子2.b相对于分子1.b的显著的活性。在处理28 天之后，相对于对照细胞，分子1.b几乎对全部细胞有毒性。对于分 子2.b而言，在处理7天之后，已经观察到基本(radical)毒性效 果；未观察到有活力的细胞。

实施例16.通过分子2.b"在体外"对提取自人类GBH(U87-MG品系)的LDH的活性抑制的研究

这些实验的目的是展示系列2分子对LDH的酶活性抑制的潜 力。研究用分子2.b进行和它的抑制性潜力在来自赖氏乳杆菌(LL)的 LDH和来自人类GBM品系(U87-MG)的部分纯化LDH上测试，如 上所述部分"A/方案6)"。

通过"在凝胶中测定"技术，在IEF电泳凝胶上检测LDH的活 性，且描述于部分"A/方案6)"(25)；该技术精密度是0.2单位的 pH。LDH的活性通过甲类型的深蓝色沉淀检测，该位置(site) 定位LDH活性。

图14(A)显示在pHi 6.2对于LDH LL的LDH活性和在pHi 6.4 对于LDH GBM的LDH活性。

结果显示，加入草氨酸酯(含水形式(18mM))，或分子2.b (乙醇形式(36mM))，几乎完全抑制LDH LL的酶活性和部分抑制 LDH GBM(B)的酶活性。

通过分子2.b抑制LDH GBM的酶活性的潜力以及在GBM细胞 死亡之前MTT染色增加(表2和3；图8和9)确证式(I)化合物的作用 机理的假设：本发明分子会抑制LDH的活性和因而会导致线粒体呼 吸的迸发。

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