一种β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶突变体及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶，和通过基因定点突变的方法获得β-葡萄糖苷酶的突变体和一些耐热性提高的β-葡萄糖苷酶的突变体，以及β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶突变体的在纤维素降解中的应用。

背景技术

由于能源危机日益严重，可再生且环保效果显著的木质纤维素糖化工艺越来越受到人们的关注。利用纤维素酶降解木质纤维素产生葡萄糖，进而发酵生产包括乙醇在内的生物基产品对社会经济发展具有重要的现实意义。然而，由于纤维素酶降解天然纤维素底物的效率低，成本高，因此由纤维素转化为生物燃料的过程依然具有很大挑战性。同时，由于底物的特异性，以及纤维素酶发酵液酶系的不平衡限制了其应用。在纤维素降解过程中，纤维素酶的水解效率是纤维素转化为葡萄糖的一个瓶颈。

发明内容

本发明提供一种β-葡萄糖苷酶，本发明的β-葡萄糖苷酶具有葡萄糖苷酶的活性，所述葡萄糖苷酶的活性在纤维素降解中提供降解的功能，能用于降解纤维素。

同时，为了提高β-葡萄糖苷酶的耐热性，本发明对野生型β-葡萄糖苷酶突变体进行了突变，得到了几种耐热性显著提高的β-葡萄糖苷酶的突变体。

本发明提供的技术方案为：

一种组合物，其含有一种酶，所述酶具有葡萄糖苷酶的活性，所述葡萄糖苷酶的活性在纤维素降解中提供降解的功能，所述酶为如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

目前有一株经过诱变育种筛选到的能大量高产β-葡萄糖苷酶的桧状青霉(Penicillium piceum)H16，桧状青霉(Penicillium piceum)H16的保藏号为CGMCC No.8339，保藏时间为：2013年10月15日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。本发明的申请人首先将桧状青霉(Penicillium piceum)H16的全基因组测序，通过生物信息学方法以所有霉菌属产生的β-葡萄糖苷酶蛋白序列建库，利用blastx在桧状青霉全基因组中进行搜索，并进行归类最终得到表达量最高的胞外分泌β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。如SEQ ID NO:1所示的β-葡萄糖苷酶的表达量最高，且活性达到20IU/mL以上。高活力的β-葡萄糖苷酶可用于酶系复配中，平衡水解酶系，提高转化效率。

本发明提供的所述酶与其他用于降解纤维素比如β-1，4-葡萄糖酶、外切葡聚糖酶的酶共同作用，用于降解纤维素。本发明提供的酶也可单独用于降解纤维二糖。

优选的是，所述的组合物中，所述酶为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第100位的甘氨酸被取代为脯氨酸(G100F)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

优选的是，所述的组合物中，所述酶为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第172位的甘氨酸被取代为脯氨酸(G172F)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明还提供氨基酸序列SEQ ID NO:6和氨基酸序列SEQ ID NO:7的所示的β-葡萄糖苷酶突变体，与β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列SEQ ID NO:1)和β-葡萄糖苷酶突变体(氨基酸序列SEQ ID NO:2、3、4、和5)相比，酶活大致相同，且热稳定性显著提高，使其在酶系复配中能够提高复配酶液整体水解率。热稳定性提高使得相对于野生型β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列SEQ ID NO:1)，氨基酸序列SEQ ID NO:6和氨基酸序列SEQ ID NO:7的所示的β-葡 萄糖苷酶突变体在更适应于工业化生产。

优选的是，所述的组合物中，所述酶为以下四种蛋白质中的任意一种蛋白质：

SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第325位的谷氨酰胺被取代为精氨酸(Q325R)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第444位的苏氨酸被取代为赖氨酸(T444K)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第618位的天冬氨酸被取代为谷氨酰胺(D618Q)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；或者，

SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第629位的谷氨酸被取代为谷氨酰胺(E629Q)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明的申请人将如SEQ ID NO:1所示的β-葡萄糖苷酶进行如上四种突变，得到的四种β-葡萄糖苷酶突变体(氨基酸序列SEQ ID NO:2、3、4、和5)的仍然具有葡萄糖苷酶的活性，且酶活大致相同，能够用于降解纤维素。可将野生型β-葡萄糖苷酶单独用于酶系复配从而用于降解纤维素，也可将这几种酶中的一种或任意几种同时用于酶系复配中从而用于降解纤维素。

本发明还提供一种DNA分子，所述DNA分子编码如上的所述酶，该DNA分子的序列选自：SEQ ID NO:8、9、10、11、12、13和14。由于氨基酸密码子存在简并性，同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象称为密码子的简并性(degeneracy)。对应于同一种氨基酸的不同密码子称为同义密码子(synonymous codon)。简并性使得那些即使密码子中碱基被改变，仍然能编码出原氨基酸。密码的简并也使DNA分子上碱基组成有较大余地的变动。所以，本发明所述的DNA分子包括但不限于以上的多核苷酸序列，还存在很多能够编码所述酶的可能的多核苷酸序列，这里不在一一列举。

本发明也提供一种重组载体，其含有能够编码所述酶的所述的DNA分子和与所述DNA分子连接的用于表达的调节序列，该DNA分子的序列选自：SEQ ID NO:8、9、10、11、12、13和14，本发明中使用的用于表达的调节序列为pET系列载体，当然，也可以使用其他适于编码所述酶的核苷酸序列的表达载体，它们能够在多种真核宿主细胞和原核宿主细胞中表达。

本发明还提供给宿主细胞，该宿主细胞包括能够编码所述酶的所述的DNA分子或所述的重组载体，所述的重组载体所含的DNA分子能够编码所述酶，该DNA分子的序列选自：SEQ ID NO:8、9、10、11、12、13和14。在一个优选的实施方案中，该宿主细胞为大肠杆菌细胞。

本发明还提供一种产生编码酶突变体的核苷酸序列的方法，包括：

步骤一、从桧状青霉(Penicillium piceum)H16中克隆得到如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，并将所述多核苷酸序列连接到用于表达的调节序列上，构建得到带有所述核苷酸序列的连接子，之后通过将所述连接子转化到宿主细胞中，得到含有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的重组载体；以及，

步骤二、利用突变引物，以步骤一得到的所述重组载体为模板，通过聚合酶链式反应方法进行循环延伸扩增得到带有编码酶突变体的核苷酸序列的PCR产物，之后通过将所述PCR产物转化到宿主细胞中，得到含有突变位点的重组载体。利用如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，利用如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，利用如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，利用如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列，利用如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，利用如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。

优选的是，所述的产生编码酶突变体的核苷酸序列的方法，所述步骤二中，将所述PCR产物转化到宿主细胞中之前，还包括将所述PCR产物利用DpnI内切酶于温度37℃下处理3h。

优选的是，所述的产生编码酶突变体的核苷酸序列的方法中，所述步骤二中，所述突变引物包括：其中一条引物的碱基序列如SEQ ID NO:25所示，另一条引物的碱基序列如SEQ ID NO:26所示，SEQ ID NO:25的碱基序列与SEQ ID NO:26的碱基序列反向互补；或者，

其中一条引物的碱基序列如SEQ ID NO:27所示，另一条引物的碱基序列如SEQ ID NO:28所示，SEQ ID NO:27的碱基序列与SEQ ID NO:28的碱基序列反向互补。引物序列不限于此提供的序列，也可以是其他序列，只要能够得到目的核苷酸序列即可。

本发明的有益效果为：

本发明的β-葡萄糖苷酶的表达量很高，且活性很高。高活力的β-葡萄糖苷酶可用于酶系复配中，平衡水解酶系，提高转化效率。

本发明的申请人将如SEQ ID NO:1所示的β-葡萄糖苷酶进行如上四种突变，得到的四种β-葡萄糖苷酶突变体(氨基酸序列SEQ ID NO:2、3、4、和5)的仍然具有葡萄糖苷酶的活性，能够用于降解纤维素。可将野生型β-葡萄糖苷酶单独用于酶系复配从而用于降解纤维素，也可将这几种酶中的一种或任意几种同时用于酶系复配中从而用于降解纤维素。

本发明还提供氨基酸SEQ ID NO:6和氨基酸序列SEQ ID NO:7的β-葡萄糖苷酶突变体，与β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列SEQ ID NO:1)和β-葡萄糖苷酶突变体(氨基酸序列SEQ ID NO:2、3、4、和5)相比，热稳定性提高，使其在酶系复配中能够提高复配酶液整体水解率。

耐热性提高可以提高单位时间内β-葡萄糖苷酶的水解效率，降低酶用量，提高在酶系复配中平衡酶系提高整体水解率的作用。另外，β-葡萄糖苷酶能将风味前体物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质，耐热性的提高可以使其在啤酒、茶叶中发挥更好作用，具有广泛的应用前景。

定义

为了便于理解本发明，定义了大量术语和短语

本发明中的“反向互补”，指通过碱基配对原则关联的核苷酸序列。例如，序列“5’-A-T-G-3’”与序列“5’-C-A-T-3’”反向互补。

术语“基因”是指一种DNA分子，基因是遗传变异的主要物质，是控制生物性状的基本遗传单位，基因中编码RNA或蛋白质的碱基序列成为结构基因，本发明中所称的基因为结构基因。

“野生型基因”是指一种从来源中分离的基因，本发明的“野生型基 因”是从诱变的桧状青霉(Penicillium piceum)H16克隆得到的。而“突变的基因”是指一种基因，与“野生型基因”相比，其具有序列和/或功能性质的修饰(即改变的特征)。

“野生型酶”是指一种蛋白质，本发明的“野生型酶”是从诱变的桧状青霉(Penicillium piceum)H16分离得到的，或者“野生型基因”异源或同源表达的产物。而“酶突变体”是指与“野生型酶”相比，其具有序列和/或功能性质的修饰(即改变的特征)。

“载体”是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子，一种类型的载体是“质粒”，质粒是其他的DNA片段可与其连接的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其可将其他的DNA片段连接至病毒基因组。某些载体整合至宿主细胞基因组中，并得以与宿主基因组一起复制。并且，某些载体能指导与其可操作连接的基因的表达，一般使用的这样的表达载体为质粒形式。在本发明中，可交互使用“质粒”和“载体”。

“重组载体”是指已连接了基因的表达载体。在本发明中，可交互使用“重组质粒”和“重组载体”。

引物，又名引子。是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3’-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3’-OH，必须是游离的。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。DNA上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链，又称编码链。另一条链核苷酸序列与正义链互补，称为反义链。一般将与正义链互补的一个引物成为上游引物，与反义链互补的一个引物称为下游引物。

纤维素酶，纤维素酶是指能降解纤维素β-1，4-葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系。纤维素酶的主要组分是内切β-1，4-葡萄糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。前两种酶主要溶解纤维，后一种酶将纤维二糖转化为葡萄糖，适当调节组合物(即 对组分酶系)中这三种主要成分活性的比例，实现完成纤维素的降解。

附图说明

图1(a)为编码β-葡萄糖苷酶的其中两个基因的PCR产物的凝胶电泳图；

图1(b)为编码β-葡萄糖苷酶的另外两个基因的PCR产物的凝胶电泳图；其中，b所示为G8221基因，a，c和d所示为其他基因。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1：

首先将桧状青霉(Penicillium piceum)H16的全基因组测序，通过生物信息学方法以所有霉菌属产生的β-葡萄糖苷酶蛋白序列建库，利用blastx在桧状青霉全基因组中进行搜索，并进行归类得到多个胞外分泌的β-葡萄糖苷酶的序列，如图1(a)和1(b)所示，采用逆转录PCR(RT-PCR)方法分析将这几个胞外分泌蛋白的表达量，发现其中一个基因G8221的量最高，从而得到目的序列为桧状青霉H16中表达量最高的胞外分泌β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，DNA分子序列如SEQ ID NO:8所示。

实施例2：

利用分子模拟软件Discovery studio将桧状青霉(Penicillium piceum)H16的β-葡萄糖苷酶和热稳定性极好的黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC3.316的β-葡萄糖苷酶进行建模，构建3D模型。用以下方法进行突变位点选择：a.将距离β-葡萄糖苷酶loop区最近的甘氨酸突变成脯氨酸；b.将桧状青霉和黑曲霉CGMCC3.316的β-葡萄糖苷酶进行3D结构比对，观察差异位点。根据以上突变方案设计突变引物，以含有野生型β-葡萄糖苷酶DNA序列(SEQ ID NO:8)的重组质粒为模板进行突变。利用分子模拟软件对β-葡萄糖苷酶进行理性设计，选定突变位点，能有效的节省突变位点筛选的时间，提高突变效率。

上述构建方法中所述表达载体指pET15、pET22或pET28等。

1、构建pET28a(+)-bgl1：编码野生型β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列SEQ ID NO:1)的野生型基因(核苷酸序列SEQ ID NO:8)的重组载体

利用引物G8221F:5’-ATA GCT AGC ATG CTC TCC AAA TTG CAA CAT C-3’(SEQ ID NO:15)和G8221R:5’-ATA CTC GAG TCA AAC AGT GAA AGT GTC TGT T-3’(SEQ ID NO:16)，以桧状青霉(Penicillium piceum)H16的基因组为模板，进行PCR扩增后得到野生型基因序列(SEQ ID NO:8)，将野生型基因序列(SEQ ID NO:8)和pET系列的一种表达载体pET28a分别使用Nhe I和Xho I酶进行酶切后，纯化回收酶切后的野生型基因片段和pET载体，并将野生型基因片段连接到pET28a载体上得到连接子pET28a(+)-bgl1。将该连接子pET28a(+)-bgl1转化到大肠杆菌E.coli DH5α中，对得到的转化子测序验证是否为正确的基因克隆(与核苷酸序列SEQ ID NO:8相同)，挑选含有正确序列的相应菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bgl1大量培养后，提取质粒即得到大量正确的pET28a(+)-bgl1的重组载体(氨基酸序列SEQ ID NO:1，核苷酸序列SEQ ID NO:8)，以该pET28a(+)-bgl1的重组载体为模板进行后续突变基因的构建。

采用定点突变方法，以野生型基因片段的重组载体为模板，通过设计突变引物进行突变。上游引物设计中将突变位点作为中心，左右各12-30个碱基，下游引物为上游引物的反向互补序列。之后利用突变引物重组质粒进行高保真PCR扩增。得到的PCR产物是一个缺失的环状，即是线性的重组载体，本发明采用的Thermo公司生产的phusion酶通过突变引物把重组质粒扩增了全长，所以得到PCR产物是环状的(包含突变的基因序列和载体)，将该PCR产物转入到大肠杆菌DH5a细胞中后这个线性的重组载体又会自动修复成为和重组载体一样的环状结构。

2、构建pET28a(+)-bgl1/Q325R

利用突变引物Q325R_F：5’-GCA GCT TGG TAT CTT GTT GGC CGG GAT CAA GGC TAC CCA TCT GTA-3’(SEQ ID NO:17)和Q325R_R:5’-TAC AGA TGG GTA GCC TTG ATC CCG GCC AAC AAG ATA CCA AGC TGC-3’ (SEQ ID NO:18)，以pET28a(+)-bgl1为模板，进行高保真PCR扩增，得到pET28a(+)-bgl1/Q325R(氨基酸序列SEQ ID NO:2，核苷酸序列SEQ ID NO:9)。此时，pET28a(+)-bgl1/Q325R为一线性的重组载体。

一些实施例中，可利用如下表1和表2所示，采用Thermo公司phusion酶进行高保真PCR扩增：

表1 PCR扩增体系

表2 PCR循环的条件

3、构建pET28a(+)-bgl1/T444K

利用突变引物T444K_F：5’-CA ACA ATC ACC TCC AGT ACC AAG GAT TCA ACT AGC GAT GGT GC-3’(SEQ ID NO:19)和T444K_R:5’-GC ACCATC GCT AGT TGA ATC CTT GGT ACT GGA GGT GAT TGT TG-3’(SEQ ID  NO:20)，以pET28a(+)-bgl1为模板，利用如上表1和表2所示PCR扩增体系和循环条件进行高保真PCR扩增，得到pET28a(+)-bgl1/T444K(氨基酸序列SEQ ID NO:3，核苷酸序列SEQ ID NO:10)。此时，pET28a(+)-bgl1/T444K为一线性的重组载体。

4、构建pET28a(+)-bgl1/D618Q

利用突变引物D618Q_F：5’-AAC TAC TCT GGT CTC GCT GTT CAA GTG ACT GTC TCA GCT GGT GCT-3’(SEQ ID NO:21)和D618Q_R:5’-AGC ACC AGC TGA GAC AGT CAC TTG AAC AGC GAG ACC AGA GTA GTT-3’(SEQ ID NO:22)，以pET28a(+)-bgl1为模板，利用如上表1和表2所示PCR扩增体系和循环条件进行高保真PCR扩增，得到pET28a(+)-bgl1/D618Q(氨基酸序列SEQ ID NO:4，核苷酸序列SEQ ID NO:11)。此时，pET28a(+)-bgl1/D618Q为一线性的重组载体。

5、构建pET28a(+)-bgl1/E629Q

利用突变引物E629Q_F：5’-TCA GCT GGT GCT ACC TCT GGG CAA ACT GTC TCC GGA GGC CCA T-3’(SEQ ID NO:23)和E629Q_R:5’-A TGG GCC TCC GGA GAC AGT TTG CCC AGA GGT AGC ACC AGC TGA-3’(SEQ ID NO:24)，以pET28a(+)-bgl1为模板，利用如上表1和表2所示PCR扩增体系和循环条件进行高保真PCR扩增，得到pET28a(+)-bgl1/E629Q(氨基酸序列SEQ ID NO:5，核苷酸序列SEQ ID NO:12)。此时，pET28a(+)-bgl1/E629Q为一线性的重组载体。

6、构建pET28a(+)-bgl1/G100P

利用突变引物G100P_F：5’-CCC GTC ACG GCT TTT CCC GCC CCA ATC AAT GCG GGA GCT ACC TG-3’(SEQ ID NO:25)和G100P_R:5’-CA GGT AGC TCC CGC ATT GAT TGG GGC GGG AAA AGC CGT GACGGG-3’(SEQ ID NO:26)，以pET28a(+)-bgl1为模板，利用如上表1和表2所示PCR扩增体系和循环条件进行高保真PCR扩增，得到 pET28a(+)-bgl1/G100P(氨基酸序列SEQ ID NO:6，核苷酸序列SEQ ID NO:13)。此时，pET28a(+)-bgl1/G100P为一线性的重组载体。

7、构建pET28a(+)-bgl1/G172P

利用突变引物G172P_F：5’-GAA ACG ATC AAC GGT GTT CAG CCT GCT GGA GCC CAG GCG TGC GC-3’(SEQ ID NO:27)和G172P_R:5’-GC GCA CGC CTG GGC TCC AGC AGG CTG AAC ACC GTT GAT CGT TTC-3’(SEQ ID NO:28)，以pET28a(+)-bgl1为模板，利用如上表1和表2所示PCR扩增体系和循环条件进行高保真PCR扩增，得到pET28a(+)-bgl1/G172P(氨基酸序列SEQ ID NO:7，核苷酸序列SEQ ID NO:14)。此时，pET28a(+)-bgl1/G172P为一线性的重组载体。

首先将PCR得到的突变产物按照表3所示分别进行甲基化处理之后，转入大肠杆菌DH5α或大肠杆菌JM109感受态细胞，挑取阳性克隆，并进行DNA序列测定。并将含有突变正确的DNA序列的菌斑培养并提取质粒，获得含有突变β-葡萄糖苷酶基因的重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)或E.coli Rosetta等表达菌株，筛选阳性克隆，即得到含有本发明的突变基因的工程菌株。

需要说明的是，由于E.coli DH5α等宿主都具有甲基化修饰，而作为模板的pET28a(+)-bgl1重组载体是从E.coli DH5α等宿主细胞中提取的，所以其DNA序列具有甲基化位点，DpnI能够特异性识别这些位点，将模板DNA切开成小段，从而将利用DpnI酶切后的PCR产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中后，模板DNA即pET28a(+)-bgl1重组载体在含有卡那霉素的固体平板上不会生长。而成功突变的PCR产物中由于没有甲基化位点，不会受到DpnI的酶切影响，从而在转入到E.coli DH5α中，突变的线性的重组载体又会自动修复成为和重组载体一样的环状结构，并成功复制。因此在筛选阳性克隆时，去除了残留模板DNA的干扰。

表3 利用甲基化酶DpnI处理PCR产物的体系

通过以上方法，分别得到了含有突变基因的工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bgl1/Q325R(氨基酸序列SEQ ID NO:2，核苷酸序列SEQ ID NO:9)，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bgl1/T444K(氨基酸序列SEQ ID NO:3，核苷酸序列SEQ ID NO:10)，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bgl1/D618Q(氨基酸序列SEQ ID NO：4，核苷酸序列SEQ ID NO:11)，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bgl1/E629Q(氨基酸序列SEQ ID NO：5，核苷酸序列SEQ ID NO:12)，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bgl1/G100F氨基酸序列SEQ ID NO：6，核苷酸序列SEQ ID NO:13)，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bgl1/G172F氨基酸序列SEQ ID NO：7，核苷酸序列SEQ ID NO:14)等。

实施例3：

含本发明β-葡萄糖苷酶基因和β-葡萄糖苷酶突变基因工程菌的表达与蛋白纯化

将保存的工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bgl1(氨基酸序列SEQ ID NO:1，核苷酸序列SEQ ID NO:8)，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bgl1/Q325R(氨基酸序列SEQ ID NO:2，核苷酸序列SEQ ID NO:9)，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bgl1/T444K(氨基酸序列SEQ ID NO:3，核苷酸序列SEQ ID NO:10)，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bgl1/D618Q(氨基酸序列SEQ ID NO：4，核苷酸序列SEQ ID NO:11)，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bgl1/E629Q(氨基酸序列SEQ ID NO：5，核苷酸序列SEQ ID NO:12)，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bgl1/G100F氨基酸序列SEQ ID NO：6，核苷酸序列SEQ ID NO:13)，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bgl1/G172F氨基酸序列SEQ ID NO：7，核苷酸序列SEQ ID NO:14)的甘油菌按照2％的体积比接种于20mL含有卡那霉素的液体LB培养基中，28℃过夜培养。将活化后的培养液接种于含有卡那霉素的100mL LB液体培养基中，放置于37℃、250rpm条件下培养至OD600＝0.6(以UNICO UV2102紫外可见分光光度计，以培养用LB培养基为空白对照)；之后加入终浓度为0.8mM的IPTG 进行诱导，并于28℃、180rpm条件下继续培养10小时；4℃、8000g离心收集菌体，加入0.1倍菌液体积的结合缓冲液(Binding buffer)，350W功率、冰浴条件下超声40min破碎细胞，30000g离心收集上清，得到粗酶液。粗酶液经过Ni-NTA柱层析进行纯化，洗脱液中咪唑浓度为500mM，洗脱10个柱体积。之后得到的蛋白经过检测达到SDS-PAGE纯度的要求。通过以上方法得到野生型β-葡萄糖苷酶蛋白(氨基酸序列SEQ ID NO：1)、β-葡萄糖苷酶突变体Q325R(氨基酸序列SEQ ID NO：2)、β-葡萄糖苷酶突变体T444K(氨基酸序列SEQ ID NO：3)、β-葡萄糖苷酶突变体D618Q(氨基酸序列SEQ ID NO：4)、β-葡萄糖苷酶突变体E629Q(氨基酸序列SEQ ID NO：5)、β-葡萄糖苷酶突变体G100F(氨基酸序列SEQ ID NO：6)和β-葡萄糖苷酶突变体G172F(氨基酸序列SEQ ID NO：7)。

实施例4

使用纤维二糖测定法测定7种蛋白的酶活，实际是以纤维二糖为底物进行的测定，具体方法和步骤为：

样品：1.5mL 0.5％纤维二糖在50℃恒温水浴锅预热5-10min，加入0.5mL一定浓度的酶稀释液。酶液需要至少两个稀释度，一个稀释度的酶液在30min内释放的葡萄糖量略少于1mg，一个稀释度的酶液在30min内释放的葡萄糖量略多于1mg；

水浴：将混合均匀的样品、底物和酶的对照组同时置于50℃恒温水浴锅中，水浴反应30min。

灭活：反应结束时，将样品、底物和酶的对照组一起煮沸5min使酶失活。

测定：采用生物传感器测产生的葡萄糖含量。

计算：β-葡萄糖苷酶酶活的定义为每分钟转化产1umol葡萄糖所需要的酶的量为1IU。各种蛋白质的酶活请见下表4。

表4 各种蛋白质的酶活

(注：表中桧状青霉分泌的β-葡萄糖苷酶包括有多种β-葡萄糖苷酶，其酶活是多种β-葡萄糖苷酶酶活的总和。野生型β-葡萄糖苷酶及β-葡萄糖苷酶突变体指的是实施例3中通过E.coli等基因工程菌诱导表达得到的蛋白质。)

使用纤维二糖测定法测定7种蛋白的耐热性，具体方法和步骤和上述测定酶活的步骤相似，只是在水浴步骤中置于50℃恒温水浴锅中，水浴反应48h后，测定各种酶的剩余活性。

通过酶活的数值进行剩余活性(百分百)的计算：例如野生型β-葡萄糖苷酶在50度放置48h后酶活还剩余最初的60％，这里以0h时为原点定义酶活为100％，则其剩余活性即为60％。各个菌株所产生的酶的剩余活性请见表5。

表5 各菌株所产生的酶的剩余活性

需要说明的是，虽然黑曲霉CGMCC3.316生产的β-葡萄糖苷酶的耐热性较高，但是其活性和产量都较低，不适用于工业生产。

桧状青霉中野生型β-葡萄糖苷酶的分泌量是最多的，其是β-葡萄糖苷酶的主体，从表4和表5中可以看出，几种β-葡萄糖苷酶突变体Q325R(氨基酸序列SEQ ID NO：2)、β-葡萄糖苷酶突变体T444K(氨基酸序列SEQ ID NO：3)、β-葡萄糖苷酶突变体D618Q(氨基酸序列SEQ ID NO：4)和β-葡萄糖苷酶突变体E629Q(氨基酸序列SEQ ID NO：5)的酶活和耐热性与野生型β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列SEQ ID NO：1)相比，均与其大致相同。可以将这一种或几种序列突变的DNA分子转入到桧状青霉或者其他青霉菌种，用于产生大量β-葡萄糖苷酶，从而在用于酶系复配中，平衡水解酶系，提高转化效率。

而β-葡萄糖苷酶突变体G100F(氨基酸序列SEQ ID NO：6)和β-葡萄糖苷酶突变体G172F(氨基酸序列SEQ ID NO：7)与野生型β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列SEQ ID NO：1)相比，不仅酶活大致相同，耐热性还有显著提高，尤其是β-葡萄糖苷酶突变体G172F(氨基酸序列SEQ ID NO：7)热稳定性提高非常显著，，这对于目前的生产来说十分重要，能够在酶系复配中提高复配酶液的整体水解率，在工业上具有很大地应用价值。

相对而言，甘氨酸结构不稳定，脯氨酸结构稳定，将距离loop区最近的甘氨酸突变为脯氨酸提高了蛋白整体结构稳定性，这可能就造成了β-葡萄糖苷酶突变体G100F(氨基酸序列SEQ ID NO：6)和β-葡萄糖苷酶突变体G172F(氨基酸序列SEQ ID NO：7)的热稳定性提高，另一方面，通过分子模拟发现突变后的β-葡萄糖苷酶突变体G100F(氨基酸序列SEQ ID NO：6)和β-葡萄糖苷酶突变体G172F(氨基酸序列SEQ ID NO：7)的疏水相互作用键增多，而疏水作用有利于蛋白的有效折叠，从而使蛋白结构更加稳定，有利于热稳定性提高。

耐热性提高可以提高单位时间内β-葡萄糖苷酶的水解效率，降低酶用量， 提高在酶系复配中平衡酶系提高整体水解率的作用。另外，β-葡萄糖苷酶能将风味前体物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质，耐热性的提高可以使其在啤酒、茶叶中发挥更好作用，具有广泛的应用前景。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。