用于乳腺癌诊断的多生物标记物组和其检测方法,以及利用其抗体的乳腺癌诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及乳腺癌的诊断。更为特别地，本发明涉及能够在血液中有选择地诊断乳腺癌的发病的多生物标记物组和其检测方法，以及包含特异性识别其抗体的乳腺癌诊断试剂盒。 

背景技术

乳腺癌的起因尚未明确，但有考虑到各种因素，如雌性激素、家族病史、既往病史、生育史和饮食习惯。根据2005年国家统计局的一份调查，近年来乳腺癌的发病率迅速增加，在1998年超过了宫颈癌。因此，在2001年韩国女性癌症病人中乳腺癌占16.1%，超越胃癌，居于首位。尤其在2002年，与2001年相比，乳腺癌（11.1%）被排名为增长最快的癌症。对经历着低出生率、短期母乳喂养、月经初潮早及闭经晚等在生理上精力旺盛的变化的女性而言，受雌性激素刺激的发生会迅速增加，从而乳腺组织的敏感度会上升，而且饮食习惯变得西化且生存环境受到污染，由于这些理由，近年来乳腺癌的发病率有大幅度增加。 

鉴于如今西化的实际情况，预计乳腺癌发病率和由乳腺癌导致的死亡率在未来较长一段时间内还会持续增长。通常，乳腺癌引起淋巴结转移或由癌细胞的生长导致的对周围组织的侵犯等症状。然而，大多数的乳腺癌在没有任何症状下可通过自我诊断来进行检查。因此，为了降低由乳腺癌导致的死亡，有效地对乳腺癌进行早期诊断尤为重要（Tuli et al., Breast J., 12: 343-348, 2006）。 

为了诊断乳腺癌，已复合使用过一些方法。至今，70%乳腺癌患者是通过自我诊断住院的。然而，这种自我身段具有很难区分恶性肿瘤和良性肿瘤块的缺点，用于诊断乳腺癌的方法包括乳腺X线摄影、超声检查、细针穿刺细胞检查、磁力共振成像等，然而重要的是最终通过活检检查癌症。所述乳腺X线摄影是指用X射线拍摄乳房并鉴定乳腺癌的方法，其能良好地区分肿瘤块是否为良性或恶性。此外，所述乳腺X线摄影为一种用于发现潜伏的肿瘤块的方法，通过自我诊断摸到肿块之前诊断首发癌最有效。然而，所述乳腺X线摄影具有如下缺点，即对如年轻女性一样乳腺良好发达的或乳房小且纤维较多的韩国女性的诊断率有所降低。进一步，存在一种经常用X射线摄影乳房可能会导致乳腺癌的争议。作为这种乳腺X线摄影的替代方法，可使用超声检查。所述超声检查能够有效地区分囊肿和硬质肿块，然而区分恶性肿瘤和良性肿瘤块的能力会有所降低。 

为了弥补这种常用诊断方法所带来的缺点，曾试图通过测量患者血液中肿瘤标记物的浓度来诊断乳腺癌（Clinton et al., Biomed Sci. Instrum. 39: 408-414, 2003; Rui et al., Proteomics. 3: 433-439, 2003; Soletormos et al., 48: 229-255, 2001）。有研究过这些肿瘤标记物的诊断或预后因素的重要性，然而对其的使用仍受限制，本领域中还没有官方推荐的乳腺癌标记物。 

鉴于上述情况，为了研发在诊断乳腺癌中使用乳腺癌患者血液中蛋白量会特异性变化的蛋白标记的方法，本发明人进行了一些广泛的研究。结果发现，比较根据由多数生物标记物组成的标记物组的乳腺癌的变化模式时与通过单个生物标记物的变化的方法相比能够更有效地诊断乳腺癌。为了有效地跟踪多个蛋白标记物，本发明人又发现，可通过多反应监测来监测能够代表各生物标记蛋白的肽的表达水平来简单地诊断乳腺癌。本发明是基于上述发现完成的。 

发明内容

技术问题 

因此，本发明的目的在于提供一种用于简易地鉴定乳腺癌的方法，该方法利用了血液中存在的多个生物标记物组的根据乳腺癌发病的变化模式。

技术方案 

为了达成上述目的，本发明提供用于诊断乳腺癌的蛋白标记物组。

此外，本发明提供一种通过利用三重四极杆质谱仪进行多反应监测来检测血液样本中的生物标记物组的方法。 

进一步，本发明提供用于乳腺癌的诊断试剂盒，该试剂盒包含组成所述生物标记物组的每种标记物的特异性抗体。 

此外，本发明提供一种通过利用组成所述生物标记物组的每种标记物的特异性抗体进行抗原-抗体结合反应来检测血液样本中的生物标记物组的方法。 

下面，将更为详细地说明本发明。 

根据一个实施例，本发明提供用于诊断乳腺癌的生物标记物组，该生物标记物组包含以下表1展示的五个蛋白标记物中的两个或两个以上的蛋白标记物。本发明的生物标记物组优选地包含以下五个蛋白标记物中的三个或三个以上的蛋白标记物，更优选地包含以下五个蛋白标记物中的四个或四个以上的蛋白标记物，最优选地包含以下五个蛋白标记物。 

【表1】 

本发明的组成生物标记物组的第一个蛋白为如SEQ ID NO: 1所示的载脂蛋白C1。载脂蛋白C1与游离脂肪酸结合来减少其在细胞中被酯化（参见Westerterp M. et al., J. Lipid Res., 48:1353-1361, 2007）。第二个蛋白为如SEQ ID NO: 2所示的载脂蛋白（a）。载脂蛋白（a） 具有丝氨酸蛋白酶的活性，而且能起到自体溶解的作用（Salonen E. M.  et al., EMBO J., 8: 4035-4040, 1989）。第三个蛋白为如SEQ ID NO: 3所示的神经细胞粘附分子L1样蛋白。神经细胞粘附分子L1样蛋白为一种参与胞外基质和细胞的粘附中并对神经系统的发育和突触可塑性起重要作用的蛋白质（Wei M. H. et al., Hum. Genet., 103:355-364, 1998）。第四个蛋白为如SEQ ID NO: 4所示的碳酸酐酶1。碳酸酐酶1能够催化二氧化碳的可逆性水合反应和氰胺的水合反应而生成尿素（Briganti F. et al., J. Biol. Inorg. Chem., 4: 528-536, 1999）。最后，第五个蛋白为如SEQ ID NO: 5所示的纤维连接蛋白。 纤维连接蛋白在细胞与基质的粘附中提供蛋白粘附并起到使细胞向胶原迁移的作用（Morla A. et al., Nature, 367: 193-196, 1994）。

另外一方面，利用三重四极杆质谱仪的多反应监测（MRM）为一种有选择地分离、检测并定量特性分析物质来监测浓度变化的分析技术。MRM早已应用于小分子的定量分析，从而MRM用在特定遗传性疾病的诊断上。MRM方法具有易于同时检测多个肽且在没有标准物或抗体的情况下能确认正常人与癌症患者之间的蛋白诊断标记候选物的相对浓度差异的优点。进一步，MRM方法具有优异的诊断敏感性和选择性，尤其在利用质谱仪的蛋白质组分析中为了分析血液中存在的复杂的蛋白质和肽而导入了MRM方法（Anderson L. et al., Mol Cell Proteomics, 5: 375-88, 2006; DeSouza, L. V. et al., Anal. Chem., 81: 3462-70, 2009）。 

为了寻找一种在乳腺癌患者的血液中蛋白标记物组的量可特异性地进行变化且能有效地用于乳腺癌的诊断的诊断性蛋白标记物组，本发明人从80名乳腺癌患者和80名非患者对照组中获取血液样本，并通过利用三重四极杆质谱仪的多反应监测（MRM）进行定量分析。本发明人由此确认，与非患者对照组中的血液相比，载脂蛋白C1、载脂蛋白（a）、神经细胞粘附分子L1样蛋白、碳酸酐酶1、纤维连接蛋白和大肠杆菌β-半乳糖苷酶展示出在乳腺癌患者血液中的量的变化，而且通过这种变化能够有效地区分乳腺癌患者。 

将包含本发明中经确认的五个蛋白中的两个或两个以上蛋白的多生物标记物组用于诊断乳腺癌时，通过蛋白质之间的互补作用能够获得卓越的诊断准确性。尤其，当使用包含五个蛋白的多生物标记物组时，能够获得无法与单一标记物比拟的卓越的诊断准确性。进一步，由于可在血液中检出上述标记蛋白组，而无需使用活检。因此，在不会对患者造成不便的情况下用简单的方法诊断乳腺癌时使用上述标记蛋白组。 

根据另一实施例，本发明提供通过利用三重四极杆质谱仪的多反应监测（MRM）从血液样本中检测载脂蛋白C1、载脂蛋白（a）、神经细胞粘附分子L1样蛋白、碳酸酐酶1和纤维连接蛋白中的两个或两个以上蛋白标记物的方法。 

本发明的方法包括如下步骤： 

i） 将受试者血液样本的蛋白质和对照组血液样本的蛋白质制成肽片段；

ii）将上述肽片段导入三重四极杆质谱仪，并对分别代表载脂蛋白C1、载脂蛋白（a）、神经细胞粘附分子L1样蛋白、碳酸酐酶1和纤维连接蛋白的靶肽中的两个或两个以上靶肽进行多反应监测；

iii）将所述多反应监测结果表示成相对于内标物的百分比；以及

iv）将与所述受试者和所述对照组有关的检测结果进行比较。

根据一个进一步的实施例，可通过以下步骤确认乳腺癌的发病：从受试者收集血液样本；通过MRM方法从所述受试者的血液样本中检测载脂蛋白C1、载脂蛋白（a）、神经细胞粘附分子L1样蛋白、碳酸酐酶1和纤维连接蛋白中的两个或两个以上蛋白；将这些检测结果与对照组的检测结果进行对比，然后检查所述蛋白质的量的增加或减少。优选地，可通过以下步骤确认乳腺癌的发病：通过MRM方法从所述受试者的血液样本中检测载脂蛋白C1、载脂蛋白（a）、神经细胞粘附分子L1样蛋白、碳酸酐酶1和纤维连接蛋白；将此结果与非患者对照组的检测结果进行对比，然后检查上述五个蛋白标记物的量的增加或减少。 

鉴于本发明的目的，为了通过MRM方法检测靶蛋白，应当选取能够代表各个蛋白的特定肽及作为各个肽的MRM检测目标的一对母离子和子离子。关于本发明的五个标记蛋白，代表载脂蛋白C1的靶肽具有序列SEQ ID NO: 6，该靶肽的一对母离子和子离子分别为m/z 526.8和m/z 605.3。代表载脂蛋白（a）的靶肽具有序列SEQ ID NO: 7，该靶肽的一对母离子和子离子分别为m/z 521.8和m/z 634.3。代表神经细胞粘附分子L1样蛋白的靶肽具有序列SEQ ID NO: 8，该靶肽的一对母离子和子离子分别为m/z 642.8和m/z 836.4。代表碳酸酐酶1的靶肽具有序列SEQ ID NO: 9，该靶肽的一对母离子和子离子分别为m/z 485.8和m/z 758.4。代表纤维连接蛋白的靶肽具有序列SEQ ID NO: 10，该靶肽的一对母离子和子离子分别为m/z 555.8 和 m/z 821.4。 

此外，为了检测靶蛋白，如能合成一种一些氨基酸由稳定的同位素取代的特定肽并将该特定肽在MRM分析中用作内标物时，即可测量靶蛋白在血液中的绝对量，而能导出更为准确的分析结果。本发明中所用的内标物可包括在MRM分析中常用的任何内标物。例如，可使用大肠杆菌β-半乳糖苷酶。当合成一些氨基酸由稳定的同位素取代的特定肽作为内标物来测量血液中靶蛋白的绝对量时，所述氨基酸由同位素取代，该同位素包括赖氨酸或精氨酸，但不限于此。作为合成的肽，可优选被分离成纯度为95%以上的肽。 

当通过MRM方法对包含本发明的五个蛋白标记物中的两个或两个以上蛋白标记物的生物标记物组进行检测时，作为使用患者血液的新型诊断工具，其敏感性良好，而且对待测的蛋白质的选择性比用抗原-抗体的常用免疫化学方法更高。进一步，能简便地分析血液，而不用活检，而且确认乳腺癌发病的准确度与用单一标记物时相比明显优异。因此，所述生物标记物组可有效地用于乳腺癌的早期诊断。 

此外，本发明提供利用MRM方法的用于检测生物标记物组的诊断试剂盒，该生物标记物组包含血液样本中五个蛋白标记物中的两个或两个以上的蛋白标记物。所述诊断试剂盒包括与两个或两个以上蛋白中各蛋白的靶肽及该靶肽的一对母离子和子离子有关的信息，该信息是通过MRM方法用来检测载脂蛋白C1、载脂蛋白（a）、神经细胞粘附分子L1样蛋白、碳酸酐酶1和纤维连接蛋白中的两个或两个以上蛋白标记物时需要的。所述诊断试剂盒进一步包括本领域中通常用于质谱法的工具、试剂等。更优选地，所述诊断试剂盒包括有关所有所述五个蛋白标记物的靶肽和该靶肽的一对母离子和子离子的信息。 

另一方面，不仅通过MRM方法，还通过抗原-抗体结合反应可在血液中检测本发明的生物标记物组。因此，在另一实施例中，本发明提供在血液样本中检测两个或两个以上蛋白标记物的用于乳腺癌的诊断试剂和用于乳腺癌的诊断试剂盒，所述诊断试剂和诊断试剂盒包含对每个载脂蛋白C1、载脂蛋白（a）、神经细胞粘附分子L1样蛋白、碳酸酐酶1和纤维连接蛋白的特异性抗体中的两个或两个以上抗体。所述诊断试剂和试剂盒可包括所述五个蛋白标记物的各特异性抗体中的优选三个抗体，更优选四个抗体，最优选五个抗体。 

为了制备能与各蛋白标记物有选择性地结合的抗体，首先要准备上述蛋白标记物。所述蛋白标记物是使用氨基酸序列SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 5合成的，或者利用基因重组在微生物中产生的，再或者从血液中直接分离得到的。 

鉴于本发明的目的，上述抗体可包含多克隆抗体和单克隆抗体，但优选与抗原更能特异性结合的单克隆抗体。 

根据本领域已知的常用方法向外部宿主注射作为抗原的蛋白标记物或其片段来制备所述多克隆抗体。这种外部宿主可以包括，例如哺乳动物，如小鼠、大鼠、羊和兔。所述抗原通常与用来增强抗原性的佐剂一起通过肌肉注射、腹腔注射或皮下注射进行给药，从而使外部宿主免疫化。从免疫外部宿主中定期收集血清。随后，可获取示出效价有提高且对抗原具有特异性的血清，或从所述血清中分离并提纯抗体，从而制备所述标记蛋白的特异性多克隆抗体。 

所述单克隆抗体可通过本领域中已知的经融合的永生化细胞株的生产过程（Kohler G. et al., Nature, 256: 495-497, 1975）来进行制备。简单说明一下上述过程，首先用纯标记蛋白或其片段免疫小鼠。或者，通过合成所述标记蛋白的肽并使之与牛血清白蛋白结合来免疫小鼠。将从所述免疫小鼠中分离的能产生抗体的B淋巴细胞与人或小鼠的骨髓瘤细胞融合，以生成永生化杂交瘤细胞。随后，通过酶联免疫吸附分析法（ELISA）调查在所述杂交瘤细胞中单克隆抗体的形成，而选取阳性克隆。培养所选取的克隆，然后分离并提纯抗体。或者将所述克隆注射到大鼠的腹腔内而收集腹水，从而制备所述标记蛋白的特异性单克隆抗体。 

在本发明的蛋白标记物的检测中使用的抗体包括具有两条全长轻链和两条全长重链的完整形式以及抗体分子的功能性片段。所述抗体分子的功能性片段是指至少具有抗原结合能力的片段。例如，Fab、F(ab’)、F(ab')2、Fv等。 

本发明的用于乳腺癌的诊断试剂盒包含能有选择地识别所述五个蛋白标记物中的各蛋白标记物的抗体以及在本领域中通常用于免疫分析的工具和试剂。 

根据本发明的一个实施例，所述用于乳腺癌的诊断试剂盒可包含：所述五个蛋白标记物的五个特异性抗体中的两个或两个以上抗体；二级抗体结合物，该二级抗体结合物与通过与基质的反应而显色的标记物结合；与所述标记物进行显色反应的显色基质溶液；清洗液；及酶反应终止液。 

本发明的用于乳腺癌的诊断试剂可进一步包含含有所述五个标记蛋白标准抗原的阳性对照组和含有未导入所述抗原的动物的抗血清的阴性对照组。 

本发明的用于乳腺癌的诊断试剂可通过抗原-抗体结合反应定量或定性分析所述抗体蛋白的抗原来诊断乳腺癌。可通过利用常用的酶联免疫吸附分析法（ELISA）、放射免疫分析法（RIA）、夹心法、免疫印迹法、免疫沉淀法、免疫组织化学染色法、荧光免疫分析法、酶基质着色法、抗原抗体聚集法等来检测所述抗原-抗体结合反应。例如，提供所述诊断试剂盒来进行通过利用表面上涂有检体和对照物的96孔酶标板与重组单克隆抗体蛋白进行反应的ELISA。 

这里使用的用于所述抗原-抗体结合反应的固定体可包括硝酸纤维素膜、PVDF膜、由聚乙烯醇树脂或聚苯乙烯树脂合成的孔板、由玻璃制成的载玻片等。 

所述二抗标记物优选为用于显色反应的常用显色剂。这里使用的标记物可包含荧光素和染料，该荧光素和染料包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、胶体金、聚L-赖氨酸-异硫氰酸荧光素（FITC）或罗丹明B异硫氰酸酯（RITC）。 

优选地，根据进行显色反应的标记物来使用用来诱导显色的显色基质。例如，这里使用的显色基质选自3,3'，5,5' - 四甲基联苯胺（TMB）、2,2' - 连氮基 - 双（3 - 乙基苯并噻唑-6 - 磺酸（ABTS）、邻苯二胺（OPD）等。优选地，提供溶解于缓冲液（0.1M NaAc，pH 5.5）中的显色基质。用作所述二级抗体结合物的标记物的HRP分解如TMB的显色基质而形成显色沉淀物。可通过用肉眼检查所述显色沉淀物的沉淀水平来检测所述标记蛋白的存在与否。 

所述清洗液优选地包含磷酸盐缓冲液、氯化钠和吐温20。优选由0.02M磷酸缓冲液、0.13M NaCl和0.05％吐温20组成的缓冲液（PBST）。待抗原-抗体结合反应后，所述二抗与所述抗原-抗体结合物进行反应。在固定体中加入适当量的清洗液并清洗3～6次。这里使用的反应终止液可优选地包含硫酸溶液（H₂SO₄）。 

此外，本发明的另一方面提供通过抗原-抗体结合反应并利用各蛋白标记物的特异性抗体在血液样本中检测载脂蛋白C1、载脂蛋白（a）、神经细胞粘附分子L1样蛋白、碳酸酐酶1和纤维连接蛋白中的两个或两个以上蛋白标记物的方法。优选地，本发明提供通过抗原-抗体结合反应并利用所述五个蛋白中各蛋白标记物的特异性抗体在血液样本中检测三个蛋白标记物的方法。更优选地，本发明提供用于检测四个蛋白标记物的方法。最优选地，本发明提供用于检测五个蛋白标记物的方法。 

上述检测方法包括：固定血液中的蛋白或用电泳（SDS-PAGE)）分离蛋白；将所述蛋白转移至PVDF膜上；将所述蛋白与能够有选择地识别上述蛋白标记物群中的蛋白的抗体进行接触，并通过抗原-抗体结合反应间接地检查所述标记蛋白群的存在。所述抗原-抗体结合反应可包括酶联免疫吸附分析法（ELISA）、放射免疫分析法（RIA）、夹心法、免疫印迹法、免疫沉淀法、免疫组织化学染色法、荧光免疫分析法、酶基质着色法、抗原抗体聚集法等。这里使用的样本可包括血清、血浆或血液。最优选为血浆。 

根据本发明的一个优选实施例，上述检测方法可包括以下步骤： 

i） 在固定体上涂敷或固定从受试者的血液样本中获得的蛋白质和从对照组的血液样本中获得的蛋白质；

ii）在上述固定体上加入载脂蛋白C1、载脂蛋白（a）、神经细胞粘附分子L1样蛋白、碳酸酐酶1和纤维连接蛋白中各蛋白的特异性抗体中的两个或两个以上抗体以进行抗原-抗体结合反应；

iii）通过利用二级抗体结合物和显色基质溶液来检测通过所述抗原-抗体结合反应所生成的抗原-抗体结合反应产物；以及

iv）将与所述受试者的血液样本和所述对照组的血液样本有关的检测结果进行比较。

上述检测方法的一个实施例包括：首先，通过电泳从血液样本中按分子量分离血浆蛋白质；将分离蛋白转移并固定在如PVDF膜的固定体上。然后，通过在所述固定蛋白抗原中加入各标记蛋白的特异性抗体，来进行抗原-抗体结合反应。如果所述标记蛋白存在于血液样本中，当在所述固定膜上添加所述标记蛋白的特异性抗体时会发生抗原-抗体结合反应。为了检测所述标记蛋白与其抗体的结合水平，将如抗人IgG-HRP的具有亲和性的二抗与所述标记蛋白抗体进行结合。观察与所述二抗结合的辣根过氧化物酶(HRP)与增强化学发光（ECL）基质反应时能否显色，并将所述显色的程度与对照组的显色程度进行对比。由此，检测血液样本中用于诊断乳腺癌的蛋白标记物的存在与否及与对照组相比时蛋白标记物量的增加或减少。 

另一方面，当使用将本发明的五个蛋白标记中各蛋白标记的特异性抗体中的两个或两个以上抗体固定于生物微芯片上并与从受试者分离出的血液样本进行反应以检测所述抗体蛋白的抗原的生物微芯片和自动化微阵列系统时，其优点在于通过一次性分析即可分析大量的样本。因此，本发明提供生物芯片，其中将本发明的五个蛋白标记中各蛋白标记的特异性抗体中的两个或两个以上抗体集成到一固体基质上。这里使用的生物芯片的固体基质可包括，如塑料、玻璃、金属、硅胶等。 

有益效果 

如上所述，通过MRM方法在血液中检测包含本发明的五个蛋白标记物中两个或两个以上蛋白标记物的生物标记物组的方法具有如下优点，即作为使用患者血液的新型诊断工具，具有优异的敏感性，而且待测的对蛋白的选择性高于通过利用抗原-抗体的常用的免疫化学方法。进一步，能简易地分析血液，而不用活检。由于使用所述生物标记物组的抗体的用于诊断乳腺癌的试剂盒和方法将相对容易收集的血液用作样本，在对患者无负担的状态下简便地进行诊断，这与要进行活检的传统的诊断乳腺癌的方法是不同的。因此，诊断乳腺癌的准确度和选择性均高。通过MRM方法或抗原-抗体反应的检测这种生物标记物组的方法与使用单一标记物的诊断方法提供很高的准确度和选择性。因此，可有效地适用于乳腺癌的早期诊断。

附图说明

图1a和1b为展示了抗原浓度（相对大肠杆菌β-半乳糖苷酶的比例）的图，其中通过MRM方法从80名乳腺癌患者和80名非患者（对照组）中测量载脂蛋白C1标记蛋白： 

a：箱形图；和

b：ROC曲线。

图2a和2b为展示了抗原浓度（相对大肠杆菌β-半乳糖苷酶的比例）的图，其中通过MRM方法从80名乳腺癌患者和80名非患者（对照组）中测量载脂蛋白（a）标记蛋白： 

a：箱形图；和

b：ROC曲线。

图3a和3b为展示了抗原浓度（相对大肠杆菌β-半乳糖苷酶的比例）的图，其中通过MRM方法从80名乳腺癌患者和80名非患者（对照组）中测量神经细胞粘附分子L1样蛋白： 

a：箱形图；和

b：ROC曲线。

图4a和4b为展示了抗原浓度（相对大肠杆菌β-半乳糖苷酶的比例）的图，其中通过MRM方法从80名乳腺癌患者和80名非患者（对照组）中测量碳酸酐酶1标记蛋白： 

a：箱形图；和

b：ROC曲线。

图5a和5b为展示了抗原浓度（相对大肠杆菌β-半乳糖苷酶的比例）的图，其中通过MRM方法从80名乳腺癌患者和80名非患者（对照组）中测量纤维连接蛋白标记蛋白： 

a：箱形图；和

b：ROC曲线。

图6a为以ROC曲线展示抗原浓度（相对大肠杆菌β-半乳糖苷酶的比例）的图，其中通过MRM方法从80名乳腺癌患者和80名非患者（对照组）中测量表1中显示的生物标记物组。图6b为以ROC曲线展示抗原浓度（相对大肠杆菌β-半乳糖苷酶的比例）的图，其中通过MRM方法从37名乳腺癌I期患者和80名非患者（对照组）中测量表1中显示的生物标记物组。 

具体实施方式

通过以下实施例进一步说明本发明，但对本发明的解释不会限制本发明的范围。 

实施例1.  通过利用多反应监测（MRM）对用于诊断乳腺癌的生物标记物组的检测

为了检查表1中展示的蛋白群能否用作在血液中有选择地诊断乳腺癌的标记物，如下本发明人利用了通过使用三重四极杆质谱仪的多反应监测（MRM）进行定量分析的方法 （Anderson L. et al., Mol Cell Proteomics, 5: 375-88, 2006）。MRM是指主要用于利用质谱仪的定量分析中的方法，通过观察从感兴趣的母离子中产生特定子离子来获得信息。例如，如果多个m/z 1000母离子中只有一个离子具有m/z 500子离子，MRM就是选择m/z 1000母离子并使之弄成片段，然后检查并追踪m/z 500子离子。

为了确认本发明的五个生物标记蛋白的效率，将比较从80名乳腺癌患者和80名非患者中获得的血液样本中所述蛋白的表达水平，通过统计处理来确认所述生物标记物组的诊断乳腺癌的效率。从160人中获得的血液中分别制备200蛋白样本。用10 mM二硫苏糖醇处理各制备样本并反应1小时，从而断开蛋白质中氨基酸的胱氨酸的巯基残基之间的结合，而这能干扰蛋白质成为肽片段的过程。用60 mM碘乙酰胺处理此断开的巯基结合并在无光线的地方反应1小时以防止巯基残基之间的再结合。为了制备蛋白样本，添加相当于整个蛋白200五十分之一的4胰蛋白酶20（Promega, USA），然后在37℃下处理16小时，从而分离出纯的肽片段。由此获得的肽片段通过使用C18色谱柱去除盐而制成用于质谱的最终样本。

为了进行MRM分析，选取能够代表特定蛋白的肽，从所述肽中通过断裂产生子离子，即应选取能够有效地监测所述靶肽的一对母离子和子离子。为了选取表1中显示的五个蛋白的一对母离子和子离子，通过串联质谱从所述血液样本中鉴定出载脂蛋白C1和载脂蛋白（a）。从串联质谱光谱中，选取能够代表载脂蛋白C1的SEQ ID NO: 6肽和能够代表载脂蛋白（a）的SEQ ID NO: 7肽，而且还选取这些肽的一对母离子和子离子，在以下表2展示其结果。为了确认从所述直接的串联质谱中未能查出的其他三个蛋白在柱上的停留时间及其串联质谱光谱，合成能够分别代表其他三个蛋白（神经细胞粘附分子L1样蛋白、碳酸酐酶1和纤维连接蛋白）的肽（JPT Peptide Technologies Gmbh, Germany）。结果，所选取的神经细胞粘附分子L1样蛋白为如SEQ ID NO: 8所示的肽，所选取的碳酸酐酶1为如SEQ ID NO: 9所示的肽，以及所选取的纤维连接蛋白为如SEQ ID NO:10所示的肽。选取这些肽的一对母离子和子离子。在下面表2中展示其结果。

【表2】 

通过反相树脂层析，从实施例1.1中制备的最终样本中分离出血浆肽片段。基于此，利用三重四极杆质谱仪（apparatus: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA）获得各肽的MRM谱图。所述反相树脂层析是通过HALO^TM C18柱（Eksigent, USA）利用5%~40%乙腈浓度梯度进行了45分钟的层析。用MultiQuant^TM计算机定量分析程序（AB Sciex, USA）计算所述靶肽的MRM色谱图的峰面积。各靶肽的定量是用相对于作为内标物导入的大肠杆菌β-半乳糖苷酶（表2）的峰面积的百分比表示的。通过获得各肽的MRM色谱面积比来确认乳腺癌患者与非患者对照组之间蛋白质表达水平的差异。

在图表中展示了通过上述方法测得的五个蛋白中各蛋白的浓度。具体地，如SEQ ID NO: 1所示的载脂蛋白C1所示，图1a的箱形图中展示的结果可证明乳腺癌患者的上述标记蛋白与非患者对照组相比减少了1.41倍。此外，如图1b的受体运作特性（ROC）曲线中所示的结果可证明上述标记蛋白的曲线下面积（AUC）为0.71。 

如SEQ ID NO: 2所示的载脂蛋白（a）所示，图2a的箱形图中展示的结果可证明，乳腺癌患者的上述标记蛋白与非患者对照组相比增加了1.35倍。此外，如图2b的受体运作特性（ROC）曲线中所示的结果可证明，上述标记蛋白的曲线下面积（AUC）为0.64。 

如SEQ ID NO: 3所示的神经细胞粘附分子L1样蛋白所示，图3a的箱形图中展示的结果可证明，乳腺癌患者的上述标记蛋白与非患者对照组相比增加了1.43倍。此外，如图3b的受体运作特性（ROC）曲线中所示的结果可证明，上述标记蛋白的曲线下面积（AUC）为0.75。 

如SEQ ID NO: 4所示的碳酸酐酶1所示，图4a的箱形图中展示的结果可证明，乳腺癌患者的上述标记蛋白与非患者对照组相比增加了1.60倍。此外，如图4b的受体运作特性（ROC）曲线中所示的结果可证明，上述标记蛋白的曲线下面积（AUC）为0.72。 

如SEQ ID NO: 5所示的纤维连接蛋白所示，图5a的箱形图中展示的结果可证明，乳腺癌患者的上述标记蛋白与非患者对照组相比增加了1.56倍。此外，如图5b的受体运作特性（ROC）曲线中所示的结果可证明，上述标记蛋白的曲线下面积（AUC）为0.70。 

作为参考，所述ROC曲线为通过所观察的整个数据范围内连续变化测定效价而获得的成双的感受性/特异性的图表，该曲线主要展示了测定的准确度（Zweig et al., Clin. Chem. 39:561-577, 1993）。 

通过logistic回归，将实施例1.2中鉴定的所述五个标记蛋白群的定量结果进行整合，然后制备由多数标记物（多标识标记物）组成的一个诊断标记物，来确认乳腺癌的诊断效率。

因此，图6a中对80名乳腺癌患者和80名非患者对照组的受体运作特性（ROC）曲线的结果证明，所述多标识标记物的曲线下面积（AUC）为0.86。其结果展示了与80%特异性对应的敏感性为75%。由此可知，上述分析与传统的单一标识标记物相比具有更高的敏感性和准确性。

此外，图6b中对80名非患者和37名乳腺癌I期患者的受体运作特性（ROC）曲线的结果证明，所述多标识标记物的曲线下面积（AUC）为0.92。此外，其结果展示了与80%特异性对应的敏感性为92%。由此可知，上述分析在诊断初期乳腺癌中极为有效。