本发明属于微生物基因检测领域，具体涉及一种用于鉴别结核分枝杆菌和龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌的膜条及制备和使用方法；所述的特异性探针包括用于检测结核分枝杆菌的碱基序列SEQ ID NO.1‑2；用于检测龟分枝杆菌的碱基序列SEQ ID NO.3‑4；用于检测脓肿分枝杆菌的碱基序列SEQ ID NO.5‑6以及分枝杆菌属质控探针SEQ ID NO.7‑8；对应的引物对为SEQ ID NO.9‑10。本申请建立起了一种快速、准确的区分结核分枝杆菌、龟、脓肿分枝杆菌的检测方法，可作为一种市场化分枝杆菌菌种鉴定试剂盒的有益补充鉴定方法，具有良好的临床应用前景。
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