抗EGFRvIII抗体及其在疾病诊断或治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，本发明涉及针对表皮生长因子受体（EGFR）的缺失突变体（变体III）的特异性结合分子，特别是抗体或其片段，以及该特异性结合分子在肿瘤或癌症诊断和治疗中的应用。

背景技术

表皮生长因子受体（EGFR）是原致癌基因c-erb B的170,000道尔顿的膜糖蛋白产物。已证实EGFR在多种类型的人实体肿瘤中过量表达，例如已在某些肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、肾癌和前列腺癌中均观察到了EGFR的过量表达，并且证实表皮生长因子（EGF）和转化生长因子-α（TGF-α）都结合至EGFR，而且导致细胞增殖和肿瘤生长。

包含显著比例的EGFR基因扩增的肿瘤也共表达截短形式的EGFR，其中最常见的为EGFR的缺失突变体即变体III（EGFRvIII）。EGFRvIII也可称为de2-7EGFR、ΔEGFR或Δ2-7，这些术语在本文可互换使用。EGFRvIII的特征为，由于EGFR基因的外显子2-7缺失，导致相应的蛋白EGFRvIII缺失第6-273位氨基酸残基（编号根据成熟的EGFR），并且在融合连接处产生新的Gly残基。EGFRvIII的这一缺失连同Gly的插入一起在缺失界面上产生了独特的连接肽。

EGFRvIII已在许多肿瘤类型中得到报道，包括神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌等。虽然这种截短受体不结合配体，但研究证明，它由于具有低组成型活性而促进肿瘤进展，并且已有实验证明癌细胞对EGFRvIII表达具有依赖性。因此，EGFRvIII已经成为癌症治疗或诊断的合适靶标，特别是与EGFRvIII表达或EGFR过表达有关的实体瘤疾病中。

EGFRvIII作为肿瘤特异性抗原，针对其的抗体已经得到多项开发和应用。已知的EGFRvIII抗体包括L8A4、AMG595、AFM-22等，但在EGFRvIII特异性及ADCC活性上均有待提高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，通过EGFRvIII中表位作为免疫原免疫动物，并经过B细胞选择技术，获得特异性结合分子，该分子对人EGFRvIII具有高特异性且对EGFRvIII表达细胞具有显著的抗体依赖性细胞介导的毒性作用。

因此，本发明的目的是提供一种抗人EGFRvIII的抗体或其抗原结合片段。相比于现有EGFRvIII抗体，所提供的抗体具有更好的抗原结合活力和ADCC、ADCP等活性。

本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种抗人EGFRvIII的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有示于SEQ ID NO: 4的重链可变区（VH）和示于SEQ ID NO: 8的轻链可变区（VL）。

本发明提供的抗体或其抗原结合片段针对人EGFRvIII，优选与人EGFRvIII PEP3（SEQ ID NO: 9）结合；并且所述抗体或其抗原结合片段不结合EGFR。

优选地，本发明提供的抗体为单克隆抗体或单链抗体，其中所述单克隆抗体具有重链（HC）和轻链（LC）。优选地，本发明提供的抗体为鼠源抗体或嵌合抗体；其中更优选为嵌合抗体，所述嵌合抗体优选具有IgG1型的重链恒定区（CH）和kappa型的轻链恒定区（CL）。

根据本发明的具体实施方式，所述嵌合抗体具有示于SEQ ID NO: 10的重链恒定区（CH）和示于SEQ ID NO: 11的轻链恒定区（CL）。

本发明提供的抗体或其抗原结合片段可以利用本领域已知的任何方法获得。根据本发明的具体实施方式，可以在分别获得编码本发明抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列后，将其与编码所选择的重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列的核苷酸序列分别进行搭桥PCR并连接到pcDNA3.1/GS质粒，进而将构建好的轻重链质粒共转染到CHO-K1细胞中进行表达，经Protein A纯化获得本发明的抗体。

另一方面，本发明提供一种核酸分子，其核苷酸序列编码本发明任意抗体或其抗原结合片段中的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，所述核苷酸序列示于SEQ ID NO:20和SEQ ID NO: 22。或者，其核苷酸序列编码本发明任意抗体或其抗原结合片段中的重链和轻链的氨基酸序列，所述核苷酸序列示于SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 23。

还一方面，本发明提供一种包含所述核酸分子的载体。所述载体例如真核表达载体、原核表达载体、人工染色体及噬菌体载体等。根据本发明的具体实施方式，所述载体为pcDNA3.1/GS质粒，空白质粒的核苷酸序列示于SEQ ID NO: 24。

本发明的载体或核酸分子可以用于转化或转染宿主细胞或以任何方式进入宿主细胞内，用于保存或表达抗体等目的。因此，另一方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的核酸分子和/或载体，或者所述宿主细胞被本发明的核酸分子和/或载体转化或转染。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。根据本发明的具体实施方式，所述宿主细胞为被本发明的上述载体转染的CHO-K1细胞。

又一方面，本发明提供所述抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体或宿主细胞在制备用于治疗肿瘤或癌症的药物中的用途，所述肿瘤或癌症与EGFRvIII过表达相关，或者所述肿瘤或癌症的细胞中过表达EGFRvIII。优选地，所述肿瘤或癌症为神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌或前列腺癌。

此外，本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明提供的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体或宿主细胞。所述试剂盒可用于诊断肿瘤或癌症，所述肿瘤或癌症与EGFRvIII过表达相关，或者所述肿瘤或癌症的细胞中过表达EGFRvIII。优选地，所述肿瘤或癌症为神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌或前列腺癌。

本发明提供了一种能够以更高亲和力特异性结合EGFRvIII的抗体，该抗体不与EGFR相结合；相比于现有抗体，该抗体具有针对表达EGFRvIII的靶细胞的更高ADCC、ADCP活性，因此可以作为与EGFRvIII表达相关的肿瘤或癌症的治疗或诊断手段。此外，本发明提供的抗体还可以与其他化学治疗剂或抗癌剂或者与其他抗体或其片段组合用于所述肿瘤或癌症的治疗中。

附图说明

以下结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示了本发明的抗EGFRvIII嵌合抗体与人EGFRvIII PEP3的结合活性。

图2显示了本发明的抗EGFRvIII嵌合抗体与EGFR表达靶细胞的ADCC活性。

图3显示了本发明的抗EGFRvIII嵌合抗体与EGFRvIII表达细胞的ADCC活性。

图4显示了本发明的抗EGFRvIII嵌合抗体与EGFR表达靶细胞的ADCP活性。

图5显示了本发明的抗EGFRvIII嵌合抗体与EGFRvIII表达细胞的ADCP活性。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1：>

通过中肽生化有限公司常规合成14-mer人EGFRvIII PEP3（LEEKKGNYVVTDHC；SEQ IDNO: 9）。

在10mg匙孔血蓝蛋白（KLH；Biosyn，Carlsbad，CA）中加入SMCC至终浓度为400nmol/l，并使用PBS缓冲液稀释KLH浓度至10mg/ml，简短涡旋后在摇床上保持40min。然后，取2.6mg EGFRvIII PEP3与该KLH溶液混合，4℃静置过夜。使用脱盐柱除去未反应组分并置换缓冲液至PBS缓冲液，得到KLH-pep3蛋白溶液。

实施例2：>

2.1 动物免疫

a) Day-3，每只待免疫Balb/c小鼠眼眶采血100-150μl，收集血清，-80℃保存，待用作阴性对照；

b) Day0，一免：将实施例1中制备的KLH-pep3蛋白溶液（1mg/ml）与弗氏完全佐剂（Complete Freund’s Adjuvant，CFA）（美国Chondrex公司，货号7002）按体积比1:1混合制成乳剂，按照50μg蛋白/0.2ml/只小鼠进行皮下多点免疫；

c) Day14，二免：将KLH-pep3蛋白溶液与弗氏不完全佐剂（Incompleted Freund’sAdjuvant，IFA）（美国，Chondrex，货号7023）按体积比1:1混合制成乳剂，按照50μg蛋白/0.2ml/只小鼠进行腹腔注射免疫；

Day21，每只小鼠眼眶采血100-150μl，收集血清，-80℃保存；用KLH-pep3蛋白包板，进行滴度检测；

d) Day35，三免：免疫方法与二免相同；

Day42，每只小鼠眼眶采血100-150μl，收集血清，-80℃保存；用KLH-pep3蛋白包板，进行滴度检测；

e) 当滴度满足要求后（1：100000），于上次免疫的第21天后终免（boost）：将KLH-pep3蛋白用生理盐水配制成500μg/ml浓度，Balb/c小鼠尾静脉或者腹腔注射0.1ml/只，即每只小鼠静脉注射50μg蛋白；

f) 终免后3-4天，每只免疫小鼠分别采血后安乐死，取脾脏，将脾脏放到无菌PBS缓冲液中。

表1 小鼠的终免效价测定结果

2.2 B细胞的淘选及培养

如Babcook等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，93: 7843-7848 (1996)所描述，将人EGFRvIII PEP3（实施例1）按照1µg/ml包被于聚苯乙烯板中，然后将来自2731小鼠的B细胞以2×10⁷个细胞/板在该聚苯乙烯板上进行淘选，将淘选获得的B细胞按照50个细胞/孔的密度在96孔板中培养出B细胞克隆，将这些细胞在EGFRvIII>

2.3 B细胞克隆的基因克隆、表达及纯化

将识别出的OD≥2.0的6个EGFRvIII PEP3 ELISA阳性孔的B细胞收集起来并提取mRNA，使用PureLink RNA试剂盒（Thermo，cat. 12183018A）从上述B细胞中提取mRNA。

用Oligo dT Primer和PrimeScript II RTase逆转录酶（Takara，cat. 6210A）从mRNA合成总cDNA，然后使用文献（MJ Coloma, A Hastings, LA Wims, et al. Journal ofImmunological Methods, 1992 , 152 (1) :89-104）报道的引物钓取抗体可变区基因，并连接到T载体进行测序。

将鼠源抗体重链可变区和轻链可变区分别与人IgG1恒定区和人Kappa恒定区进行搭桥PCR构建嵌合抗体，并连接到pcDNA3.1/GS质粒中。将构建好的轻重链质粒共转染到CHO-K1细胞中，通过Protein A纯化抗EGFRvIII嵌合抗体，获得2731-7hIgG1κ、2731-22hIgG1κ、2731-26-1hIgG1κ、2731-51hIgG1κ、2731-58hIgG1κ、2731-62hIgG1κ以及L8A4-hIgG1κ等7个抗EGFRvIII的嵌合抗体。

表2 嵌合抗体及其重轻链可变区

实施例3：野生型EGFR（SEQ>

使用PureLink RNA试剂盒（Thermo，cat.12183018A）从A431（ATCC）中提取mRNA。用Oligo dT Primer和PrimeScript II RTase逆转录酶（Takara，cat. 6210A）从mRNA合成总cDNA。使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶（Takara，cat. R010Q），用下列引物由A431 cDNA扩增2.3kb的PCR产物：

正义引物：

5′- GGGGTACCCGCCACCATGCGACCCTCCGGGACGGCCG-3′

反义引物：

5′- GCTCTAGATCATGGACGGGATCTTAGGCCC-3′

将PCR产物用KPN I和Xba I消化，凝胶纯化，并连接到被KPN I和Xba I线型化的质粒pcDNA3.1(+)（Thermo，cat. V79020）中，以产生质粒pcDNA3.1(+)/EGFR。

实施例4：>

由苏州金维智生物科技有限公司进行EGFRvIII基因合成，并构建到pcDNA3.1(+)载体中，以产生质粒pcDNA3.1(+)/EGFRvIII。

实施例5：>

HEK293细胞按照50%汇合度进行传代，第二天汇合度可达80~90%，用于PEI转染：取5µgpcDNA3.1(+)/EGFR质粒，加入到250µl DMEM中，混匀后室温放置2-3min；取15µg PEI，加入到250µl DMEM中，混匀后室温放置2-3min；将混匀后的PEI溶液与上述质粒溶液进行再次混匀，并放置到37℃，5%>2孵箱中孵育15~20分钟；随后将HEK293细胞用PBS缓冲液洗一次，倒尽PBS缓冲液，加入孵育好的PEI与质粒溶液，37℃，5%>2孵箱中孵育6个小时；然后加入预热的补充10%>

实施例6：>

具体方法同实施例5。

实施例7：>

人EGFRvIII PEP3（实施例1）按照50µl/孔，10µg/ml包到96孔板中，4℃过夜；PBST缓冲液洗涤三次，以100µl/孔加入PBS缓冲液+1% BSA封闭液，室温放置1 h；PBST缓冲液洗涤三次，将抗EGFRvIII嵌合抗体（实施例2）从1µg/ml起始3倍稀释，以50µl/孔加入，室温放置1h；PBST缓冲液洗涤三次，以50µl/孔加入HRP标记的羊抗人二抗（南京金斯瑞生物科技有限公司，货号A00166）（1:10000稀释），室温放置1 h；PBST缓冲液洗涤三次，以50µl/孔加入TMB，避光显色10min，以100µl/孔加入2M硫酸终止。

抗EGFRvIII嵌合抗体与人EGFRvIII PEP3的直接结合活性比较结果见表3和图1。可知除了2731-51hIgG1κ，其余抗体与人EGFRvIII PEP3的结合活性明显高于L8A4-hIgG1κ。

表3 抗EGFRvIII嵌合抗体与PEP3的直接结合活性比较

实施例8：>

效应细胞：能够高表达hFcγRIIIa，同时成功转染NFAT-RE-luc的jurkat细胞克隆（参考文献见WO2012121911A2），培养基为1640；

靶细胞：HEK293/EGFR，实施例5中构建，培养基为1640。

抗EGFRvIII嵌合抗体起始浓度为10000ng/ml，用不含FBS的1640培养基三倍梯度稀释，共12个浓度梯度。吸除靶细胞的培养基，将梯度稀释的抗体加入靶细胞中，每孔30μl。用新鲜的含10% FBS的1640培养基调整效应细胞密度至4×10⁶个细胞/ml，30μl/孔加入到已经加好抗体的靶细胞中，37℃孵箱孵育16-24h。加入Bio-Glo>

结果见图2。可知评价的抗体对EGFR靶细胞无ADCC活性，表明这些抗体在发挥功能的时候具有EGFRvIII特异性，不会交叉杀伤EGFR过表达细胞。

实施例9>

效应细胞：能够高表达hFcγRIIIa，同时成功转染NFAT-RE-luc的jurkat细胞克隆（参见WO2012121911A2），培养基为1640；

靶细胞：HEK293/EGFRvIII，实施例6中构建，培养基为1640。

抗EGFRvIII嵌合抗体起始浓度为10000ng/ml，用不含FBS的1640培养基三倍梯度稀释，共12个浓度梯度。吸除靶细胞的培养基，将梯度稀释的抗体加入靶细胞中，每孔30μl。用新鲜的含10% FBS的1640培养基调整效应细胞密度至4×10⁶个细胞/ml，30μl/孔加入到已经加好抗体的靶细胞中，37℃孵箱孵育16-24h。加入Bio-Glo>

结果见表4和图3。可知，本发明的嵌合抗体2731-58hIgG1κ对EGFRvIII靶细胞的ADCC活性明显高于对照L8A4hIgG1κ。

表4 抗EGFRvIII嵌合抗体对HEK293/EGFRvIII靶细胞的ADCC活性比较

实施例10>

效应细胞：能够高表达hFcγRIIa，同时成功转染NFAT-RE-luc的jurkat细胞克隆（参见WO2012121911A2），培养基为1640；

靶细胞：HEK293/EGFR，实施例5中构建，培养基为1640。

抗EGFRvIII嵌合抗体起始浓度为100000ng/ml，用不含FBS的1640培养基三倍梯度稀释，共12个浓度梯度。吸除靶细胞的培养基，将梯度稀释的抗体加入靶细胞中，每孔30μl。用新鲜的含10% FBS的1640培养基调整效应细胞密度至4×10⁶个细胞/ml，30μl/孔加入到已经加好抗体的靶细胞中，37℃孵箱孵育16-24h。加入Bio-Glo>

结果见图4。可知评价的抗体对EGFR靶细胞无ADCP活性，表明这些抗体在发挥功能的时候具有EGFRvIII特异性，不会交叉杀伤EGFR过表达细胞。

实施例11>

效应细胞：能够高表达hFcγRIIa，同时成功转染NFAT-RE-luc的jurkat细胞克隆（参见WO2012121911A2），培养基为1640；

靶细胞：HEK293/EGFRvIII，实施例6中构建，培养基为1640。

抗EGFRvIII嵌合抗体起始浓度为100000ng/ml，用不含FBS的1640培养基三倍梯度稀释，共12个浓度梯度。吸除靶细胞的培养基，将梯度稀释的抗体加入靶细胞中，每孔30μl。用新鲜的含10% FBS的1640培养基调整效应细胞密度至4×10⁶个细胞/ml，30μl/孔加入到已经加好抗体的靶细胞中，37℃孵箱孵育16-24h。加入Bio-Glo>

结果见表5和图5。可知，本发明的嵌合抗体2731-58hIgG1κ对EGFRvIII靶细胞的ADCP活性明显高于对照L8A4hIgG1κ。

表5 抗EGFRvIII嵌合抗体对HEK293/EGFRvIII靶细胞的ADCP活性比较

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

序列表

<110>南京诺艾新生物技术有限公司

<120>抗EGFRvIII抗体及其在疾病诊断或治疗中的应用

<130>LC19110095

<160>24

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>116

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

202530

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

354045

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

505560

Arg Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65707580

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Thr Leu Tyr Asp Tyr Asp Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210>2

<211>114

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

202530

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

354045

Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Ile Lys Phe Asp Pro Lys Phe

505560

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65707580

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Gly Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Leu Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ala

<210>3

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

202530

Tyr Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

354045

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Ser Asp Pro Lys Phe

505560

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65707580

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Asp Ala Asn Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210>4

<211>117

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

202530

Trp Met His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

354045

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Pro Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

505560

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65707580

Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Phe Gly Asn Tyr Val Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210>5

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 1015

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

202530

Asp Gly Lys Thr Phe Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

354045

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

505560

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65707580

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

859095

Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<210>6

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>6

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Ile Leu Leu Val Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Arg Asn Asp

202530

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Met

354045

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

505560

Ser Gly Tyr Gly Thr Tyr Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala

65707580

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Phe

859095

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<210>7

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>7

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 1015

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gly Gln Ser Val Val His Ser

202530

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

354045

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

505560

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Gln Ile

65707580

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

859095

Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210>8

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>8

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 1015

Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

202530

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

354045

Phe Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

505560

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala

65707580

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro His

859095

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210>9

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>9

Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His Cys

1 5 10

<210>10

<211>330

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>10

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 1015

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

202530

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

354045

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

505560

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65707580

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

859095

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>11

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>11

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 1015

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

202530

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

354045

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

505560

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65707580

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

859095

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210>12

<211>115

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>12

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Pro Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

202530

Trp Met His Trp Val Lys Leu Arg Pro Gly Gln Gly Phe Glu Trp Ile

354045

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

505560

Lys Arg Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65707580

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Thr Thr Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala

115

<210>13

<211>106

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>13

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 1015

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

202530

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

354045

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

505560

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala

65707580

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Asp Tyr Thr Ser His Thr

859095

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210>14

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>14

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 1015

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

202530

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

354045

Met Gly Tyr Ile Thr His Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

505560

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65707580

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

859095

Ala Arg Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210>15

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>15

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Val Ser Leu Gly

1 5 1015

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Gly Tyr

202530

Leu Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

354045

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

505560

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr

65707580

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asp Phe Pro Phe

859095

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210>16

<211>115

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>16

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

202530

Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

354045

Gly Gly Ile Asp Pro Asn Asn Gly Gly Thr Met Tyr Asn Gln Lys Phe

505560

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65707580

Thr Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Thr Arg Ala Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210>17

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>17

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

202530

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

354045

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

505560

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65707580

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Val Gln Asp

859095

Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210>18

<211>354

<212>PRT

<213>EGFRvIII

<400>18

Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys

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Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val

202530

Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly

354045

Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn

505560

Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile

65707580

Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu

859095

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100 105 110

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Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg

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165 170 175

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Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu

260 265 270

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275 280 285

Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys

290 295 300

Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala

305 310 315 320

Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly

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202530

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Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp

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180 185 190

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275 280 285

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290 295 300

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<212>DNA

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<400>20

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<210>21

<211>1398

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>21

atggaatggt cctgggtgtt tctgttcttc ctcagcgtga ccaccggcgt gcattcccag60

gtgcagctgc agcagccagg agctgagctg gtgaagccag gagcttccgt gaagctgagc 120

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gagaagttta agagcaaggc caccctgaca gtggacaagt ccagctctac cgcttatatg 300

cagctgacct ccctgacaag cgacgattct gccgtgtact attgtgcttt cggcaactac 360

gtgggctttg cctattgggg ccagggcacc ctggtgacag tgtctgctgc cagcaccaag 420

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gtgaatcaca agccatccaa tactaaagtc gacaagaaag tggagcccaa gagctgtgat 720

aaaacacata cttgcccccc ttgtcctgca ccagaactgc tgggaggacc atccgtgttc 780

ctgtttccac ccaagcctaa agacactctg atgatttctc gaacacccga ggtcacttgc 840

gtggtcgtgg acgtgtccca cgaggatcct gaagtcaagt ttaactggta cgtggatgga 900

gtcgaagtgc ataatgctaa gacaaaacct agagaggaac agtacaacag tacatataga 960

gtcgtgtcag tcctgactgt gctgcatcag gactggctga acgggaagga gtataagtgc1020

aaagtgtcca ataaggctct gcccgcacct atcgagaaaa ctattagcaa ggctaaaggc1080

cagcctaggg aaccacaggt gtacaccctg cctccatctc gggaggaaat gactaagaac1140

caggtcagtc tgacctgtct ggtgaaaggc ttctatcctt ccgacatcgc agtggagtgg1200

gaaagcaatg gacagccaga gaacaattac aagaccacac cccctgtgct ggacagcgat1260

gggtctttct ttctgtatag taagctgacc gtggataaat cacggtggca gcagggtaat1320

gtcttttctt gtagtgtgat gcacgaagcc ctgcacaacc attacactca gaaatccctg1380

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<210>22

<211>321

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>22

agcatcgtga tgacccagac acccaagttc ctgctggtgt ctgccggcga cagaatcacc60

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ggccagtctc ctaagctgct gatcttctac gcttccaatc gctataccgg agtgccagac 180

aggtttaccg gaaggggcta tggcacagat ttcaccttta caatctccac agtgcaggcc 240

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<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>23

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agcatcgtga tgacccagac acccaagttc ctgctggtgt ctgccggcga cagaatcacc 120

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aggtttaccg gaaggggcta tggcacagat ttcaccttta caatctccac agtgcaggcc 300

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<212>DNA

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ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

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gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccactagt ccagtgtggt ggaattctgc 960

agatatccag cacagtggcg gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca1020

gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc1080

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cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg1200

gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag1260

gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag cggcgcatta1320

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tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattaatt ctgtggaatg1740

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tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa1860

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tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt1980

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gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctcccggg agcttgtata tccattttcg2100

gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgac cacctcagca agttcccact2160

taaataaagg catcaagcag gtgtacatgt ccctgcctca gggtgagaaa gtccaggcca2220

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ttggccagga gaagaagggt tactttgaag atcgtcgccc ctctgccaac tgcgacccct3180

tttcggtgac agaagccctc atccgcacgt gtcttctcaa tgaaaccggc gatgagccct3240

tccagtacaa aaattaagcg ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa3300

cctgccatca cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat3360

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caatgtatct tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg3600

gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc3660

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ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact4080

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gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag4200

ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca4260

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cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc4380

gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag4440

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