法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2004-05-05
专利权的终止未缴年费专利权终止
专利权的终止未缴年费专利权终止
2001-03-21
授权
授权
1994-10-12
公开
公开
1994-10-05
实质审查请求的生效
实质审查请求的生效
本发明是属于含硒抗体酶的制备技术。
开发制备抗体酶的新方法是生物科学研究领域的前沿之一。鉴于抗体本身的分子可塑性，分子识别专一性和抗体变化的多样性等特点，予示抗体酶对于分子生物学、生物工程学及医学等领域具有广阔的应用前景。因此，英、美等国都在积极开发制备抗体酶的新方法。迄今，已成功开发的方法有：过渡态类似物法，熵阱法和引入法，引入法中又包括选择性化学修饰和蛋白质工程法。抗体酶所催化的反应也有40多种，尤其是有些反应是天然酶不能催化的。抗体酶的专一性一般等于或强于天然酶对底物的专一性，然而催化效率要比天然酶低2-3个数量级。因此，开发高活力抗体酶制备技术就成了科学家奋斗的目标。
抗体酶在医学上有巨大的应用潜力，现任欧州自由基研究会会长R.Evans于1993年指出，未来药物的发展方向是，既要有很强的药效，又要有指向病变器官的导向性。抗体酶是满足上述要求的最佳候选者。鉴于谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是抗衰老酶系的重要成员之一，能清除体内自由基，防止脂质过氧化，对防治各种炎症，心脑血管疾病、肿瘤等有明显疗效，因此制备具有GPX活力的抗体酶就显得特别有意义。
本发明的目的在于：应用标准的单克隆抗体制备技术与化学突变相结合的方法成功地制备了具有很高GPX活力的含硒抗体酶。
本发明是，先制备具有底物结合部位的单克隆抗体，然后用化学突变法将催化基团引入到单抗的结合部位，结果产生高活力抗体酶。含硒抗体酶的制备过程是：
还原型谷胱甘肽（GSH）与2，4-二硝基氯苯（DCNB）反应，制得S-取代的谷胱甘肽衍生物（GSH-S-DNP）作为半抗原;用戊二醛将GSH-S-DNP与牛血清白蛋白（BSA）偶联在一起，作为全抗原;将合成的全抗原加入福氏佐剂，注射给雌鼠进行免疫，然后用标准单抗制备法制备具有GSH结合部位的单抗。用苯甲基磺酰氟（PMSF）活化单抗可变区中丝氨酸残基（Ser）上的羟基，再用H2Se处理，则将Ser突变成硒代半胱氨酸（SeCys）。由于SeCys是GPX的催化基团，因而在单抗可变区既有底物结合部位，又有催化基团，结果产生高活力的含硒抗体酶。
本发明具有如下特点：
1.制备方法简单，仅使用标准单抗制备法和简单的化学突变法。
2.在不能知道反应的催化机理，不知道反应过渡态的情况下，仍可制备抗体酶。
3.可用本法扩大生产抗体酶，克服了天然GPX来源有限的缺点。
4.用本发明制出的含硒抗体酶活力高，已达到天然GPX的数量级水平。
5.用本发明制出的含硒抗体酶的稳定性比天然GPX高。
6.含硒抗体酶保持原有单抗的效价，因而可定向靠近病变靶部位。
实施例
1.02g GSH（3.32mmol）溶在10ml 1mol/L NaOH中，在冰浴中降温。再取溶在10ml乙醇中的DCNB 0.67g（3.6mmol）搅拌下慢慢加入到GSH溶液中，混合物在0℃保持10min，用稀调pH至4左右，得到亮黄色晶体，用热水重结晶，70℃烘干，即得纯品GSH-S-DNP 1.3g，产率90%。
10mg BSA与5.6mg GSH-S-DNP溶于1ml 0.2mol/L pH7.2的磷酸缓冲液（PBS）中，慢慢加入0.7ml戊二醛溶液，反应10h后，加入10mg甘氨酸终止反应，后用pH7.5，0.05mol/L PBS平衡的Ultrogel AcA 54柱（2.0×40cm）层析纯化产品，收集第一峰为抗原蛋白。
将合成的抗原加入福氏佐剂，注射给雌鼠（BALB/c）进行免疫。免疫的鼠脾细胞在PEG作用下与骨髓瘤细胞（NS-1）融合，播种在已加巨噬细胞的培养板中。用HAT培养液培养，用ELISA连续两次检测呈阳性的细胞株进行克隆，得到一阳性单克隆细胞株4A4，进行扩大培养。细胞培养液上清经层析纯化，得到4A4 IgG，此单抗具有底物（GSH）结合部位。
0.5mg冻干单抗溶在0.5ml pH7.0 0.05mol/L PBS中，加入10μl PMSF溶液（21mg PMSF溶在1ml乙腈中），室温振荡1h，在高纯氮保护下通入H2Se气体至饱和，再在40℃下保温36-40h，使反应完成。将反应液透析，冻干即得含硒抗体酶。
含硒抗体酶的活力为1097u/μmol，已达到天然酶活力（5780u/μmol）的数量级水平;抗体酶对GSH的米氏常数为2.7×10-4M，与天然GPX的米氏常数（3.0×10-3M）相比，提高了1个数量级;经测定，抗体酶的效价与突变前的单抗相同;抗体酶的硒含量为5>
含硒抗体酶的贮存稳定性
酶状态 贮存条件 半寿期(天)
溶液酶 15mg/ml pH7.2, 0.05mol/L PBS 15-20℃ 28
溶液酶 15mg/ml pH7.2, 0.05mol/L PBS 4℃ 79
冻干酶 室温 90天后活力仍
保持90%以上
机译： 减少含钴气态底物发酵以及发酵含钴气态底物和发酵培养基的细胞生物量硒水平降低的方法
机译： 选择性制备产生对人CD16抗原具有高细胞毒性的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法，以及使用此类单克隆抗体和CD30-HRS-3抗体制备双特异性单克隆抗体以治疗人类肿瘤的方法
机译： 以纯形式的单克隆抗体制备含干扰素的人类蛋白的方法及包含这些抗体的测试盒
