山楂的制剂、药用组合物及其预防由心动停止引起的突然死亡和再灌注引起的心血管损伤的用途

许多临床研究表明山楂种的叶和花和/或果实的提取物对心功能减退病人的治疗是有益的。多年的治疗经验也表明此提取物在不稳定功能性—植物性心绞痛以及轻度心动过缓性心律失常情况下的治疗作用。这些发现使Commission E of the German Health Authorities[KommissionE beim deutschen Bundesgesundheitsamt]公布了具有下列适应症的专题文章(见official Federal Gazette[Bundesanzeiger]dated03.01.1984)。

与NYHAI到II阶段相对应的心功能减退；血压敏感和心区狭窄，还不需要洋地黄治疗的老年心脏早衰和轻度心动过缓心律失常。

直到目前，通常因山楂提取物中存在有类黄酮和低聚原花青素来解释这些山楂提取物的已知的有益治疗作用以及药代动力学作用谱。所以，药物制剂按这些成分来标准化。这些已知的山楂提取物之一(WS1442)大约含有18.5—19.5％的低聚原花青素(OligomericProcyanidin)。

用实验诱导局部缺血的大鼠，在动物上进行试验，获得了本发明意外的发现。这些发现是，通过用水混合物和与水混溶的有机溶剂如乙醇提取获得的合适山楂植物种带花叶的提取物a)在心肌缺血和再灌注诱导的威协生命的心血损伤具有心脏保护作用，(b)而目前已知的山楂提取物的活性物质不产生这些作用；合适的山楂植物种如单子山楂(Crataegus monogyna TAQUIN emend.LINDMAN)，Crataegus Laerigata(POIRET)DE CANDOLLE syn.欧洲产山楂(Cratae-gus Oxyacantha L.P.P.et duct.)，Crataegus azarolusL.，Crataegus nigraWALDSTEIN et KITAIBEL和五蕊山楂(Crataegus Pentagyna WALD-STEIN et KITAIBEL ex WILLDENOW)。

由山楂提取物(下文称作部分(a))的这些作用会推断出山楂提取物在预防和治疗短期心缺血(心脏循环障碍)、再灌注引起的心损伤和由于心动停止的突然死亡以及其它由病理疾病引起的其它威肋生命的再灌注方面的治疗用途。

用三个新的山楂提取物部分进行的试验表明：山楂提取物特有的活性成分的分子量大于3000道尔顿。仍不知道该成分的结构。

试验物：

部分(a)单子山楂、laevigata山楂、azarolus山楂、nigra山楂和五蕊山楂的带花叶的总提取物，是用45％(重量)乙醇在60℃温度下提取得到的，含有18.5到19.5％低聚原花青素；

部分(b)分子量大于3000道尔顿的化合物部分，是用截止限3000道尔顿的膜过滤器对部分(a)进行超滤而获得的；

部分(c)，通过部分(a)在丁醇/水中液—液分布法(逆流萃取)获得的；

部分(d)从部分(a)中用吸附剂吸附除去类黄酮和原花色素(Proanthocyanidins)而获得的，该吸附剂可与这些化合物结合，特别是羟丙基化的多聚葡聚糖、聚酰胺、氧化铝或活性炭。

试验方法：

我们使用Selye(H.Selge等，Angiology 11(1960)，398—407)所描述的方法，该方法使用体重为250—350g的雄性Sprayue—Daw-ley大鼠并用戊巴比妥麻醉。通过冠状动脉结扎来引起心缺血并在缺血7分钟后再打开结扎口来开始再灌注。缺血前及期间以及再灌注后测量动物血压和心率；我们也测定了再灌注期间心律失常的期限和类型。在这样的试验条件下，大约50％的对照组动物在15分钟的再灌注期内死亡。这种死亡的原因是低血压危象和再灌注后诱导和立即产生的心室纤颤。所以，这种药理模型适于试验药物的效能，该药物可预防或对心动停止或心血管损伤引起的再灌注引起的突然死亡具有有益的作用。

试验结果：

在该模型中，山楂总提取物(即部分(a))和部分(b)、(c)和(d)被调查。在第一个试验系列中，以100mg/kg/天的剂量灌胃给予总提取物，共6天，在第7天，口服给予动物50mg/kg剂量的药物，在1小时后进行试验。

在表I和图1中概述了用总提取物治疗的动物和仅用溶剂治疗的对照组动物的试验结果。图I显示对照组(n＝8)和山楂提取物治疗组(n＝16)中存活动物的平均血压(mmHg±标准差)。这些试验结果表明给予山楂总提取物保护动物对抗由短时间缺血和再灌注诱导的心律失常，对抗低血压危象对生命的威胁和死亡的可能。

表I

     纤颤             心动过速           死亡率

                                          (％)组别    出现率    期限    出现率    期限

     (％)     (秒)     (％)     (秒)对照组   100      27.8+    100      47.1+      50

              5.37              6.74部分(a)  0        0        62       20.0＋4.56 0

另外的试验中，以不同的剂量并按不同的治疗方案来研究部分(a)。在表II中概述了试验结果。

表II剂量(mg/治疗方案          死亡率    保护对抗kg)                                 心律失常   从血压象100    日剂量，共6天+      +++        +++        +++

   50mg/kg试验前1小

   时100    前1天给药+50mg/     ++         +++        -

   kg

   试验前1小时100    前1天给药+          +++        +++        +

   100mg/kg

   试验前1小时100    试验前1小时         +          ++         -50     试验前1小时         +          +          -25     试验前1小时         -          -          -100    试验前4小时         +          ++          -100    试验前8小时         -          +           -

这些试验结果表明部分(a)对抗心缺血和再灌注诱导的损伤的最大效果仅在长期给予部分(a)后产生并预计在给予2×100mg/kg部分(a)(1天＋缺血前1小时)后仅有短时间持续而可靠的保护作用。

在以下不同剂量在试验开始前15分钟静脉给予部分(a)的试验中，可确定部分(a)没有确定的作用。

以类似的方法，用相对于总提取物各自产量的充足剂量，试验所述的部分。

表III比较总提取物的作用和各部分的作用部分(剂量)                   死亡率    保护对抗

                                   心律失常    低血压象部分(a)   (100mg/kg)           +++        +++         +部分(b) 超滤所得分子量大于     +++        +++         ++

     3000道尔顿的成分

     (20mg/kg)部分(c) 超滤的滤液中得到       ++         +           -

      的分子量小于

       3000道尔顿

      的部分(80mg/kg)部分(d) 不含类黄酮和原         +++        +++         ++

       花色素(50mg/kg)

表III中部分效果的比较清楚地表明效果最好的是含较高分子量物质的提取物部分，并且类黄酮或低聚原花青素(直到现在仍认为是山楂提取物的有效成分)的存在不是必需的。

因此，本发明用于预防和治疗因再灌注而引起的心血管损伤，预防因心动停止引起的突然死亡以及其它由再灌注引起的威胁生命的病理疾病的优选的药用组合物含有足够量的非类黄酮聚合化合物的山楂部分，该山楂部分含有大量的这些活性物质。

根据本发明，按下文所述方法来制备

a)用水、丙酮、C_1-4烷醇混合物或水和所述的可与水混合的有机溶剂混合物(优选45％(重量)乙醇)提取粉碎的植物材料(部分(a))；

b)通过用具有截止限(cut—of limit)为3000道尔顿的合适滤膜超滤而从部分(a)中分去低分子量化合物(部分(b))；

c)部分(a)在丁醇/水中液—液分布获得部分(c)；

d)利用分子筛孔效应，用多聚葡聚糖或其它适于分离的凝胶对部分(a)进行凝胶过滤，分去类黄酮和原花色素及其它低分子量化合物(部分(d))。

为了预防和治疗由再灌注引起的心血管损伤和为了预防因心动停止而引起的突然死亡，可在所有口服给药的药物剂型中使用部分(a)、(b)、(c)和(d)，优选部分(b)，口服剂型如包衣片、片剂、胶囊、溶液。为了制备这些药物制剂，可以常规方法使用载体如乳糖、淀粉、微晶纤维素、硬脂酸镁和滑石或水、醇、聚乙二醇、甘油酯来配制各部分。防腐剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、着色剂、矫味剂和芳香剂可被用作添加剂。

所给的日剂量为50到500mg的山楂总提取物(部分(a))；在富含活性物质部分(部分(b)，(c)和(d))的药物制剂中，可相应地减小剂量。

实施例说明制备各部分优选的方法。

实施例1：

将100kg干燥山楂叶和花(购得的混合物含约77％的单子山楂、约2％Laevigata山楂、约4％azarolus山楂、约16％nigra山楂和约1％五蕊山楂)经研磨粉碎并在60℃温度下用1000kg 45％(重量)的乙醇水溶液在Dispax Generator^中旋涡提取1小时。经连续离心法分离提取物。以相同方式，用1000kg 45％(重量)乙醇水溶液在60℃温度下再一次提取植物材料1小时。在约400mbar压力下和80℃温度下浓缩合并的提取溶液，60℃和5—10mbar下，在真空柜式干燥器中干燥浓缩的提取物。

总提取物(部分(a))的产量：

按干燥山楂带花叶计算为20％。该提取含有约18.75％的低聚原花青素。

实施例2

将200g山楂带花叶(约63％单子山楂、约3％lacvigata山楂、约9％azarolus山楂和约25％nigra/五蕊山楂的混合物)经研磨粉碎并在搅拌下和回流体系中用2升40％(重量)丙酮提取1小时。分出提取液后，在搅拌下和回流体系中用2升40％(重量)丙酮将残渣再一次提取30分钟。在60℃浴温和520—20mbar压力下，将合并的提取溶液浓缩至干。

产量：65.6g干燥提取物部分(a)，按干燥山楂带花叶计算为32.8％。

实施例3：

将20g按实施例2用40％丙酮水溶液由山楂带花叶制备的提取物加到搅拌的70℃温度下的400ml水中。加入10g活性炭后，将混合物搅拌1小时。经滤层滤去活性炭和未溶解的提取物成分。在60℃浴温和80—20mbar压力下，将滤液浓缩至干。

产量：8.8g物质部分(a)，按山楂提取物计算为44％。

实施例4：将85kg干燥的山楂带花叶(约76％单子山楂、约5％Lae-vigata山楂和约19％nigra山楂的混合物)经研磨粉碎并在循环提取器中与600kg甲醇在60℃下加热3小时，然后分出提取液。在60℃和200—260mbar压力下浓缩提取液并在60℃和20mbar压力下，在真空柜式干燥器中干燥。

产量：12.75kg干提取物部分(a)，按干燥山楂带花叶计算为15％。

实施例5：

将200g山楂带花叶(约63％单子山楂、约3％laevigata山楂、约9％azarolus山楂和约25％nigra/五蕊山楂的混合物)经研磨粉碎并注入2升煮沸软化水，在带叶片的分散装置提取15分钟。经纤维素滤层过滤，滤出提取液。用2升煮沸软化水再一次旋涡提取植物残杂15分钟。也用纤维素滤床过滤来从第二次提取中滤出提取液。合并提取液并在60℃浴温和50mbr压力下在旋转蒸发器中浓缩至干。

产量：52g部分(a)，按干燥的山楂叶和花计算为26％。

实施例6

将20g按实施例1从山楂带花叶中得到的提取物搅拌下加到50ml 45％(体积)乙醇中并装到含200g混悬在45％乙醇中的交联聚乙烯吡咯烷酮的柱中。将流速调至每8分钟40ml。通过馏分收集器的方法，分别以40ml来收集馏分。合并含物质的第一馏分并在60℃浴温和120—50mbar压力下在旋转蒸发器中浓缩至干。

产量：8.9g活性成分浓缩物(不含类黄酮化合物和原花青素)，按提取物计算为44.5％。

实施例7

将6.65g按实施例2用40％(重量)丙酮水溶液由山楂带花叶制备的提取物分散在20ml加热到50℃的软化水中并用超声处理。将由此获得的溶液装在由100g亲水交联葡聚糖(Sephadex G—25medium^)在水中的凝胶床上(高57cm，直径2.8cm)。合并开始的240ml含物质的柱洗脱液并在60℃浴温和50mbar压力下在旋转蒸发仪上浓缩至干。

产量：0.13g残渣(不含类黄酮化合物和原花青素)，按提取物计算为1.95％。

实施例8

将80g按实施例1制备的总提取物用1.2升50％(体积)乙醇在40℃温度下搅拌15分钟，离心提取物中未溶解的成分，经多孔玻璃D₃过滤上清液。将该溶液在2.5bar压力下经螺旋形再生纤维素超滤筒(Amicon^Siral—wound ultrafiltration Cartridge type S₁ Y₃)超滤，该超滤筒的截止限为3000道尔顿。将滞留的溶液浓缩到400ml并用700ml 50％(体积)乙醇洗涤四次。移出由此获得的200ml滞留液，并用1升70％(体积)乙醇漂洗超滤筒。在60℃和40mbr下，在旋转蒸发仪上将滞留液和漂洗液浓缩至约200ml，由此蒸去乙醇。将浓缩液深度冷冻在-40℃下的乙醇/干冰浴中并在0.22mbar下冷冻干燥。

产量：15.35g部分(b)，按总提取物计算为19.19％

实施例9

a)将100g按实施例1制备的总提取物溶于加热到50℃的1升软化水中。冷却到室温后，每次以400ml水饱和的正丁醇，将水溶液提取5次。贮存水相并进行步骤b)。合并丁醇相。此后用500ml软化水再一次洗涤所获得的正丁醇溶液。贮存水溶液并进行步骤b)。

在60℃/30mbar下，真空浓缩丁醇溶液，加水蒸去正丁醇。在60℃/17mbar下真空干燥残渣。

最终正丁醇部分的重量：29.5g。

b)将步骤a)中获得的水相以及再一次洗涤丁醇溶液获得的水溶液在60℃/55mbar下真空浓缩并经17mbar下蒸发而减少。最后在60℃/20mbar下用真空柜式干燥器干燥，而由水相产生71.4g部分(c)残渣，按总提取物计算为71.4％。

按实施例10描述的溶剂系统，采用薄层层析法，可检测正丁醇部分中的叶绿素、类黄酮化合物和部分低聚原花青素。

水相部分(部分(c))含有原花青素和作为未知活性化合物的成分。

实施例10

将50g由山楂带花叶获得的总提取物在50℃温度下用200ml软化水搅拌。含未溶解成分的混悬液装在1kg混悬在水中的在直径7.4cm且填充高度100cm玻璃柱中的Sephadex—LH20^R(羟丙基化的交联多聚葡聚糖)凝胶床上。用5升软化水洗脱柱。在硅胶板上以乙酸乙酯/甲酸/乙酸/水(体积份100＋11＋11＋27)溶剂，用薄层层析法检测洗脱液不含山楂芹菜配基型典型的黄酮甙(Vitexin、Vitexin—2″—O—rhamnoside等)和槲皮黄素黄酮醇甙(Hyperoside—槲皮黄素—3—O—半乳糖甙，芦丁＝槲皮黄素—3—O—芸香糖甙等)。

合并1升前洗脱液后到5升洗脱液的馏分并在60℃/20mbar下在旋转蒸发仪中浓缩至干。

产量：25.36g部分(d)，按总提取物计算为50.72％。

实施例11：

含50mg山楂总提取物(部分(a))的片剂：

50g部分(a)

50g胶体硅酸(Aerosil ^R)

100g乳糖

25g微晶纤维素

24g玉米淀粉

1g硬脂酸镁

将前5种组分混合、制粒并在加入硬脂酸镁后在压片机中压制成250mg的片剂。

实施例12：

含50mg山楂提取物(部分(b))的胶囊

30g部分(b)

120g乳糖

50g胶体硅酸

将各组分混合均匀并按常规方法制成填充重量为200mg的胶囊。

实施例13：

包衣片：

部分(d)        40.00mg

微晶纤维素    100.00mg

乳糖           60.00mg

胶体硅酸       50.00mg

滑石(片心中)    4.50mg

硬脂酸镁        0.50mg

羟丙基纤维素   12.00mg

滑石(包衣层中)  0.50mg

包衣片重    约267.50mg

实施例14：

溶液剂

40g部分(c)

10g香精

5糖二酸钠

460g乙醇

475g纯水