MK7634物质,其制备方法及含MK7634的驱虫剂

            实施本发明的最佳方式

下面将对该发明进行详细阐述。

该发明的物质MK7634可获得的方法是：培养具有MK7634生产能力、属于半知菌的微生物，从培养物中收集MK7634这种物质。作为这种微生物虽不限于具有上述特征的某一特殊种类，但优选弯孢属能生产该物质的真菌。具体讲，该发明人优选从枯死枯物体分离物得到的苍白弯孢D2479(下面有时略称为“该菌株”或“D2479”)作为生产菌。

该菌株的菌学性状如下，该菌株于平成6年11月17日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH；邮政编码305茨城县筑波市东1-1-3)保藏号为：微工研菌第14645号(FERM P-14645)平成7年10月30日依据布达佩斯条约转为国际保藏，保藏号为FERMBP-5276。

1.该菌株(D2479)的菌学性状：

(1)形态学性状：

作为菌落繁殖，菌株在土豆·右旋糖琼脂培养基〔PDA：培养基：1升水中含有土豆提取粉末4.0g、葡萄糖20.0g及琼脂15.0g(PH6.0±0.1)：日水制药有限公司产品要览I，P92〕上、27℃，培养2周，繁殖旺盛时的菌落呈绵毛状，开始为浅棕灰色，以后呈黑褐色。

基底菌丝分枝，有多个横隔，宽3.0-16cm呈淡褐色-浓褐色。

无厚膜孢子生成。

有大量的气生菌丝生成。

分生孢子柄为单线，在营养菌丝上顶生或侧生，通常没有分枝，但有时也有分枝，直立或弯曲，上部经常呈之字形，淡褐色-深褐色，有数个横隔，表70-450μm、宽3.8-5.0μm，茎部细、末端膨大。

有马球型分生孢子形成，脱离(Scar)不清晰。

分生孢子呈纺锤形或纺锤棒形、有3个横隔、下面膨大形成第3个细胞、第3个细胞弯成月牙状或不弯曲、分生孢子的各细胞均呈均一的浅褐色、平滑、17.8-31.2×5.3-12.0μm基底部没有侧生的分枝。

(2)不同培养基上培养时的性状：

①麦芽琼脂培养基〔MA(Mact extract Agar)：1升水中含麦芽提取物20.0g、蛋白胨1.0g、葡萄糖20.0g、琼脂20.0g(没有调整pH值)：菌类图槛(下)P1281、宇田川俊一、椿启介等著(讲谈社)〕上、27℃培养2周，菌落生成旺盛，呈绵毛状-天鹅绒状、开始呈褐灰色、以后呈灰黑色。

基底菌丝分枝、有多个横隔，宽能达14.7μm呈浅褐色或红褐色。

无厚膜孢子生成。

生成大量的气生菌丝。

分生孢子大量形成、分生孢子柄和分生孢子的变形性状与PDA培养基上的相似。

②三浦培养基〔LCA：1升水中含葡萄糖1.0g、KH₂PO₄ 1.0g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、KCl 0.2g、NaNO₃ 2.0g、酵母浸膏0.2g、琼脂15.0g(pH6.5-7.0)：上文菌类图鉴(下)P1277〕上、27℃培养2周，菌落生长到中等程度，菌落延伸浅薄。呈绵毛状、开始呈明亮的褐灰色、以后呈灰黄褐色。

基底菌丝分枝，有多个横隔，宽2.2-10μm呈浅色-浅褐色。

不形成厚膜孢子。

形成大量的气生菌丝。

菌落的周边形成大量的分生孢子，分生孢子柄及分生孢子的变形性状与PDA培养基上的相似。

(3)生理学性状：

生长温度(PDA培养基，培养5天)：15-35℃。

最适温度：25-30℃。

生长的pH值(三浦培养基，培养7天)：3-9

最适pH值：5-7

(4)分类学考察：

该菌株(D2499)因具有下列特征，故属于弯孢属(Curvularia)，该属能形成半知菌亚门-半知丝状菌纲的马球型分生孢子。1)有马球型分生孢子形成2)分生孢子柄直立或弯曲，经常呈之字形，分生孢子在顶部形成3)分生孢子有3个横隔，常常有膨大的中间细胞，一些分生孢子呈牙形弯曲。由于具有分生孢子的性状(有真横隔，有3-4个横隔，有膨大的中间细胞，使该菌属与其相似属德斯霉属(Drechslera)相区别。

已知弯孢属有40多种。依照Dematiaceons Hyphomyletes，M.B.Ellis(1971年)讲的，要根据宿主植物的不同和分生孢子的形状(分生孢子基底部有无侧生分枝、横隔数、分生孢子的大小、形状、有无弯曲等)来识别这40个种类。依照Dematiaceons Hyphomyletes，M.B.Ellis，P452-459(1971年)记载的种类检索表对该菌株(D2479)进行种水平的检索，发现与苍白弯孢的特征非常相符，因此，把该菌株D2479确定为苍白弯孢。虽然还有相似种新月弯孢和塞拉利昂弯孢(C.Leonensis)，但通过下面表1中列出的特征，可以把苍白弯孢与这些种区别开来。

                       表1分生孢子特征    D2479    苍白弯孢    塞拉利昂弯孢    新月弯孢横隔数          3横隔        3            3              3膨大细胞        第3个        3            3              3弯曲/直立     弯曲/直立  弯曲/直立      弯曲           弯曲颜色          所有细胞   所有细胞     所有细胞       中间细胞

        均呈浅褐色   均呈浅褐色   均呈浅褐色      深褐色

                                                 两极细胞

                                                   无色-

                                                  浅褐色大小        17.8-31.2×      17-32×              20-32×                     20-32×

        5.3-12.0μm  7-12μm      9-13μm          9-15μm

该菌株的性状容易变得象其它真菌。例如，该菌株的或由它而来的突变株(自然突变或诱生突变)、表型接合体和基因重组体，只要具有生产MK7634的能力就可应用于本发明。2.MK7634物质生产菌的培养法：

在含有普通微生物生长利用的营养物质的培养基上培养这种半知丝状菌、有MK7634物质生产能力的菌株。可应用真菌培养中常规应用的、众所周知的物质作为营养源。例如：米、葡萄糖、淀粉浆、糊精、淀粉、糖浆、动植物油等可用作碳源。大豆粉、小麦胚等、玉米浸泡液、棉子粉、肉渣、蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、硝酸盐、尿素等可用作氮源。适应其它的需要，添加能生成离子的无机盐类也有效，如Na、K、Ca、Mg、Co、Cl、磷酸、盐酸离子。另外，为了促进真菌的生长和MK7634的生产也可添加合适的有机物或无机物。

作为培养法，通气培养尤其优选固体培养物法和深层培养法。合适的培养温度为15-35℃，但是更为优选的培养温度在20-30℃左右。尽管生产MK7634的培养基和培养条件不同，但是固体培养、振荡培养、罐培养均可在2-14天达到最大积聚。当培养中的MK7634积聚到最高时停止培养，从培养液中分离，提纯目的物。3.MK7634的提纯方法

本发明的物质MK7634可从MK7634生产菌的培养物中、利用其性状、用常规的分离手段分离、提纯而获得，例如可应用溶剂萃取法、离子交换树脂法、吸附或分配层析法、凝胶过滤法、透析法、沉淀法等单独或适当组合进行分离、提纯。例如用丙酮-水、甲醇-水等从培养的菌体中萃取MK7634物质。蒸发掉萃取物才含有的丙酮或甲醇以后，用乙酸乙酯、正丁醇等对水层进行连续洗涤。把洗净后水层的pH值调到中性，用离子树脂进行吸附(三菱化学物公司、商品名(Diaion)树脂PK-208(H⁺)：注册商标为Diaion)，有效成分可用氨水等洗脱出来。MK7634的提纯可这样进行：把中和后冷却物干燥得到的样品通过分子筛树脂(Pharmacia公司，商品名交联葡聚糖(Sephadex)G-10)进行凝胶过滤层析，接着用分子筛树脂(Tosoh公司，商品名Toyopearl·HW-40S)进行凝胶过滤层析。

MK7634物质可作为药物的有效成分特别是驱虫剂的有效成分物加以利用。MK7634物质作为驱虫剂应用适宜的动物包括人和猪、牛、马、兔、羊、山羊、鸡、鸭、火鸡、家鼠、白鼠、豚鼠、猴、狗、猫、小鸟等家畜、家禽、实验动物和宠物。另外，已知这些动物的寄生虫包括：牛、羊的血矛线虫、骨线虫、金线虫、Goper线虫、肠结节线虫、粪线虫、双口吸虫、Benedeen条虫、肺虫、肝蛭等，猪的蛔虫、鞭虫、结节线虫等，狗的蛔虫、钩虫、鞭虫、丝条虫等，猫的蛔虫、裂头蛔虫等，鸡的蛔虫、金线虫、育肠虫等。另外，还包括人的蛔虫、蛲虫、钩虫(12指肠钩虫、斯里兰卡钩虫、美国钩虫)、东方毛圆线虫、粪线虫、鞭虫等。

MK7634可用于各种疾病的治疗和预防，尤其是寄生虫感染性疾病的治疗及预防。治疗时的应用方法可为口服或胃肠外。口服应用时，可用胃管等强制给予流体物制剂，可与常用的饲料或饮用水混合后给予或用常规的适合口服应用的剂型如：片剂、胶囊剂、小丸剂、大丸剂、粉末或软胶囊等。非口服应用的时候，作为含花生油、大豆油等的非水溶性制剂或含甘油、聚乙二烯等的水溶性制剂可经真皮内、皮下、肌肉、静脉内、腹内注射应用。为了预防寄生虫该物质常与饲料混合后用于口服、或由注射时应用。用于预防时，应用时没有特别的限制如：通常情况下肉鸡应用2个月、猪应用5个月就足够了。

MK7634的应用剂量根据动物及寄生虫的种类、或应用途径的不同而变化。例：为了驱除鸡蛔虫，用胃管经口给予液体制剂应用的剂量为3mg/kg以上，优选6mg/kg以上。而为了预防，应用的量在饲料中的浓度持续达1ppm以上，优选5-10ppm。

另外，把MK7634物质溶体或悬浮在液体中时，可通过动物皮下或肌肉注射而胃肠外应用。胃肠外应用的时候，可应用含花生油、大豆油等植物油类的非水溶性制剂或含甘油、聚乙二醇等水溶性赋形剂的水溶性制剂。这些制剂，一般含0.1-10％重量百分比的MK7634。胃肠外应用的剂量范围为每天0.5mg/kg以上，优选1-20mg/kg。

鸡口服该物质MK7634时，显示出正常的体重增加，没有发现其它异常，表明该物质毒性极低。

以下将描述该发明的实施例，通过本发明物质MK7634的性状已经很清晰，因此在此基础上可建立多种制备该物质的方法，因此，不要把本发明局限于下面的实施例，该发明不仅包括实施例的修饰手段而且包括在本发明所阐明的MK7634物质性状的基础上、用众所周知的手段对MK7634进行生产、浓缩、提取和纯化的方法。

                        实施例1

把含有淀粉浆2.0％、大豆粉1.0％、大豆油0.15％、Sungrain(Suntory公司)0.25％、棉子粉0.5％、FeSO₄·7H₂O 0.0005％、NiCl₂·6H₂O 0.0005％、CoCl₂·6H₂O 0.0005％及CaCO₃ 0.1％的培养基每40ml装到200ml的三角烧瓶120份，用高压灭菌器在121℃、20分进行灭菌。把1铂环的该菌株接种到培养基上，在27℃、210转/分的条件下振荡培养2天。

另外，把60g米和自来水20ml装到500ml三角烧瓶中60份，在121℃、20分进行高压灭菌。把前面讲的种子培养液每4ml加到这种主培养基上，27℃静置培养14天。

在含有所得菌体的固体培养基中加90升50％的丙酮-水，搅拌1小时以后，把菌体过滤获得萃取液。把滤出的菌体在等量的水中搅拌1小时后，过滤得到水提物。合并上面的丙酮水、水提取物，进行减压浓缩，蒸发掉丙酮后得到50.1升提取物。随后，在提取物中加入50L的乙酸乙酯，搅拌洗涤1小时。把水层由50L减压浓缩至18L后，加等量的正丁醇，搅拌洗涤1小时。把18L水相部分减压浓缩至13.8L。调整浓缩液的pH值到7.0，在2L离子交换树脂(三菱化学公司，Diaion PK-208(H⁺))装的柱上进行吸附。活性成分可在0.5N氨水洗脱的级分中得到。调整pH为7.0后，把这种溶液450ml再次在1L纯净水和0.5N1L氨水所配成的浓度梯度液进行层析，每15ml级分收集1次。从级分46-129中获得8.5g活性成分。把这活性成分溶解到250ml的纯净水中，调pH7.0后，在330ml离子交换树脂(三菱化学公司、DiaionPK-208(H⁺))填充柱上进行吸附，用700ml纯净水和0.5N、700ml氨水配制的浓度梯度液进行层析，每5ml作一级分。收集级分169-240，得5.5g活性成分。

接着，把上述活性成分中的2g用纯净水溶解到50ml，调pH为7.9，在用830ml分子筛用树脂(pharmacia公司、葡聚糖G-10)填充的柱上、用纯净水进行柱层析，每3ml作一级分，收集级分49-53，得到124mg活性成分。同样，把前5.5g活性成分中的1.0g溶解到20ml的纯净水中调pH为7.9后，上470ml分子筛用树脂(医药公司交联葡聚糖G-10)填充的柱，用纯净水进行柱层析，每2ml作一级分，收集级分19-30，得145mg活性成分。合并这145mg和前面的124mg活性成分，溶解到10ml纯净水中，调pH为7.3后，上分子筛用树脂480ml(医药公司，交联葡聚糖G-10)填充的柱用纯净水进行柱层析，每2ml作一级分，收集级分49-55，得到活性成分84mg。

把这84mg活性成分溶解到5ml的纯净水中调pH到7.25后，用分子筛用树脂(Tosoh公司、ToyoPEARL HW-40S)340ml填充的柱和纯净水进行柱层析，每2ml为一级分，收集级分38-52，冷冻干燥后得到7.2mg无色粉末状MK7634物质。

同样的把用前面的离子交换树脂(三菱化学公司、Diaion PK-208(H⁺))层析后得到的5.5g活性成分中的2.5g用纯净水溶解到60ml，用相同的830ml分子筛用树脂(医药公司、交联葡聚糖G-10)填充柱和pH为7.4的纯净水进行柱层析，每3ml为一级分，收集级分24-36，得到203mg活性成分。把这203mg溶解到10ml的纯净水中，调pH到7.3后，用600ml分子筛用树脂(医药公司、交联葡聚糖G-10)填充柱和纯净水进行柱层析，每2ml作一级分，收集级分37-47，得到74.7mg活性成分。把这74.7mg活性成分溶解到6ml纯净水中，调pH到7.3后，用340ml分子筛用树脂(Tosoh公司、ToyoPEARL HW-40S)填充柱和纯净水进行柱层析，每2ml为一级分，收集级分56-67，冷冻干燥后得到4.0mg的无色粉末状MK7634物质。

MK7634的理化性质如前所述。分子量和化学式通过对该物质酰化后形成的单丹酰化合物进行高分质谱测定而确定的。MK7634的单丹酰化合物在重水和氘化甲醇混合液中(重量混合比＝4∶1)进行¹H-NMR(图3)和¹³C-NMR(图4)时的化学移位和结合常数值如下：¹H-NMRδ(ppm)：8.63d(1H，J＝8Hz)，8.63d(1H，J＝8Hz)，

           8.33d(1H，J＝8Hz)，7.75m(2H)，

           7.46d(1H，J＝8Hz)，4.26m(3H)，

           3.80t(1H，J＝3Hz)，2.90s(6H)，

           2.28m(2H)，1.97m(1H)，1.56m(1H)¹³C-NMRδ(ppm)：175.7，175.1，151.7，133.0，132.7，131.6，

            130.3，130.2，129.9，125.1，120.1，117.3，

            70.5，64.5，59.6，54.5，45.9，33.0，21.5

                        实施例2

把人工感染鸡蛔虫的鸡作为1组，这种鸡蛔虫通过虫卵检测，可确定有鸡蛔虫感染，每组4个浓度，每浓度1只鸡，包括没用药组的在内共有5只鸡用于实验。应用MK7634的时候，要把根据每只鸡体重计算出的准确用量装到明胶囊中，通过胃饲管、经口1次给予。用药后，每天计算每只鸡排出的虫数，7天后对每只鸡进行解剖，数肠内残留的虫体数，计算排虫率。排虫率＝7天内排出的虫体数/(7天内排出的虫体数+残留虫体数)×100

另外，测定每只鸡用药前的体重和7天后的体重，计算体重增长率。

体重增长率＝(用药7天后体重-用药时体重)/用药时体重×100。

上述的试验结果如表2所示，MK7634在6.06mg/kg应用时排虫率为97.4％。并且，该物质即使在以31.9mg/kg的剂量应用，其体重增长率几乎与没用药的对照组相等，因此，可确定MK7634物质是安全性较高的物质。

    表2 MK7634物质的鸡蛔虫排出试验鸡序号    药量    排虫率    体重增长率

    (mg/kg)    (％)       (96％)1         没用药   0          18.02         2.89     61.3        49.33         6.06     97.4        16.44         15.3     100         23.45         31.9     100         25.0

                    工业应用性

本发明的MK7634物质预计可用作人和/或家畜、家禽等寄生虫的驱虫剂。