传染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保护性抗原(VP2)基因生产VP2蛋白法及其基因工程

本发明涉及一种VP2基因及真核表达系统表达VP2蛋白的方法以及VP2基因工程疫苗。

传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染雏鸡诱发免疫抑制，死亡率可高达100％，造成严重的经济损失。防治IBDV的经典疫苗是弱毒苗和灭活苗，弱毒苗的最大缺点是其潜在的传染性和致病性，而灭活苗的免疫效果不太稳定。飞速发展的生物技术促进了IBDV基因工程疫苗的研制。人们利用多种真核表达系统表达IBDV主要宿主保护性抗原(VP2)以制备IBDV基因工程疫苗：Macreadie等(Macreadie I G,Vaughan P R,Chapman A J,Makern N M,Jagadish M N,Heine M N,Ward H G,Fahey K J.& Azad A A.Passive Protectionagainst infectious bursal disease virus by viral VP2 expressed in yeast.Vaccine,1990,8:549-552)用酵母细胞表达的VP2粗提液制成注射疫苗，Bayliss等(Bayliss C D,Perters R W,Cook J KA,Reece RL,HowesK,Binns M N.& Boursnell M E G.A recombinant fowlpox virus thatexpresses the VP2 antigen of infectious bursal disease virus inducesprotection against mortality caused by the virus.Archives of Virology,1991,120:193-205)用重组禽痘病毒表达的VP2制成注射疫苗，Vakharia等(Vakharia V N,Snyder D B,He J,Edwards G H,Savage P K.& Mengel-Whereat S A.Infectious bursal disease virus structuralproteion in chickens.Journal of General Virology,1993,74∶1210-1206)、Dybbing等(Dybbing J K.& Jackwood D J.Antigenic andimmunogenic properties of baculovirus expressed infectious bursaldisease viral proteins.Avian Diseases,1998,42:80-91)利用重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcNPV在Sf细胞中表达的VP2制成注射疫苗，Darteil等(Darteil R,Bublot M,Laplace E,Bouguet J-F,AudonnetJ-C.& Riviere M.Herpesvirus of Turkey Recombinant Virusesexpressing infectious bursal disease virus(IBDV)VP2 immunogen induceprotection against an IBDV virulent challenge in chickens.Virology,1995,211∶481-490)用重组火鸡疱疹病毒表达的VP2制成注射疫苗，Sheppard等(Sheppard M,Werner W.& Tsatas D.Fowl adenovirusrecombinant expressing VP2 of infectious bursal disease virus induceprotective immunity against bursal disease.Archives of Virology,1998,143:915-930)用重组禽腺病毒表达的VP2制成注射疫苗，Heine等(Heine H G.& Boyle D B.Infectious bursal disease virus structuralprotein VP2 expressed by a fowlpox virus recombinant Confer protectionagainst disease in chickens.Archives of Virology,1993,131:277-292)用禽痘病毒表达的VP2制成注射疫苗。这些在培养细胞中表达的VP2均能提供不同程度的免疫保护，但是由于大量培养细胞成本昂贵，条件设备要求严格，技术难度较大，因此限制了表达蛋白在免疫防治IBDV的实际应用。

本发明的目的在于提供一种传染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保护性抗原(VP2)基因。

本发明的另一个目的在于提供一种大规模、低成本生产传染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保护性抗原(VP2)蛋白的方法。

本发明的再一个目的是在此基础上提供价格低廉、使用简便且有效的IBDV基因工程疫苗。

本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保护性抗原(VP2)基因，其核苷酸序列如说明书附图中的图1。

本发明提供的生产传染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保护性抗原(VP2)蛋白的方法为：它以家蚕或蛹表达上述基因蛋白，并包括如下步骤：

(1)．将VP2基因克隆到家蚕核型多角体病毒表达转移载体上获得重组表达转移载体，

(2)．将步骤(1)所说的重组表达转移载体DNA与经修饰的线性化家蚕核型多角体病毒DNA共转染家蚕细胞，体内重组产生带有该VP2基因的重组家蚕核型多角体病毒，

(3)．多轮空斑纯化步骤(2)所说的重组病毒，

(4)．用步骤(3)所说的重组病毒感染家蚕幼虫(或蛹)，体内表达VP2蛋白。

本发明提供的IBDV基因工程疫苗可以是一种注射疫苗：它包括所述的感染重组病毒的家蚕幼虫的血淋巴和免疫佐剂，家蚕血淋巴：免疫佐剂=1∶1～3(V∶V)。

所述的免疫佐剂可以是免疫刺激复合物(ISCOM)、矿物油、弗氏不完全佐剂等。

本发明提供的IBDV基因工程疫苗也可以是一种口服疫苗：所述的感染重组病毒的家蚕幼虫的血淋巴干粉的无菌水溶液或生理盐水溶液，血淋巴干粉的浓度为20～150mg/ml。

本发明与现有IBDV VP2表达方法相比具有以下优点：(1)家蚕驯养在中国已有几千年的历史，随着家蚕人工饲养技术的建立，现已能在无菌条件下年四季不间断地进行大规模饲养；(2)家蚕幼虫(和蛹)的表达成本与目前的培养细胞表达系统相比低100～1000倍，每条家蚕幼虫对VP2的表达量相当于100mlTC-100完全培养基(10％胎牛血清)培养的BmN细胞的VP2表达量，每条蚕的成本低于0.1元人民币，而细胞培养成本则不低于50元人民币；(3)表达生产设备简单，易于操作，家蚕幼虫经家蚕核型多角体病毒感染、于室温饲养4～8天即可收集蚕血淋巴，低速离心去杂质即可得到VP2粗蛋白；(4)家蚕核型多角体病毒对人、禽、畜无侵染性，是较为安全的表达系统。

本发明提供的基因工程疫苗，其VP2蛋白无需纯化，因而生产方法简单，成本低廉。口服基因工程疫苗，可与饲料混合使用，非常方便，避免了注射免疫所容易产生的疾病传染及鸡群不安。

下面结合附图、附表及实施例对本发明作详细描述。

图1本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保护性抗原(VP2)基因序列。

图2本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保护性抗原(VP2)基因在家蚕细胞中表达的Western印迹。

图3本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保护性抗原(VP2)基因在春蚕和秋蚕幼虫中的表达。

图4本发明提供的IBDV注射及口服基因工程疫苗免疫雏鸡群后，被免疫鸡群血清中IBDV中和抗体效价变化曲线。

图5为服用正常蚕血鸡群攻毒其法氏囊组织病理切片。

图6本发明提供的IBDV注射基因工程疫苗免疫雏鸡群后，被免疫鸡群法氏囊组织病理切片。

图7本发明提供的IBDV口服基因工程疫苗免疫雏鸡群后，被免疫鸡群法氏囊组织病理切片。

图8为本发明提供的IBDV注射及口服基因工程疫苗免疫保护的统计分析表。

实施例1

本实施例描述了本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保护性抗原(VP2)基因的获得方法，克隆方法为巢式RT-PCR方法，包括以下步骤：

(一)传染性法氏囊病病毒(IBDV)杭州分离株HZ96的获得：

1．将从杭州收集的临床诊断为传染性法氏囊病(IBD)的法氏囊病料用灭菌生理盐水按1∶3制成匀浆，冻融三次；15000rpm，于4℃离心20min；取上清加入终浓度为5％的氯仿作用30min；15000rpm，于40C离心20min；取上清，加青霉素和链霉素(1000IU/ml)，4℃过夜，置4℃冰箱保存备用；

2．9～11日龄非免疫胚在无菌条件下，用剪刀剪成小块，去除眼、内脏和爪。用Hanks液清洗二次，移至消化瓶继续剪成糊状，加入4倍量0.25％胰酶消化液，37℃水浴消化30min，用Hanks洗二次，洗去胰酶消化液，加入细胞培养液(10％FBS+Hanks液)，摇匀，纱布过滤，用细胞培养液将细胞浓度稀释至3×10⁵个细胞/ml，接入细胞瓶中，37℃,5％CO2培养，待长成单层后，按0.2ml/瓶接种步骤1所述的病毒液，盲传，48～72小时收集细胞培养液，冻融三次作为连续传代接种物；

3．对步骤1所述的病毒进行电境观察、理化特性测定及动物回归实验，结果证明该病毒为传染性法氏囊病病毒(IBDV)；

(二)从HZ96株中分离获得VP2基因：

1．9～11日龄非免疫胚在无菌条件下，用剪刀剪成小块，去除眼、内脏和爪。用Hanks液清洗二次，移至消化瓶继续剪成糊状，加入4倍量0.25％胰酶消化液，37℃水浴消化30min，用Hanks洗二次，洗去胰酶消化液，加入细胞培养液(10％FBS+Hanks液)，摇匀，纱布过滤，用细胞培养液将细胞浓度稀释至3×10⁵个细胞/ml，接入细胞瓶中，37℃,5％CO2培养。吸弃长成单层的CFFs培养液，用Hanks液洗二次，按MOI(multiplicity of infection)1pfu/细胞接种HZ96,37℃吸附1hr，补加细胞培养液，37℃,5％CO2继续培养，至56小时后，CEFs细胞变圆，脱落，把细胞培养瓶置于-20℃，反复冻融3次，收集细胞悬液，-20℃保存备用，将反复冻融的HZ96细胞培养液于4℃，3000rpm离心10min，上清10000rpm离心10min，上清14000rpm离心10min，收集上清，弃沉淀。超速离心36,000rpm离心2.5hr，浓缩病毒，用TEN缓冲液[0.1mol/L NaCl,10mmol/LTrisCl(pH 8.0),1mmol/L EDTA(pH 8.0)]悬浮病毒颗粒，取500ulTEN悬浮的病毒悬液(～10¹⁰个病毒粒子)，加入10％SDS 25 ul至终浓度0.5％，上下颠倒eppendorf管，再加入20 mg/ml蛋白酶K 1.25ul至终浓度0.05ug/ul，于42℃保温2hr；加入等体积饱和酚充分混合，室温静置3min,12000rpm离心10min(4℃)；取水相，加等体积饱和酚/氯仿充分混匀，室温静置3min,12,000rpm离心10min，重复抽提一次；取上清，加等体积氯仿/异戊醇(V∶V/24∶1)充分混匀，室温静置3min,12000rpm离心10min，取上清，加入1/10体积DEPC处理过的3M醋酸钠，再加入2.5倍体积新开封的无水乙醇，用DEPC-水配制的70％乙醇淋洗沉淀，12000rpm离心10min，弃上清，室温干燥15min，用DEPC-水30ul溶解病毒RNA。

2．取一经DEPC处理过的新的0.5ml eppendorf管加入含1ug步骤1所说的HZ96基因组RNA溶液，补加水至12ul,100℃水浴变性5min，冰淬灭5min，6个核苷酸(是否有确定的名称，是否可以写出)随机引物反转录(Reverse transcription,RT)合成第一链cDNA，以引物5’AA ATCGATG ACA AAC CTG CAA GAT CAAACC C3’和5’AA AAGCTT A GGC AGC TCT TGC TTT TCC 3’进行第一次聚合酶链式反应(Polymerase Chain reaction,PCR)，反应程序如下：94℃预变性2min,94℃ 1min,57℃ 1.5min,72℃ 1.5min，共进行35个循环，72℃保温延伸10min。

3．以步骤2所说的PCR产物为模板，以引物5’AAA AGATCT ATGCCA ACA ACC GGA CCG GCG TCC 3’(AGATCT为核酸内切酶BglⅡ的酶切位点)和5’AA AAGCTT A CGC GGC TCG AGC AGT TCCTGA AGC 3’(AAGCTT为核酸内切酶HindⅢ的酶切位点)进行巢式PCR，反应程序如下：94℃预变性2min,94℃ 1min,60℃ 1.5min,72℃ 1.5min，共进行30个循环，72℃保温延伸10min。

4核酸内切酶BglⅡ和HindⅢ双酶切步骤(3)所说的PCR产物，并克隆到载体pBlue script SK(已商品化)的BamHⅠ和HindⅢ位点中，获得重组载体pBlVP2，并对此外源片段进行序列分析。

含pBIVP2的宿主细胞在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为：CGMCC NO.0447

参照图1本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保护性抗原(VP2)基因序列。

实施例2

本实施例描述了生产传染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保护性抗原(VP2)蛋白的方法，它以家蚕或蛹表达上述基因蛋白，并包括如下步骤：

(一)．将以上所说的VP2基因克隆到家蚕核型多角体病毒表达转移载体上获得重组表达转移载体。核酸内切酶XbaⅠ和KpnⅠ双酶切实施例1所说的重组载体pBlVP2，并将切出的VP2基因克隆到家蚕核型多角体病毒表达转移载体pBacPAK8(已商品化)的XbaⅠ和KpnⅠ位点，获得重组表达转移载体pBacVP2。

(二)．将步骤(一)所说的重组表达转移载体DNA与经修饰的线性化家蚕核型多角体病毒Bm-BacPAK6 DNA(胡建新，家蚕核型多角体病毒同源重复区复制功能及重组病毒表达系统载体构建和改进，博士论文，1994，中国科学院上海生化所)共转染家蚕细胞，体内重组产生带有该VP2基因的重组家蚕核型多角体病毒：在25cm2细胞培养瓶中接入2×10⁶个家蚕卵巢BmN细胞，28℃保温4-6hr使细胞贴壁，取-0.5ml eppendorf管加入0.2ug修饰的家蚕核型多角体病毒Bm-BacPAK6 DNA和1.0ug转移载体质粒DNA，加灭菌H₂O至终体积50ul，轻轻混匀，另取-0.5ml eppendorf管加入6ul脂质体Dorsper(1ug/ul)和44ul HBS液，轻轻混匀，然后将上述50ul DNA溶液加入至脂质体管中，轻轻混匀；室温放置15min，将培养瓶中贴壁BmN细胞的培养上清吸去，用无血清1×TC-100每次4ml洗细胞3次，除去原培养基中的FBS成份，在培养细胞中加2ml无血清1×TC-100培养基，然后将100ul Dorsper/DNA混合液滴加到细胞培养瓶中，轻轻摇动培养瓶，使脂质体分布均匀。细胞内重组产生带有IBDVVP2基因的重组家蚕核型多角体病毒。28℃培养6天后收集培养细胞上清用于空斑纯化重组病毒。

(三)．多轮空斑纯化步骤(二)所说的重组病毒：分别接种1×10⁶BmN细胞于若干个35mm培养皿中，贴壁生长4-6hr。用新鲜1×TC-100完全培养基10倍梯度稀释步骤(二)所说的细胞上清病毒液，然后用不同稀释度10⁰、10^-1、10^-2、10^-3的病毒感染液1ml置换上述各平皿中的培养基，感染1hr后吸弃感染液，将预先溶解并保温于37℃的2％低熔点琼脂糖凝胶与保温于37℃的2×TC100完全培养基按体积比1∶1混合均匀(培养基终浓度为1×，琼脂糖凝胶终浓度为1％)。在每个培养皿中各铺2ml，待凝胶凝固后，将平皿倒置，28℃培养。4天后，显微镜检可以发现病毒感染形成的空斑。用tip头将空斑位置的凝胶挑出，加入含200ul TC100完全培养基的0.5ml eppendorf管中浸泡12hr左右。取50ul该病毒液感染铺于96孔板的BmN细胞。感染三天后观察有无病毒感染症状以判断原先挑斑是否正确，若正确，四天后可根据有无LacZ基因的表达等表型来初步判定所挑空斑中是否含有重组病毒。取100ul病毒侵出液，接种铺于25cm²培养瓶中的BmN细胞，进行下一轮空斑筛选。经过3-4轮空斑筛选纯化，得到不杂有亲代病毒的重组病毒。

(四)．用步骤(三)所说的纯化重组家蚕核型多角体病毒感染家蚕幼虫(或蛹)，大规模生产传染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保护性抗原(VP2)蛋白。

参照图2。用重组家蚕核型多角体病毒以5pfu的感染复数感染单层家蚕细胞，96小时后收集细胞，作SDS-PAGE电泳，Western印迹检测到了两种不同分子量的蛋白质：52kD和38kD，克隆的IBDV HZ96 VP2基因编码52kD蛋白质，而成熟VP2蛋白的分子量为37～40kD，说明此重组家蚕核型多角体病毒能在家蚕细胞中表达VP2基因。图中1表示Proteins Marker；2及4表示Lysate of BmNcells infected with rBac VP2-1；3及5表示Lysate ofBmN cells infectedwithBacPAK。

参照图3。用30ul接种针于家蚕幼虫皮下节间膜接种步骤(三)所说的纯化重组家蚕核型多角体病毒，于接种后3,4,5,6,7,8天收集蚕血淋巴，5000rpm低速离心10min取上清，0.05％Triton-X100裂解细胞，酶联免疫吸附试验(ELISA)测定VP2在家蚕幼虫中的表达，结果表明实验所用秋蚕在接种后第7天表达VP2达到最大值，而春蚕则在第4天达到最大值。

实施例3

本实施例描述了本发明提供的IBDV基因工程疫苗的其中一种。它为注射疫苗：包括以上所述的感染重组病毒的家蚕幼虫的血淋巴和免疫佐剂，家蚕血淋巴与免疫佐剂以1∶1～3(V∶V)混匀，免疫佐剂可为ISCOM、矿物油、弗氏不完全佐剂等，比例可为1∶2。

其生产方法为收集上述家蚕的血淋巴，3000rpm低速离心5min收集上清，将该上清与免疫佐剂在1∶1～3(V∶V)的范围中的任意比例混匀即可，例如1∶2。

实施例4

本实施例描述了本发明提供的IBDV基因工程疫苗的其中一种。它为口服疫苗：它为以上所述的感染重组病毒的家蚕幼虫的血淋巴干粉的无菌水溶液或生理盐水溶液，血淋巴干粉的浓度为20～150mg/ml，例如50mg/ml。

其生产方法为收集上述家蚕的血淋巴，冷冻干燥成干粉，无菌水或生理盐水溶解制成口服疫苗，血淋巴干粉的浓度为20～150mg/ml，例如50mg/ml。

参照图4。用注射IBDV基因工程疫苗皮下注射接种非免疫雏鸡，每只0.5ml，疫苗中家蚕血淋巴与免疫佐剂如弗氏不完全佐剂1∶2，两周后加强免疫，收集首次免疫后第10,13,21,28,37天血清；用口服IBDV基因工程疫苗以每只雏鸡喂服1ml疫苗，干粉浓度为50mg/ml，隔天喂服10次，收集首次喂服免疫后第10,13,21,28,37天血清；按以下方法测定上述血清中的IBDV中和抗体效价：9日龄非免疫胚在无菌条件下，用剪刀剪成小块，去除眼、内脏和爪；用MEM液清洗二次，移至消化瓶继续剪成糊状，加入4倍量0.25％胰酶消化液，37℃水浴消化30min，用MEM洗二次，洗去胰酶消化液，加入细胞培养液(8％FBS+2％青霉素+2％链霉素+MEM液，pH7.0～7.2)，摇匀，纱布过滤，用细胞培养液将鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞浓度稀释至1～1.5×10⁶个细胞/ml MEM培养液，细胞以每孔180ul培养于96孔板中；用MEM液2倍稀释收集的免疫鸡血清，待96孔板中的CEF细胞长成单层后，将稀释的鸡血清滴加到CEF细胞孔中，每一种稀释梯度滴加5孔CEF细胞，然后往每孔加入100 TCID50 IBDV JD1株(由浙江大学动物科学学院保存)，根据CEF细胞的病理学效应(Reed-Muench法)计算血清中的病毒中和抗体效价，将效价的几何平均数(GMT)的变化绘制成图4，从图中可以看出在首次注射和口服免疫后的第10天即可检测到较高的中和抗体水平，然后逐渐升高，在首次免疫后第37天分别达到1∶4211.4和1∶3118.9，而正常蚕血免疫组和健康对照组几乎检测不到被免疫鸡群血清中的IBDV中和抗体。

参照图6、7。首次注射或喂服免疫后第37天，注射疫苗为家蚕血淋巴与免疫佐剂如矿物油1∶2.5，口服疫苗为血淋巴干粉的浓度为70mg/ml。用中国IBDV标准强毒株BC6/85以点眼攻击被免疫鸡群，强毒IBDV攻击后第3天，100％的正常蚕血免疫组鸡群开始表现典型的传染性法氏囊病症状，20％的口服免疫组鸡群表现轻微的传染性法氏囊病症状，而全部注射疫苗免疫鸡群及其它80％口服疫苗喂服鸡群均未表现传染性法氏囊病临床症状。取出鸡群法氏囊，10％甲醛固定，包埋，切片，HE染色，镜检法氏囊组织的病理变化。图6、7表明在标准强毒株BC6/85攻击后第三天未表现传染性法氏囊病临床症状的免疫鸡群法氏囊未发生病理变化，图5为服用正常蚕血鸡群攻毒其法氏囊组织病理切片。

参照图8。本发明提供的注射和口服基因工程疫苗免疫18日龄雏鸡，注射疫苗为中家蚕血淋巴与免疫佐剂如ISCOM 1∶1.5，口服疫苗为血淋巴干粉的浓度为120mg/ml。首次注射或喂服免疫后第37天，用中国IBDV标准强毒株BC6/85以点眼攻击被免疫鸡群，3天后扑杀，观察法氏囊病变情况，称体重和囊重，计算囊体比(BBWR)和囊指数(BBIX)，并进行统计分析。该表说明注射免疫组(组Ⅰ)、口服免疫组(组Ⅱ)的囊体比(BBWR)和囊指数(BBIX)与正常对照组(组V，不免疫也不攻毒)相比无统计差异(P＞0.05)，正常蚕血免疫攻毒组(组Ⅲ)与非免疫攻毒组(组Ⅳ)相比无统计差异(P＞0.05)，而组Ⅰ与组Ⅲ或组Ⅳ、组Ⅱ与组Ⅲ或组Ⅳ的囊体比(BBWR)和囊指数(BBIX)有显著统计差异(P＜0.05)。该表的统计分析表明本发明提供的注射和口服基因工程疫苗的免疫保护率分别为100％和80％。

  *    囊体比(BBWR)=法氏囊重÷鸡体重×1000，

  **  囊指数(BBIX)=(法氏囊重÷被免疫的鸡体重)÷(法氏囊重÷非免疫时的鸡体重)，

A Fisher′st-test无显著差异(P＞0.05)，

B Fisher′st-test有显著差异(P＜0.05)，

＋法氏囊轻微损伤，

法氏囊中度或严重损伤。