一种宫颈癌高危人群的基因筛查方法

本发明涉及一种宫颈癌高危人群的基因筛查方法。

宫颈癌是成年妇女中最常见的恶性肿瘤，据国际卫生组织的报道，全世界每年约有460000新病例发生，其中中国约为135000例，占28.6％，是危害我国广大妇女身心健康的主要因素之一。宫颈癌的病因十分复杂，近年来大量资料表明，人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus)某些型别在宫颈癌的发病过程中起着重要作用，HPV属于乳多空病毒群中的乳头瘤病毒亚群，其基因组是一闭合双股DNA，约8000bp。通过对HPV克隆基因DNA的杂交实验及酶谱分析，现已鉴定出约70个型别HPV，每一型别都与体内特定的感染部位及病变性质有关。现证实HPV16、HPV18型与宫颈癌的发病密切相关，属于“高度危险”的亚型，通过对宫颈癌组织和癌细胞株提取的HPV16、HPV18的DNA进行分析，发现HPV基因组在整合状态时，E6、E7基因总是保留完整，提示其极可能是宫颈癌潜在的癌基因。HPV整合基因检测宫颈癌可以检出高危人群，该人群日后患宫颈癌的可能性较低危人群(HPV-16,-18阴性人群)高20～50倍。综上所述，HPV的基因筛选是早期发现宫颈癌的一个重要指标。

近年来国内外学者对于HPV的快速检测做了大量的研究工作，目前多采用有分子探针杂交、免疫组化的方法。分子探针杂交法有一定的敏感性，但操作非常复杂、耗时，极不适于在临床实验室推广。免疫组化方法则敏感性和特异性均低。因此，以上两种方法不能满足宫颈癌高危人群的大范围快速筛选的目的。另外，这两种方法所使用的检材多为组织活检标本，尤其不适应于对健康人群的筛选。

近年来发展起来的多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)虽然已被应用于HPV的检测，但其检测标本也是主要针对宫颈癌病理组织，而由于脱落细胞(棉拭子采集的宫颈分泌物)所含细胞和病毒DNA的量很小，用一般PCR方法检测敏感性较低，不能满足健康人群的大规模筛选需要。

本发明的目的是提供一种特异、敏感、快速、易于被受试者接收的宫颈癌高危人群的基因筛查方法，用于筛选健康妇女中的感染者，即宫颈癌的高危人群，以引起感染者本人和临床医生的高度警惕，防止或早期发现宫颈癌的发生。

为实现上述目的，本发明采取以下设计方案：这种宫颈癌高危人群的基因筛查方法，其实验步骤如下：

1)采集待检妇女宫颈分泌物标本；

2)从分泌物中提取DNA作为扩增模板；

3)用HPV16和HPV18通用引物P1和P4做外侧扩增，获得外侧扩增产物；

4)取外侧扩增产物作为模板，再加入引物P2做HPV16的内侧扩增，或再加入引物P3做HPV18的内侧扩增；同时设立各自的阳性对照；

5)取步骤4)的扩增产物在含EB的琼脂糖凝胶中电泳，用紫外分光透射仪观察实验结果，并与阳性对照比较作出判断。

下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

图1为本发明方法步骤流程方框图

图2为本发明HPV16 E6/E7部分基因序列与引物示意图

图3为本发明HPV18 E6/E7部分基因序列与引物示意图

本发明的主要方法步骤如图1所示。

实施例1：

1、临床医生采集标本：用无菌棉拭子采集宫颈口的分泌物后，将拭子置于盛有2ml无菌的生理盐水的EP管(自备)中4℃保存备检。

2、DNA提取：

(1)将棉拭子放入生理盐水中震荡，取出拭子，5000rpm离心3min，弃去上清液；

(2)加入1ml生理盐水悬浮沉淀，5000rpm离心3min，弃去上清液；

(3)加入500μl裂解液悬浮沉淀，55℃水浴3小时；

(4)加入500μl蛋白变性液，剧烈振荡混匀液体，12000rpm离心10min；

(5)将上层的水相液体取300μl入一新的EP管中，加入300μl预致冷的DNA沉淀剂，混匀后放置4℃30min后，15000rpm离心10min；

(6)将沉淀放置温室约10min使沉淀干燥；

(7)加入DNA水合剂10μl溶解沉淀。

3、PCR扩增：

(1)试剂和模板的预处理：将提取的模板和各PCR引物放入100℃水浴2min，取出立即放入冰上备用；

(2)外侧扩增：在冰上按“外侧PCR反应体系表”在0.5mlEP管中加入各成分，混均后加入适量无菌石蜡油，放入DNA扩增仪中扩增；同时设立阳性和阴性对照，循环参数如下：

            94℃预变性5min

                  ↓

(94℃×30s,47℃×50s,72℃×1min)×35个循环

                  ↓

              72℃延伸5min

(3)内侧扩增：取外侧扩增产物，在冰上按“内侧PCR反应体系表”在0.5mlEP管中加入各成分，混均后加入适量无菌石蜡油，放入DNA扩增仪中分别扩增HPV16和HPV18，循环参数如下：

            94℃预变性5min

                  ↓

(94℃×30s,50℃×30s,72℃×1min)×35个循环

                  ↓

             72℃延伸5min

4、结果判断：取内、外侧扩增产物2.5μl，加适量溴酚蓝后1.5％琼脂糖凝胶电泳后于紫外灯下观察结果。阴性对照(正常人类基因组DNA)无目的带产生，而待测样品产生与相应阳性(HPV16、HPV18型病毒编码E6、E7基因阳性DNA对照)对照大小一致(电泳位置相同)的特异性带，则为阳性。

本发明是通过半套式PCR聚合酶链式反应检测人群的HPV16/HPV18型病毒编码E6/E7基因而实现宫颈癌高危人群的筛查。其中上述方法步骤中涉及的各试剂的功用如下：

裂解液：以SDS-蛋白酶K等成分为主构成的缓冲液可以实现对细胞的裂解。

蛋白变性液：以酚-氯仿为主的缓冲液实现对细胞蛋白质的变性及DNA的提取。

DNA沉淀剂：无水乙醇实现DNA的沉淀

DNA水合剂：Tris-EDTA缓冲液实现对纯化DNA的溶解。

PCR扩增缓冲液(10×PCR Buffer)：以EDTA及镁离子等组成的缓冲液是进行PCR反应的缓冲体系。

P1、P2、P3、P4引物：设计的HPV16、HPV型病毒编码E6、E7基因的通用引物及特异性引物可以特异性地选择扩增相关的基因片段。

四种单体脱氧核苷酸混合液(4×dNTP)：在基因片段扩增时提供底物。

TaqDNA聚合酶：通过生物酶促反应，实现对特异性基因片段的扩增。

HPV16、HPV18型病毒编码E6、E7基因阳性DNA对照液：在特异性基因扩增时提供阳性基因的扩增参照体系。

正常人群的DNA作为HPV16、HPV18型病毒编码E6、E7基因阴性DNA对照液：在特异性基因扩增时提供阴性基因的扩增参照体系。

上述的“外侧PCR反应体系表”“内侧PCR反应体系表”分别如下：

外侧PCR反应体系(总反应体积25μl)

内侧PCR反应体系(总反应体积25μl)

本发明的实现：先在GENEBANKD中查得HPV16,18E6/E7基因的序列，用DNAstar软件进行序列比较和分析(现有技术，此处不再赘述)，设计出二者的共享序列，分别设计成上游和下游通用引物P1、P4，作为外侧引物进行扩增，可得431bp和473bp的产物；然后再在P1和P4之间分别选择HPV16和18的特异性引物，以外侧扩增产物为模板分别进行内侧半套式PCR扩增(见图2、图3)。

下面所示的是半套式PCR检测HPV16,18引物序列

本发明的积极效果在于：

1、检测标本为妇女宫颈分泌物，易于被待检妇女接受；

2、采用半套式PCR技术，具有较高的敏感性(最低可检测浓度为3fg/μl)和特异性(对人类基因组DNA、HCMV和大肠埃西菌DNA以及其其他型别的HPV进行检测，均未见假性阳性结果产生)；

3、半套式PCR的引物仅有2对4条，成本低；

4、操作简便，耗时少，便于在基层医院和计生部门实验室推广。