水稻种子直链淀粉含量低的水稻植株的筛选方法

本发明总体上涉及植物学领域，具体涉及作物育种领域。更具体地说，本发明涉及一种稻米直链淀粉含量低或中等的水稻植株的筛选方法。

水稻是我国农业生产中最重要的粮食作物之一，稻谷产量在我国粮食总产量中占43％。在过去几十年中，我国遗传育种学家和农业专家们在提高水稻的单产上已经作出了很大的贡献。随着人口的增长和人民生活水平的不断提高，也为了适应商品粮出口贸易的需要，需要生产更多更适合人们口味的粮食。因此，培育出产量更高、食用品质更好的水稻新品种仍然是遗传育种学家不断追求的目标。

近几年我国农业连年丰收，农产品供求格局发生了重大变化，粮食生产进入了买方市场新阶段，使多数省份的粮食库存暴满，尤其中劣质稻谷积压较多。相反，市场对优质稻米的需求却在不断增加。随着人民生活水平的提高，对大米的外观品质、食味品质提出了新的更高的要求，特别是部分收入较高的家庭，对日常大米品质的要求越来越高。而我国多数水稻品种外观不佳、口感不好，优质高产适用范围广的品种较少，尤其对于籼型杂交稻来讲，更是如此。

稻米食用品质的优劣在很大程度上与稻米胚乳中淀粉的组成，即直链淀粉与支链淀粉的比例有关，稻米直链淀粉含量过高，往往使饭质变硬、口感差，因而影响稻米的食用品质。在常规育种中，由于常常以产量为首选目标，因此有相当一部分水稻品种的产量水平较高，但品质往往偏差；在杂交稻新组合的常规选育过程中，某些亲本如龙特甫、特青、珍汕97等品种具有高产、抗病特性，但由于它们的直链淀粉含量很高，所以由它们配制生产的杂交稻米的蒸煮食用口味较差。特别是一些籼型杂交稻，其产量可比常规品种增产15～20％，但杂交稻米品质却不够理想，造成库存积压，价格偏低。究其原因，主要是由于杂交稻米的直链淀粉含量偏高，如目前应用于三系杂交稻的不育系亲本珍汕97(A)的直链淀粉含量为27％左右，而龙特甫(A)更高达30％左右。

稻米中的淀粉由直链淀粉与支链淀粉两部份组成，直链淀粉是由α-(1，4)键连接的葡萄糖残基组成的线型长链多醣大分子，而支链淀粉具有α-(1，6)键形成的分叉点。支链淀粉一般占70％以上，其余则为直链淀粉。胚乳中直链淀粉的含量在决定稻米产量，食用品质与蒸煮加工品质上均起着重要作用。除了栽培条件对稻米中的直链淀粉含量有影响外，直链淀粉在不同品种稻米中的含量差异是可遗传的特性。

Khush等于1984年在Genetics，107：141-167中报道，水稻第3号染色体(现在称为第6号染色体)上的水稻蜡质基因(waxy基因)控制着胚乳中直链淀粉的合成。该基因编码结合于淀粉粒上的淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase，GBSS)[EC.2.4.1.11]，从而控制水稻花粉、胚乳和胚囊中直链淀粉的合成(Okagaki和Wessler，1988年，Genetics，120：1137-1143)，是影响水稻胚乳中淀粉组成的一个关键基因。由于该基因只在水稻的花粉、胚乳与胚囊中高效表达，因此它是时空专一性表达的基因。

申请人已经从水稻中克隆出了蜡质基因，并完成了顺序分析。该基因由13个外显子和14个内含子组成。水稻蜡质基因的第1内含子存在于5′引导区中，长度为1124bp。和玉米，大麦等单子叶植物的蜡质基因相比，水稻蜡质基因具有较大的第1内含子顺序[Wang，ZY；Wu，ZL；Xing，YY；Zheng，FQ；Guo，XL；Zhang，WG andHong，MM，(1990)Nucleotide sequence of rice waxy gene.Nucleic Acids Research.18(19)：5898.]。

很多起重要作用的基因，不但在转录水平上受到调控，而且在转录后水平上也受到调控。在研究水稻蜡质基因表达调控的工作中，我们观察到粳稻寒丰的蜡质基因有2.3kb和3.3kb的两种转录产物存在，其中2.3kb转录产物是成熟的mRNA，而经分析证明，3.3kb转录产物是第1内含子未被切除的前体RNA。我们检测了三十多个水稻品种(其中有籼稻、粳稻和糯稻)的种子中直链淀粉的含量、Wx蛋白的相对含量与未成熟种子中蜡质基因二种转录产物的相对量。结果表明，直链淀粉、Wx蛋白与蜡质基因成熟mRNA(2.3kb)含量之间有正相关性；而与前体RNA(3.3kb)的含量有负相关性。由此提示不同水稻品种中蜡质基因的表达水平受蜡质基因转录后水平的调控，特别与转录初级产物中第1内含子被剪接的程度有关，即剪接效率高的品种直链淀粉含量也高[Wang，ZY；Zheng，FQ；Shen，GZ Gao，JP；Snustad，D.P.；Li，MG；Zhang，JL和Hong，MM，(1995)The amylose content in rice endosperm is related to thepost-transcriptional regulation of the waxy gene.Plant Journal.7(4)：613-622]。

为弄清稻米中直链淀粉是否确与此内含子剪接效率有关系，申请人构建了由籼稻232蜡质基因启动子、籼稻232(高直链淀粉含量的品种)或粳稻寒丰6366(中、低直链淀粉含量的品种)Wx基因第1内含子与GUS报告基因组成的两种嵌合基因，将含有这两种嵌合基因的质粒分别转化进不同的水稻品种中，测定它们的抗性愈伤组织与转基因植株未成熟种子胚乳中的GUS酶活性。测定结果显示含有籼稻232(高直链淀粉含量的品种)Wx基因第1内含子的嵌合基因GUS活性比粳稻寒丰6366(中、低直链淀粉含量的品种)Wx基因第1内含子的嵌合基因GUS活性明显高出几十倍。

申请人还通过RT-PCR并结合顺序测定，分析了不同水稻品种中蜡质基因第1内含子被剪接的情况。结果显示在高直链淀粉(＞20％)含量的水稻中，蜡质基因第1内含子的剪接完全符合内含子剪接的GT-AG规则；而在中、低直链淀粉(6～16％)含量的水稻中，蜡质基因第1内含子的剪接有替换现象，它们利用了隐蔽的供、受体位点[Cai，XL；Wang，ZY：Xing，YY；Zhang，JL and Hong，MM，(1998)Aberrantsplicing of intron 1 leads to the heterogeneous 5｀UTR and decreased expression of waxygene in rice cultivars of intermediate amylose content Plant Journal.14(4)：459-465.]。关于蜡质基因的特性分析还在进一步的研究之中。

目前，常规育种方法筛选低或中等直链淀粉含量的水稻依靠的是直接测定水稻胚乳中的直链淀粉含量。然而，该方法存在着一些缺点。水稻是二倍体植物，它的种子(即稻米)主要由胚与胚乳两部份组成。胚乳是水稻植株中由三倍体细胞组成的一个高度特化的贮藏组织，胚乳中积累了大量的碳水化合物和贮藏蛋白，它的干物质重量可占种子干重的75％左右。人们作为食物的稻米就是水稻种子中的胚乳部分。由于胚乳细胞在水稻植株中是三倍体，并且比二倍体的当代体细胞要晚一代，因此胚乳性状(如直链淀粉含量)的遗传育种中存在着遗传分离与基因剂量效应，与其它性状的遗传有所不同。所以用检测直链淀粉含量的常规育种方法对其进行改良不但非常繁琐，而且不易获得控制稻米直链淀粉含量的纯合基因型。目前某些杂交稻组合生产的稻米虽然直链淀粉含量有所降低，但由于不育系仍是高直链淀粉含量的基因型，它所生产的杂交稻米是一个杂合群体，不同米粒的直链淀粉含量各不相同，它的蒸煮加工特性和适口性仍然不好(莫惠栋，顾铭洪，姜长鉴等(1990)谷类作物品质性状遗传研究进展，江苏科学技术出版社)。而且，由于常规的育种方法需要在植物结出种子后才能测定种子的直链淀粉含量，因此该方法的周期较长。

为了克服常规育种方法所存在的这些缺点，本发明的目的是通过进一步研究水稻蜡质基因第1内含子的序列和特性，提供一种周期短、结果准确的水稻筛选方法。

本发明提供了一种水稻种子直链淀粉含量低或中等的水稻植株的筛选方法，该方法是用DNA序列分析方法鉴定水稻蜡质基因第一内含子中供体+1位的碱基，然后选出该位碱基为T的水稻植株。

通过比较高和中、低直链淀粉含量的两类水稻品种的Wx基因第1内含子，申请人发现其间有16个碱基有差异。随后，申请人通过定点突变和转化植株的方法研究了水稻Wx基因第1内含子中的几个突变点对基因表达的影响。将高直链淀粉含量品种的Wx基因启动子中第1内含子部分位点根据中、低直链淀粉水稻品种的碱基作体外定点突变，将改造过的启动子与GUS编码区融合构建成嵌合质粒，分别转化粳稻中花11号，然后测定转化植株未成熟种子胚乳中的GUS活性。结果表明，蜡质基因第1内含子供体+1位的碱基G，突变成T碱基后，即第1内含子的5′端剪接点碱基替换后(AGgt/AGtt)造成GUS活性的急剧下降，而其它几个已检测位点均对基因的表达没有显著的影响。因此，申请人推测，第1内含子5′端的鸟嘌呤(G)是Wx基因第1内含子高效切除和外显子正确拼接所必需的，而在中低直链淀粉含量的水稻品种的Wx基因中该处为胸腺嘧啶(T)所代替，从而使得切除效率大大降低，进而影响直链淀粉的含量。申请人还进一步发现，在所测定的所有籼稻和粳稻植株中，蜡质基因第1内含子供体+1位的碱基均为T或G。

基于这些发现，本发明提供了一种在育种过程中通过鉴别蜡质基因第1内含子供体+1位的碱基来筛选水稻种子直链淀粉含量较低的水稻植株的方法。在本发明的一个较佳的实施方案中，所述用来鉴定蜡质基因第1内含子供体+1位碱基的方法包括PCR-测序法，在严谨条件下的Southern杂交法和PCR-酶切方法。

PCR-测序法包括下列步骤：按单碱基突变点旁邻DNA顺序设计一对引物，用样品植株的总DNA作为模板，经PCR扩增出该DNA片段，将其克隆到测序质粒载体上或直接对该DNA片段进行序列测定，从而判断突变位点是何种碱基。对DNA片段的测序方法具体包括，但不局限于，例如Sanger双脱氧链终止法以及Maxam-Gilbert测序法等(参见Sambrook等人，《分子克隆实验指南》，第2版，Cold SpringHarbor Press(Cold Spring Harbor，NY，1989))，其中较佳的是Sanger双脱氧链终止测序法。

严谨条件下的Southern杂交方法包括下列步骤：按单碱基突变点旁邻DNA顺序设计跨突变点的二个DNA探针，一个探针中该位点碱基与未突变碱基相同，另一个探针中该位点碱基与突变碱基相同。二个探针经同位素标记后，在控制的严谨条件下与样品植株的总DNA进行Southern印迹杂交。由于二个探针与样品DNA的退火温度不同，杂交后的信号强弱不同，由此可以判断突变位点是何种碱基(同样参见Sambrook等人，《分子克隆实验指南》，第2版，Cold Spring Harbor Press(Cold SpringHarbor，NY，1989))。

但是，如本发明上文所描述的，只需通过鉴定水稻蜡质基因内含子供体+1位的碱基是T还是G即可预测水稻成熟后所结出种子中的直链淀粉含量水平，因此本发明在这里提供了一种成本低、简单迅速的PCR-酶切检测方法。

因此，在本发明的一个较佳实施方案中，采用PCR-酶切方法鉴别所述蜡质基因第1内含子供体+1位碱基是G还是T，该方法包括下列步骤：

1)根据水稻蜡质基因第1外显子和第1内含子连接区域二侧设计并合成PCR引物；

2)提取水稻植株的总DNA；

3)以水稻总DNA为模板，加入合成的引物，进行PCR扩增；

4)用限制性内切酶消化该扩增产物；

5)使产物在琼脂糖凝胶上电泳；

6)EB染色，在UV灯下观察电泳后的DNA条带位置。

将蜡质基因第1内含子供体+1位是G碱基的水稻品种的基因型标记为GG；是T碱基的水稻品种的基因型标记为TT。若采用的限制性内切酶能识别GG基因型的序列，而消化产物与未经消化的产物中DNA条带泳动距离相同，则表明该水稻品种为TT基因型；若未经消化的产物中DNA泳动距离比消化产物中DNA的泳动距离更远，限制性内切酶可以切断PCR扩增产物，则表明该水稻品种为GG基因型；若消化产物中两种泳动距离的DNA条带都存在，表明该水稻株为TG杂合的基因型(见图2的电泳示意图)。反之，若采用的是特异性识别TT基因型序列的限制性内切酶，则DNA条带泳动距离与未经消化的产物相同的经消化产物代表GG基因型(电泳图未显示)。较佳的，该限制性内切酶是特异性识别GG基因型序列的AccI酶。

然而，应当理解，本发明的DNA序列分析方法并不局限于上述这几种方法。在现有技术中，测定/鉴别序列已知的基因中特定碱基的方法均是众所周知的。本领域普通技术人员显然可以根据本说明书的教导对本发明的方法作各种改进和变化，因此，所有这些改进和变化也均在本发明的范围内。

在本发明的另一个较佳的实施方案中，所述鉴别步骤可以在水稻生长的任何时期进行。更佳的，所述鉴别/测定步骤可在水稻生长苗期进行。在另一个较佳的实施方案中，可以选取单株进行所述鉴定。

水稻种子直链淀粉含量可用本领域熟知的常规手段来测定，例如包括但不局限于采用本文实施例所述的方法来测定。在本文中，若测得水稻胚乳中的直链淀粉含量高于20％(重量)，则称“直链淀粉含量较高”；或该直链淀粉含量低于20％(重量)，则称“直链淀粉含量低或中等”。

采用本发明的方法具有以下几个显著的优点。首先，本发明找到了一个与水稻种子直链淀粉含量的基因型直接相关的分子标记。在本文中，该“分子标记”为蜡质基因第1内含子供体+1位的碱基。该分子标记与一般意义上的育种分子标记不同，它不仅与水稻种子的直链淀粉含量在遗传上完全连锁，而且所检测的水稻蜡质基因第1内含子供体+1位的碱基本身即是决定不同稻米品种直链淀粉含量的重要遗传因素。第二，本法在水稻生长期的任何时期均可对水稻植株的基因型进行测定，可选择纯合的基因型植株，可预测稻米直链淀粉含量的高低。第三，它可以单株测定，因而在水稻回交转育时的营养生长期即可预选单株作为杂交或回交的亲本。本方法检测基因型简单易用，在水稻苗期即可选择回交的单株，减少了盲目性，也无需等待植株结籽后测定直链淀粉的表型，避免了遗传分离与基因剂量效应的影响，减轻了工作量，大大增加了育种几率。第四，通过不断的回交，在选择中等直链淀粉含量基因型的同时，可以保持被改良品种的其它优良性状。因而可用于杂交稻不育系中等直链淀粉含量基因型的选育。

下面结合附图再进一步描述本发明。

图1是高直链淀粉含量的水稻品种(GG基因型)中蜡质基因第1内含子5′供体旁邻的部分DNA序列，图中gtatac是AccI的识别序列，在中等直链淀粉含量的水稻品种(TT基因型)中g突变成t之后成为不能被AccI识别。下划线标出了PCR中上下游引物的位置。

图2是不同基因型水稻品种经PCR-酶切后检测的电泳示意图。图中左侧条带为原点，右侧为DNA电泳条带。泳道1-5分别为：1)经酶切的GG基因型PCR产物；2)经酶切的TT基因型PCR产物；3)经酶切的GT基因型PCR产物；4)GG基因型PCR产物；5)TT基因型PCR产物。

图3是分子标记辅助育种改良稻米食用品质的流程图。

下面结合实施例进一步描述本发明。

实施例1分子标记的鉴定

1)叶片总DNA的提取

在小研钵中加入400μl预冷的提取缓冲液(1.4mol/l NaCl，100mmol/l Tris.Cl，20mmol/l EDTA，pH8.0)，加入2cm²新鲜的水稻叶片，匀浆。将匀浆液倒入1.5ml离心管中，再加入500μl 60℃预热的2×CTAB缓冲液[2％CTAB(w/v)，1.4 mol/l NaCl，100mmol/l Tris.Cl，20mmol/l EDTA，pH8.0]，混匀后在60℃保温30—60分钟。加入450μl氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液，摇匀，室温下以13000rpm离心10分钟。将上相水溶液移入新离心管中，加入600μl异丙醇，混匀后-20℃放置15分钟。在4℃以10000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀用500μl 70％乙醇洗涤一次。真空干燥沉淀后，用30μl TE缓冲液溶解。

2)PCR反亚

在0.5ml离心管中，分别加入5μl 10×PCR缓冲液(10mmol/l Tris.Cl，pH8.3，50mmol/l KCl，0.001％gelatin)，3μl 25mmol/l MgCl₂，4μl 2.5mmol/l dNTPs，50pmol上游引物(5′-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3′)，50pmol下游引物(5′-ATGATTTAACGAGAGTTGAA-3′)，1μl叶片总DNA，1U Taq聚合酶，用无菌ddH₂O将总体积补足至50μl。在PERKIN ELMER公司GeneAmp PCR System 9600型PCR扩增仪上按下列条件扩增30个循环：94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸40s，最后一个循环后再在72℃延伸反应10分钟。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在紫外灯下可检测到一条460bp的DNA条带。

3)AccI酶切鉴定

在0.5ml离心管中，加入10μl PCR扩增产物，1.5μl 10×酶切缓冲液(33mmol/lTris-acetate，10mmol/l MgAc，66mmol/l KAc，0.5mmol/l DTT，pH7.9)，5U AccI酶，用无菌ddH₂O将总体积补足至15μl，混匀后在37℃保温1h，在2％琼脂糖凝胶上电泳检测，与未经酶切的PCR扩增产物进行比较。若PCR反应产物中存在AccI酶切位点，则460bp的DNA片段被切成403bp和57bp二条条带，在2％琼脂糖凝胶上，可区分460bp与403bp的DNA迁移距离。

4)Sanger双脱氧链终止法测序

如步骤1)，2)所述，获得PCR扩增产物。如Sambrook等人，《分子克隆实验指南》，第2版，Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor，NY，1989)中所述的那样，用Sanger双脱氧链终止测序对该扩增产物进行测序。

5)严谨条件下的Southern印迹杂交

设计并合成二个DNA探针：1)5′-GCAAGGTATACATATATGTT-3′，2)5′-GCAAGTTATACATATATGTT-3′。用[γ-³²P]P对二个探针进行同位素标记。在控制的严谨条件(6×SSC、5X Denhardt′s试剂、0.5％SDS、100微克/毫升变性片段化鲑精DNA，48℃下进行杂交)下，使探针与步骤1)获得的样品植株总DNA进行Southern印迹杂交。

用上述不同方法对27个水稻品种的分子标记(即蜡质基因第一内含子供体+1位碱基)进行鉴定，所得结果归纳在下表1中。

实施例2直链淀粉含量的测定

从68℃烘烤2小时后的Sigma公司的直链淀粉、支链淀粉样品中，称取直链淀粉和支链淀粉各50mg，分别加入编号的容量瓶中，然后各加1ml无水乙醇，使淀粉浸润，再各加9ml 1mol/l NaOH，沸水浴10分钟，冷却后定容至100ml，充分混匀，按下列比例吸取：

容量瓶编号  0    1    2    3    4    5    6    7    8

直链淀粉(ml)0    0.1  0.2  0.3  0.4  0.5  0.6  0.7  0.8

支链淀粉(ml)2.5  2.4  2.3  2.2  2.1  2.0  1.9  1.8  1.7

AC％        0    4    8    12   16   20   24   28   32

加25ml ddH₂O，0.5ml 1mol/l HAc，0.5ml I-KI试剂，定容至50ml，充分混匀放置10分钟。同时，配置空白对照，吸225μl 1mol/lNaOH，加25ml ddH₂O，0.5ml 1mol/lHAc，0.5ml I-KI试剂，定容至50ml，以此为对照管在620nm处读取上述各管光密度值，建立标准曲线。

取成熟种子去壳、脱粒，磨成粉末，过100目筛，68℃烘烤过夜。取25mg样品干粉，加0.5ml无水乙醇、4.5ml 1mol/l NaOH，沸水浴10分钟，冷却后定容至50ml，充分混匀。取2.5ml，加25ml ddH₂O，0.5ml 1mol/l HAc，0.5ml I-KI试剂，定容至50ml，充分混匀放置10分钟，设空白对照，方法照前，测620nm光密度读数。在标准曲线上查得样品的直链淀粉含量。

下表1中列出了对不同水稻品种或杂交稻亲本的种子中直链淀粉含量及其分子标记的鉴定结果。

表1不同水稻品质直链淀粉含量与分子标记的检测结果

从表1中可以看出，在这27个水稻中，无一例外的具有GG基因型的水稻品种或杂交稻亲本均有较高的直链淀粉含量，而具有TT基因型的水稻均为中低等含量的水稻品种或杂交稻亲本。这充分证明，本发明所选的分子标记与水稻直链淀粉含量是紧密连锁的。

实施例3分子标记辅助选择育种

根据本文所选的分子标记与水稻种子直链淀粉含量之间的紧密连锁关系，设计用该分子标记辅助选择低或中等直链淀粉含量水稻的育种方法。将一待改良的目标品种或杂交稻亲本(栽培性状优良而食用品味差的、含高直链淀粉的GG基因型水稻品种，如珍汕97B)与中等直链淀粉含量的、具有TT基因型的水稻品种(如9511，盐恢559)杂交，在不断的用GG基因型水稻品种与杂交子代的回交过程中，用上述PCR-酶切方法检测回交子一代植株的基因型，选择GT杂合型的子代植株作为父本进行回交，用建立近等位基因系的方法对那些产量虽然高但食用品质较差的GG基因型水稻品种进行遗传改良，在保持原有栽培水稻品种优良性状的同时，降低它们的直链淀粉含量，达到改善食味的目的。图3中示出了分子标记辅助育种改良稻米食用品质的流程图。

为验证我们的设计，对GG基因型与TT基因型水稻杂交后又经自交的F2代不同单株的分子标记及其所结种子中的直链淀粉含量进行了测定，测定数据再一次表明该分子标记与种子中的直链淀粉含量二者之间是紧密连锁、共同分离的。下表2中显示了亲本及其杂交F2代单株基因型、直链淀粉含量的检测结果。

                       表2亲本与杂交F2代单株基因型、直链淀粉含量的检测结果

例如在珍汕97B(GG基因型，直链淀粉含量为31％的待改良目标亲本)与9511(TT基因型，直链淀粉含量为15％)的杂交组合中，随机选取F1代植株上所结的60粒种子，种植后得到56株F2代植株，经检测有17株为TT基因型，它们所结种子的直链淀粉含量在7.1-23.0％之间，其中15株直链淀粉含量低于19％；有24株为GT杂合的基因型，它们的直链淀粉含量在13.1-31.0％之间，其中19株直链淀粉含量在21.1-29.0％；而具有GG基因型的为15株，它们的直链淀粉含量在19.1-31.0％之间，其中12株的直链淀粉含量高于25％。

又如在珍汕97B(GG基因型，直链淀粉含量为31％的待改良目标亲本)与盐恢559(TT基因型，直链淀粉含量为13％)的杂交组合中，随机选取F1代植株上所结的种子，种植后得到46株F2代植株，经检测有14株为TT基因型，它们所结种子的直链淀粉含量在7.1-15.0％之间，所有TT基因型的14株直链淀粉含量均低于15％；有25株为GT杂合的基因型，它们的直链淀粉含量在15.1-29.0％之间，其中18株的直链淀粉含量在19.1-25.0％；而具有GG基因型的为7株，它们的直链淀粉含量在17.1-31.0％之间，其中5株的直链淀粉含量高于25％。