具有抗骨质疏松作用的雌激素－生长激素释放肽缀合物

发明领域

本发明涉及生长激素释放肽及其合成，雌激素-生长激素释放肽缀合物及其合成方法，以及这些缀合物及其药用盐作为抗骨质疏松药物的应用和含有这些缀合物及其药用盐的药物组合物。

背景技术

绝经(即缺乏雌激素)可引起骨质疏松。女性的退行性骨质疏松症可分为两期，即绝经初期发生的快速、暂时骨丢失，这个时期小梁骨大约丢失20-30％，皮质骨大约丢失5-10％，年平均骨丢失量为2％；以及后来的缓慢骨丢失过程，这个时期小梁骨和皮质骨均丢失20-30％。(Gamero P，Sornay-RendnE.，et al.Increased bone turnover in late postmenopausal women is a majordeterminent of osteoporosis，J.Bone Miner Res.，1996，111，337)。内源性雌激素水平与绝经妇女骨密度呈正相关，当体内雌二醇水平低于5pg/ml时，年髋骨丢失率大约可达5％(Stone K，Bauer D，et al.，Hormonal predictors ofbone loss in elderly women：a prospective study，J.Bone Miner Res.，1998，113，1167)。服用外源性雌激素，保证血浆雌二醇的浓度不低于50pg/ml，可以防止骨丢失(Christiansen C，Christensen MS，et al.，Mechanisms of Estrogen effecton bone metabolism，dose-response relationship in early postmenopausalwomen，J.Clin Endo Metab，1982，155，1124)。

促生长激素释放肽是一类人工合成的小分子多肽，可以增强体内生长激素的分泌脉冲，间接或直接促进骨转换(Svensson J，Ohlson C.，etal.，Treatmentwith the oral growth hormone secretagogue MK-677 increases markers of boneformation and bone resorption in obese young males，J.Bone Miner Res，1998，113，1158)。糖皮质激素由于对其它激素所作用的受体和受体后信息传递物质具有调节作用而使其它激素，例如多肽激素增效。这种作用被定义为允许作用(Ingle KT，Endocrinology，1942，31，419)并被用于缀合激素设计，即用于多肽与甾体通过共价键连接的激素的设计(王超、彭师奇、张贤莆、邱学才，甾体一多肽缀合激素的合成及免疫抑制活性，1998，33，111；朱岩、邱学才、王超、彭师奇，氢化可的松可加强京都酚及类似物的针痛效应，药学学报，1993，28，166)。

发明内容

根据本发明的一个方面，用逐步接肽法合成了通式(I)的保护五肽和通式(II)的五肽：

         BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheAA    (I)

      TyrGlyGlyPheAA                  (II)

在式(I)和(II)中，AA为LeuOH，LeuOCH₃，LeuNH₂，MetOH，MetOCH₃，MetNH₂，GlyOH，GlyOCH₃及GlyNH₂。

根据本发明的第二个方面，提供了通式(III)的雌二醇-17-β-O-AA-Phe-Gly-Gly-Tyr的缀合物，其中AA为LeuOH，LeuOCH₃，LeuNH₂，MetOH，MetOCH₃，MetNH₂，GlyOH，GlyOCH₃及GlyNH₂。

根据本发明的第三个方面，提供了上述通式(III)的缀合物的合成方法，包括将逐步接肽得到的通式(II)保护中间体的羧端游离，偶联到雌二醇的17-β-羟基上，用HF或氢解法脱保护。

根据本发明的第四个方面，提供了通式(IV)的雌二醇-17-β-O-丁二酰基-Tyr-Gly-Gly-Phe-AA的缀合物，其中AA为LeuOH，LeuOCH₃，LeuNH₂，MetOH，MetOCH₃，MetNH₂，GlyOH，GlyOCH₃及GlyNH₂。

根据本发明的第五个方面，提供了通式(IV)的缀合物的合成方法，包括将逐步接肽得到的保护中间体的N端脱保护制备N端游离的保护寡肽中间体，将雌二醇的17-β-羟基与丁二酸酐反应制备丁二酸单酯中间体，将两种中间体偶联，必要时寡肽部分的羧端皂化，最后用HF或氢化法脱保护。

根据本发明的第六个方面，提供了通式(V)的雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr-Gly-Gly-Phe-AA的缀合物，其中AA为LeuOH，LeuOCH₃，LeuNH₂，MetOH，MetOCH₃，MetNH₂，GlyOH，GlyOCH₃及GlyNH₂。

根据本发明的第七个方面，提供了通式(V)缀合物的合成方法，包括按逐步接肽法制备的保护寡肽中间体N端脱保护制备N端游离的保护寡肽中间体，将雌酮与溴乙酸乙酯反应制备雌酮-3-氧甲基羧酸中间体，将两种中间体偶联，必要时寡肽部分的羧端皂化，最后用HF或氢化法脱保护。

根据本发明的第八个方面，提供了通式(VI)的17-β-雌二醇-3-氧亚甲羰基-Tyr-Gly-Gly-Phe-AA缀合物，其中AA为LeuOH，LeuOCH₃，LeuNH₂，MetOH，MetOCH₃，MetNH₂，GlyOH，GlyOCH₃及GlyNH₂。

根据本发明的第九个方面，提供了通式(VI)的缀合物的合成方法，包括按照本发明第七个方面的操作制备雌酮—保护寡肽中间体，必要时寡肽部分的羧端皂化，用硼氢化钠将酮基还原，最后用HF或氢化法脱保护。

需要说明的是，在说明书中，Boc代表叔丁氧羰基，Bzl代表苄基，Phe代表苯丙氨酸，Gly代表甘氨酸，Tyr代表酪氨酸，Leu代表亮氨酸，Met代表蛋氨酸，Me代表甲基，Bu代表丁基，Et代表乙基，DCC代表N，N-二环己基碳二亚胺。

以下是本发明的生长激素释放肽的合成路线：BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheOH+AA→BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheAA或HF其中AA如上所定义。通式(III)的缀合物的合成路线如下：

通式(IV)的缀合物的合成路线为：

本发明通式(V)和(VI)的合成路线如下：

在上述合成路线图中，其中AA如上所定义。

本发明的通式(I)-(VI)的化合物能够形成药学可接受的盐，例如与各种酸，如盐酸和酸性氨基酸，或各种碱，如氢氧化钠和碱性氨基酸形成盐。

本发明通式(1)-(VI)的化合物还能够以药用组合物的形式使用，该组合物另外含有药学可接受的载体以及其它成分，如着色剂、甜味剂等。载体可以是通常用于制药领域的那些。本发明化合物在组合物中的含量例如可以是0.001-10wt％。本发明的化合物可以制成固体制剂，如片剂、胶囊、颗粒制剂等，还可制成液体制剂，如口服液等，也可制成注射剂。

本发明使用已过性成熟期体重为20g左右的雄性昆明种小鼠建立骨质疏松模型，评价了本发明的化合物对骨质疏松的预防和治疗作用，结果表明本发明的化合物可明显预防和治疗小鼠骨质疏松症。为了解释本发明，下面给出一系列实施例。这些实例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1 HCl·MetOCH₃的制备

在冰盐浴冷却和搅拌下往20ml甲醇中滴加1.17ml(20.1mmol)氯化亚砜，同时产生大量氯化氢气体。往所得的溶液分次加入1.00g(6.7mmol)Met。反应混合物在冰盐浴下搅拌1小时，然后升温至室温。搅拌60小时后TLC显示原料点消失，减压浓缩除去甲醇，残留物反复用无水乙醚研磨，得到标题化合物1.23g(85％)，为无色固体，mp128～131℃。

实施例2 MetNH₂的制备

1.00g(5.02mmol)HCl·MetOCH₃先用2ml甲醇溶解，然后与15mlNH₃/CH₃OH饱和溶液混合。反应混合物于室温下密闭搅拌30天，期间经常补加NH₃/CH₃OH饱和溶液。TLC显示原料点消失，减压浓缩，残留物用无水乙醚研磨，得到标题化合物0.71g(95.5％)，为无色固体，mp141～146℃。

实施例3 HCl·LeuOCH₃的制备

1.00g(7.69mmol)Leu用20ml氯化氢/甲醇(6mol/L)溶解，得到的溶液室温搅拌72小时，TLC显示原料点消失。反应混合物减压浓缩，残留物用无水乙醚反复研磨，得到标题化合物1.25g(90％)，为无色固体，mp127～128℃。

实施例4 LeuNH₂的制备

按照实施例2的操作，由1.00g(6.90mmol)LeuOCH₃，制得0.76g(85％)标题化合物，为无色固体，mp118～122℃。

实施例5 HCl·GlyOCH₃的制备

按照实施例3的操作，由1.00g(13.33mmol)Gly制得1.09g(93％)标题化合物，为无色固体，mp148～151℃。

实施例6 GlyNH₂的制备

按照实施例2的操作，由1.00g(11.24mmol)GlyOCH₃制得0.67g(81％)标题化合物，为无色固体，mp72～75℃。

实施例7 HCl·PheOCH₃的制备

按照实施例3的操作，由1.00g(6.06mmol)Phe制得1.03g(95％)标题化合物，为无色固体，mp130～134℃。

实施例8 BocGlyPheOMe的制备

35.0mg(0.20mmol)BocGlyOH与27.0mg(0.20mmol)HOBt用2ml无水四氢呋喃于冰浴下溶解。往溶液中加49.4mg(0.24mmol)DCC，冰浴下搅拌30分钟后，加入43.0mg(0.20mmol)PheOCH₃，并用N-甲基吗啉调pH至8。反应混合物室温搅拌12小时，TLC显示原料点消失。反应混合物滤除DCU，滤液减压浓缩至干，残留物依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗、饱和氯化钠水溶液洗、5％硫酸氢钾水溶液洗、饱和氯化钠水溶液洗、饱和碳酸氢钠水溶液洗以及饱和氯化钠水溶液洗，分出的有机层用无水Na₂SO₄干燥、过滤，滤液减压浓缩至干(这些操作统称常规后处理)。得到65.9mg(98％)标题化合物，为黄色油状物。

实施例9 HCl·GlyPheOCH₃的制备

67.2mg(0.20mmol)BocGlyPheOCH₃与5ml氯化氢/乙酸乙酯溶液(4mol/L)混合后于室温搅拌40分钟，TLC显示原料点消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物加入无水乙醚，混合均匀后再减压浓缩至干。该操作反复数次，除尽游离的氯化氢。残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，为无色固体，按理论收率计算用于下步反应。

实施例10 BocGlyGlyPheOCH₃的制备

35.0mg(0.20mmol)BocGly和27.0mg(0.20mmol)HOBt用2ml无水四氢呋喃溶解。冰浴下往溶液中加49.4mg(0.24mmol)DCC，反应混合物搅拌30分钟，待用。将实施例9制得的HCl·GlyPheOCH₃用5ml无水四氢呋喃溶解，得到的溶液加到冰浴搅拌的反应混合物中，用N-甲基吗啉调pH至8。反应混合物室温搅拌12小时，TLC显示原料点消失。按常规后处理，得到的油状物用石油醚研磨，得67.4mg(85.8％)标题化合物，为无色固体，mp113～115℃。

实施例11 HCl·GlyGlyPheOCH₃的制备

按实施例9的操作，由78.6mg(0.20mmol)BocGlyGlyPheOCH₃与氯化氢/乙酸乙酯溶液反应3小时，制得标题化合物，按理论收率计算用于下步反应。

实施例12 BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheOCH₃的制备

按实施例10的操作，由88.1mg(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)和实施例11的产物反应，制得109.8mg(76.9％)标题化合物，为无色固体，mp127～130℃，[α]²⁰_D＝+22°(C＝1，CHCI₃/MeOH，15∶1)。

实施例13 BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheOH的制备

142.8mg(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheOCH₃用15ml甲醇溶解后，冰浴下往里滴加3mlNaOH水溶液(2mol/L)。反应混合物于0℃搅拌5小时，TLC显示原料点消失。反应混合物用稀盐酸(2mol/L)调pH值至7，减压浓缩除去甲醇，残留物于冰浴下用稀盐酸(2mol/L)调pH到至1.0。抽滤，收集的固体用水洗，得122.8mg(87.75)标题化合物，为无色固体，mp136～138℃，[α]²⁰_D＝+20°(C＝0.4，CHCl₃/MeOH，15∶1)。FAB-MS(M/e)，723[M+Na]⁺，700[M-BOC]⁺。

实施例14 BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheGlyOCH₃的制备

按实施例10的操作，由140mg(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)Gly Gly Phe OH，27.0mg(0.20mmol)HOBt，15ml无水四氢呋喃，49.4mg(0.24mmol)DCC，25.0mg(0.20mmol)HCl.GlyOCH₃，制得78.5mg(50.9％)标题化合物，mp124～126℃，[α]_D²⁰＝+0.83°(C＝2.4，CHCl₃/MeOH，15∶1)。FAB-MS(m/e)：772[M+H]⁺，672[M-BOC]⁺。

实施例15 BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheGlyOH的制备

按照实施例13的操作，由154.2mg(0.20mmol) BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGly-Phe Gly OCH₃，10ml甲醇和4ml NaOH水溶液(2mol/L)制得138.7mg(91.6％)标题化合物，mp136～140℃，[α]²⁰_D＝+1.5°(C＝1.3，CHCl₃/MeOH，15∶1)。TOF-MS(m/e)：780[M+Na]⁺，796[M+K]⁺。

实施例16 TyrGlyGlyPheGlyOH的制备

151.4mg(0.20mmol)Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheGlyOH用8ml甲酸/甲醇(4.4％)溶液溶解，加8mgPd/C(10％)，室温氢解24小时，TLC显示原料点消失。反应混合物过滤。滤液减压浓缩残留物用乙酸乙酯反复洗涤，得到侧链脱保护C端甲酯化的产物，TyrGlyGlyPheGlyOCH₃为黄色固体，TOF-MS(m/e)：513[M+H]⁺，535[M+Na]⁺，551[M+K]⁺。该化合物按实施例13的操作进行皂化，得到90.8mg(91.0％)标题化合物，为无色固体，mp170～174℃，[α]²⁰_D＝+10°(C＝0.4，H₂O)。TOF-MS(m/e)：522[M+Na]⁺，

实施例17 Boc-Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheGlyNH₂的制备

按实施例10的操作，由140mg(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheOH，27.0mg(0.20mmol)HOBt，10ml无水四氢呋喃，49.4mg(0.24mmol)DCC和14.8mg(0.20mmol)GlyNH₂室温反应24小时，用柱层析分离，得47.6mg(31.5％)标题化合物，为无色固体，mp149～152℃；[α]²⁰_D＝-12°(C＝0.5，CHCl₃/CH₃OH，15∶1)。FAB-MS(m/e)：757[M+H]⁺。

实施例18 TyrGlyGlyPheGlyNH₂的制备

按实施例16中氢解的操作，由151.2(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheGlyNH₂制得94.4mg(94.6％)标题化合物，为无色固体，mp128～130℃；[α]²⁰_D＝+60°(C＝3.0，H₂O)。TOF-MS(m/e)：499[M+H]⁺，521[M+Na]⁺，537[M+K]⁺。

实施例19 BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuOCH₃的制备

按照实施例10的操作，由140.0mg(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheOH，27.0mg(0.20mmol)HOBt，10ml无水四氢呋喃，49.4mg(0.24mmol)DCC和36.2mg(0.20mmol)HCl.LeuOCH₃室温反应16小时，得121.0mg(73.2％)标题化合物，为无色固体，mp126～128℃；[α]²⁰_D＝+1.67°(C＝1.2，CHCl₃/CH₃OH)，15∶1)；TOF-MS(m/e)：828[M+H]⁺。

实施例20 BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuOH的制备

按照实施例13的操作，由165.4mg(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuOCH₃与3mlNaOH水溶液(2mol/L)0℃反应1.5小时，得到143.6mg(88.3％)标题化合物，120～123℃；[α]²⁰_D＝-3.3°(C＝1.2，CHCl₃/CH₃OH)，15∶1)；FAB-MS(m/e)：835[M+Na]⁺。

实施例21 TyrGlyGlyPheLeuOH的制备

步骤1：(a)162.6mg(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuOH，先用15ml甲醇溶解，再与8mgPd/C(5％)混合，反应混合物于室温下氢解24小时，过滤，滤液减压浓缩，残留物反复用乙酸乙酯洗，得到35.4mg(27.0％)N端BOC保护的标题化合物，为无色固体，mp120～123℃；[α]²⁰_D＝-3.3°(C＝1.2，CHCl₃/CH₃OH)，15∶1)；FAB-MS(m/e)：692[M+K]⁺。

(b)131.0mg(0.20mmol)(a)步骤制得的产物用5ml氯化氢/乙酸乙酯(4mol/L)溶解，室温搅拌1小时，TLC显示原料点消失。反应混合物减压浓缩，残留物用无水乙醚研磨得到127.1mg(95％)标题化合物，为无色固体，mp130～133℃；[α]²⁰_D＝+5.0°(C＝0.4，H₂O)；TOF-MS(m/e)：556[M+H]⁺。

步骤2：按照实施例16的操作，由162.6mg(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuOH制得103mg(90％)标题化合物，mp131～133℃；[α]²⁰_D＝+5.1°(C＝0.4，H₂O)；TOF-MS(m/e)：556[M+H]⁺。

实施例22 BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuNH₂的制备

140.0mg(0.20mmol)Boc-Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheOH和27mg(0.20mmol)HOBt用适量无水四氢呋喃溶解，在冰浴下加入49.4mg(0.24mmol)DCC，同时搅拌。30分钟之后加入26.0mg(0.20mmol)LeuNH₂，并用N-甲基吗啉调pH至8.0，室温搅拌15小时，TLC显示原料点消失。反应混合物按常规后处理，得91.3mg(56.2％)标题化合物，mp138～142℃；[α]²⁰_D＝-16.4°(C＝1.1，CHCl₃/CH₃OH)，15∶1)；TOF-MS(m/e)：836[M+Na]⁺，852[M+K]⁺。

实施例23 BocTyrGlyGlyPheLeuNH₂的制备

163.0mg(0.20mmol)BocTYr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuNH₂用15ml甲醇溶解后与8mg钯-碳(5％)混合，室温下氢解24小时。反应混合物过滤，滤液减压浓缩，残留物用乙酸乙酯反复洗涤，回收未反应的原料，得26.7mg(20％)标题化合物，mp157～159℃；[α]²⁰_D＝+5.0°(C＝0.4，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；FAB-MS(m/e)：655[M+H]⁺，693[M+K]⁺。

实施例24 TyrGlyGlyPheLeuNH₂的制备

132mg(0.20mmol)BocTyrGlyGlyPheLeuNH₂用5ml氯化氢/乙酸乙酯(4mol/L)溶解，室温搅拌1小时，有大量沉淀生成，TLC显示原料点消失，室温减压浓缩至干，得到黄色粉末用蒸馏水溶解，过滤，滤液冷冻干燥，得到55.3mg(50％)标题化合物，为白色固体，mp123～126℃；[α]²⁰_D＝+12°(C＝1，H₂O)；TOF-MS(m/e)：592[M+K]⁺。

实施例25 BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheMetOMe的制备

按实施例22的操作，用39.8mg(0.20mmol)HCl·MetOMe代替Leu-NH₂，得到103.6mg(61.3％)标题化合物，mp123～125℃；[α]²⁰_D＝-2.9°(C＝1.4，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)：FAB-MS(m/e)：868[M+Na]⁺，884[M+K]⁺。

实施例26 BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheMetOH的制备

169.0mg(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheMetOMe溶于15ml甲醇，往该溶液中滴加3mlNaOH溶液(2mol/L)，0℃搅拌90分钟，TLC显示原料点消失。反应混合物用2mol/L盐酸中和(pH＝7)，减压浓缩，除去甲醇后再用2mol/L盐酸酸化至PH＝1，过滤收集生成的白色沉淀，得到143.1mg(86.1％)标题化合物，mp138-141℃，[α]²⁰_D＝+2.5°(C＝0.8，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：854[M+Na]⁺，870[M+K]⁺。

实施例27 TyrGlyGlyPheMetOH的制备

166.2mg(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheMetOH与1ml苯甲醚及1ml二甲硫醚混合之后在HF反应装置中与5ml液态HF于0℃处理1小时，减压除去HF之后，固体用水溶解，用Sephadex G10柱分离，5％乙酸洗脱，洗脱冷冻干燥，得到33.2mg(29％)标题化合物，mp174～177℃；TOF-MS(m/e)：575[M+H]⁺。

实施例28 BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheMetNH₂的制备

按照例25的操作，用29.6mg(0.20mmol)MetNH₂代替MetOCH₃，得到59.9mg(36.1％)标题化合物，mp142～145℃；[α]²⁰_D＝-2.5°(C＝0.8，CHCl₃:CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：855[M+Na]⁺，871[M+K]⁺。

实施例29 TyrGlyGlyPheMetNH₂的制备

按照实施例27的操作，由166.4mg(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheMetNH₂制得57.2mg(50.3％)标题化合物，mp142～145℃；[α]²⁰_D＝+14.3°(C＝0.35，H₂O)；TOF-MS(m/e)：573[M+H]⁺。

实施例30 3-O-亚甲羰氧乙基雌酮的制备

0.15ml(0.30mmol)乙醇钠的乙醇溶液，54.1mg(0.20mmol)雌酮及10ml无水四氢呋喃混合之后逐渐升温并搅拌，加入0.081ml(0.59mmol)溴代乙酸乙酯后反应混合物回流，并不断补加溴代乙酸乙酯，回流30小时，TLC显示原料点基本消失。减压浓缩除去溶剂，残留物用氯仿/甲醇溶解，过滤，滤液用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用柱层析纯化(氯仿洗脱)，得到59.2mg(83％)标题化合物，mp83～85℃。

实施例31 3-O-亚甲羧基雌酮的制备

往71.3mg(0.20mmol)3-O-乙氧羰甲基雌酮与8ml甲醇的溶液中滴加2mlNaOH溶液(2mol/L)，反应混合物变浑浊，自然升温至室温，搅拌1小时后TLC显示原料点消失。反应混合物用2mol/L盐酸中和至pH＝7。减压浓缩，去除甲醇后，再用2mol/L盐酸酸化至pH＝1。过滤收集白色固体，水洗，干燥，得61.7mg(93.9％)标题化合物，mp201～203℃。

实施例32 HCl·Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuNH₂的制备

162.4mg(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuNH₂溶于5ml无水氯化氢/乙酸乙酯(4mol/L)溶液，室温搅拌1小时，TLC显示原料点消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用无水乙醚研磨，得到标题化合物。

实施例33 雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuNH₂的制备

65.7mg(0.20mmol)3-O-亚甲羧基雌酮，27.0mg(0.20mmol)HOBt，以及5ml无水四氢呋喃配成的溶液冷至0℃，加入49.4mg(0.24mmol)DCC，搅拌30分钟。往里加入实施例30中制得的HCl·Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuNH₂与5ml无水四氢呋喃的溶液，用N-甲基吗啉调pH至8。反应混合物室温搅拌36小时，TLC显示原料点消失。反应混合物按常规处理，得到173.4mg(85.0％)标题化合物，为白色固体。mp136～139℃；[α]²⁰_D＝+38°(C＝1，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：1046[M+Na]⁺，1062[M+K]⁺。

实施例34 雌酮-3-氧亚甲羰基-TyrGlyGlyPheLeuNH₂的制备

204.5mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuNH₂用10ml4.4％甲酸-甲醇溶液溶解后加入10mg10％钯碳。反应混合物通氢气氢解24小时，过滤，滤液减压浓缩，残留物用制备TLC分离(CHCl₃∶CH₃OH∶HAc，15∶1∶0.4展开)，得到51mg(29.5％)标题化合物，mp138～141℃，[α]²⁰_D＝+40°(C＝0.2，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：887[M+Na]⁺，903[M+K]⁺。

实施例35 17-β-雌二醇-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuNH₂的制备

204.5mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuNH₂，用30ml氯仿-甲醇(1∶15)溶解，冰浴下往里滴加10ml硼氢化钠水溶液(0.25mol/L)，0℃反应10分钟，室温反应15分钟，TLC显示原料点消失。反应混合物用盐酸水溶液(2mol/L)淬火至不再产生气体，有白色固体沉淀。反应混合物过滤，滤液减压浓缩，残留物用乙酸乙酯萃取。萃取液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物用氯仿-无水乙醚析晶，得到96.2mg(47.0％)标题化合物，mp133～135℃；[α]²⁰_D＝+6.7°(C＝0.3，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：1024[M+Na]⁺。

实施例36 17-β-3-氧亚甲羰基-TyrGlyGlyPheLeuNH₂的制备

按照实施例33的操作，由200mg(0.20mmol)雌二醇-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuNH₂，制得89.0mg(51％)标题化合物，mp128～131℃；[α]²⁰_D＝12.9°(C＝0.46，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：889[M+Na]⁺，905[M+Na]⁺。

实施例37 HCl·Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheLeuOMe的制备

按照实施例24的操作，由165.4mg(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuOMe制得标题化合物。

实施例38 雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheLeuOMe的制备

按照实施例32的操作，用实施例37制得的HCl·Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheLeuOMe代替HCl·Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheLeuNH₂，制得132.4mg(63.8％)标题化合物，mp112～115℃；[α]²⁰_D＝+25°(C＝0.4，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：1039[M+H]⁺，1061[M+Na]⁺，1077[M+K]⁺。

实施例39 雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheLeuOH制备

207.5mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheLeuOMe溶于30ml甲醇，冰浴下滴加3ml氢氧化钠水溶液(2mol/L)，0℃反应2小时，有白色固体析出。反应混合物用盐酸水溶液(2mol/L)中和后减压，浓缩，残留物再用盐酸水溶液(2mol/L)酸化至pH＝1，过滤，收集沉淀，水洗，粗品用柱层析纯化(氯仿∶甲醇洗脱)，得103.8mg(50.7％)标题化合物，mp128～132℃；[α]²⁰_D＝+15°(C＝1.6，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：1025[M+H]⁺，1047[M+Na]⁺，1064[M+K]⁺。

实施例40 雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr-GlyGlyPheLeuOH的制备

按照实施例34的操作，雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheLeuOH代替雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheLeuNH₂，得到51.9mg(30％)标题化合物，mp122～125℃；[α]²⁰_D＝+57.2°(C＝0.22，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：888[M+Na]⁺，904[M+K]⁺。

实施例41 17-β-雌二醇-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheLeuOH的制备

按照实施例34的操作，用雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheLeuOH代替雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheLeuNH₂，得187.5mg(91.6％)标题化合物，mp151～153℃；[α]²⁰_D＝+13.3°(C＝0.75，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：1040[M+H]⁺，1062[M+Na]⁺，1077[M+K]⁺。

实施例42 17-β-雌二醇-3-氧亚甲羰基-TyrGlyGlyPheLeuOH的制备

按照实施例33的操作，用17-β-雌二醇-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuOH代替雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuNH₂，得到50.2mg(29％)标题化合物，mp122～125 ℃：[α]²⁰_D＝+40°(C＝0.15，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：868[M+H]⁺，890[M+Na]⁺，906[M+K]⁺

实施例43 HCl·Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheMetNH₂的制备

按照实施例24的操作，由166.0mg(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheMetNH₂制得标题化合物。

实施例44 雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheMetNH₂的制备

按照实施例32的操作，用HCl·Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheMetNH₂代替HCl·Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheLeuNH₂，得到141.1mg(67.8％)标题化合物，mp150～152℃；[α]²⁰_D＝+48.3°(C＝1.2，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：1064[M+Na]⁺，1080[M+K]⁺。

实施例45 雌酮-3-氧亚甲羰基-TyrGlyGlyPheMetNH₂制备

按照实施例27的操作，由208.1mg(0.20mmol)雌酮-3-氧甲亚羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheMetNH₂，3ml苯甲醚及3ml二甲硫醚，制得34.6mg(19.6％)标题化合物，mp129～132℃；[α]²⁰_D＝+20°(C＝0.3，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：881[M⁺]。

实施例46 17-β-雌二醇-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheMetNH₂的制备

按照实施例34的操作，用雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheMetNH₂代替雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheLeuNH₂，制得156.0mg(74.9％)标题化合物，mp123～126℃；[α]²⁰_D＝+24.0°(C＝0.5；CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：1066[M+Na]⁺，1082[M+K]⁺。

实施例47 17-β-雌二醇-3-氧亚甲羰基-Tyr-GlyGlyPheMetNH₂的制备

按照实施例22的操作，由208.6mg(0.20mmol)17-β-雌-二醇-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheMetNH₂，3ml苯甲醚及3ml二甲硫醚，制得35.4(20.2％)标题化合物，mp108～110℃；TOF-MS(m/e)：923[M+K]⁺。

实施例48 HCl·Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheMetOMe的制备。

按照例24的操作，由169.0mg(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheMetOMe制得标题化合物。

实施例49 雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheMetOMe的制备

按照实施例33的操作，用实施例47制得的HCl·Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheMetOMe代替HCl·Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheNH₂，制得160.6mg(76.0％)标题化合物，mp110～114℃；[α]²⁰_D＝+28.6°(C＝0.3，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：1095[M+K]⁺。

实施例50 雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheMetOH的制备

按照实施例26的操作，由211.1mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheMetOMe制得122.3mg(58.7％)标题化合物，mp128～132℃：[α]²⁰_D＝+40°(C＝0.5，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：1043[M+H]⁺，1065[M+Na]⁺，1082[M+K]⁺。

实施例51 雌酮-3-氧亚甲羰基-TyrGlyGlyPheMetOH的制备

按照实施例27的操作，由208.3mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheMetOH，3ml苯甲醚及3ml二甲硫醚。制得69.4mg(39.3％)标题化合物，mp109～113℃：[α]²⁰_D＝+6.7°(C＝0.5，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1；TOF-MS(m/e)：884[M+H]⁺。

实施例52 17-β-雌二醇-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheMetOH的制备

按照实施例34的操作，用204.5mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheMetOH代替雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuNH₂，制得204.3mg(98％)标题化合物，mp126～128℃；[α]²⁰_D＝+20.0°(C＝0.4，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：1043[M+H]⁺，1065[M+Na]⁺，1081[M+K]⁺。

实施例53 17-β-雌二醇-3-氧亚甲羰基-TyrGlyGlyPheMetOH的制备

按照实施例27的操作，由208.4mg(0.20mmol)17-β-雌二醇-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheMetOH，3ml苯甲醚及3ml二甲硫醚制得44.2mg(25％)标题化合物，mp128～130℃，TOF-MS(m/e)：885[M+H]⁺。

实施例54 HCl·Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheGlyNH₂的制备

按照实施例24的操作，由152.2mg(0.20mmol)Boc-Tyr(Cl₂Bzl)-Gly-GlyPheGlyNH₂制得标题化合物。

实施例55 雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-Gly-GlyPheGlyNH₂的制备

按照实施例33的操作，用实施例54制得的HCl·Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheGlyNH₂代替HCl·Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheLeuNH₂，制得56.6mg(29.3％)标题化合物，mp153～156℃，[α]²⁰_D＝+28.0°(C＝0.1，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：990[M+Na]⁺，1056[M+K]⁺。

实施例56 雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr-Gly-GlyPheGlyNH₂的制备

按照实施例27的操作，由195.4mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheGlyNH₂制得25.9mg(16％)标题化合物，mp157～160℃，[α]²⁰_D＝+40.0°(C＝0.2，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：808[M⁺]，831[M+Na]⁺，847[M+K]⁺。

实施例57 17-β-雌二醇-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-Gly-GlyPheGlyNH₂的制备

按照实施例35的操作，用193.3mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-Gly-GlyPheGlyNH₂代替雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-Gly-GlyPheLeuNH₂，制得34.9mg(18％)标题化合物，mp129～131℃，[α]²⁰_D＝+46.6°(C＝0.2，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：992[M+Na]⁺，1078[M+K]⁺。

实施例58 HCl·Tyr(Cl₂Bzl)-Gly-GlyPheGly-OMe的制备

按照实施例24的操作，由154.2mg(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)-Gly-GlyPheGly-OMe制得标题化合物。

实施例59 雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheGlyOMe的制备

按照实施例32的操作，用实施例58制得的HCl·Tyr(Cl₂Bzl)-Gly-GlyPheGly-OMe代替HCl·Tyr(Cl₂Bzl)-Gly-GlyPheLeuNH₂制得123.5mg(62.9％)标题化合物，mp101～104℃，[α]²⁰_D＝+12.0°(C＝0.5，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：984[M+H]⁺，1006[M+Na]⁺，1022[M+K]⁺。

实施例60 雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheGlyOH的制备

按照实施例26的操作，由193.5mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheGlyOMe制得116.1mg(60％)标题化合物，mp130～133℃，[α]²⁰_D＝+20°(C＝0.3，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)：TOF-MS(m/e)：969[M+H]⁺，991[M+Na]⁺，1007[M+K]⁺。

实施例61 雌酮-3-氧亚甲羰基-TyrGlyGlyPheGlyOMe的制备

按照实施例34的操作，由193.6mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheGlyOMe的制备制得157.4mg(95.4％)标题化合物，mp130～133℃，TOF-MS(m/e)：824[M+H]⁺，847[M+Na]⁺，862[M+K]⁺。

实施例62 雌酮-3-氧亚甲羰基-TyrGlyGlyPheGlyOH的制备

按照实施例26的操作，由164.7mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亚甲羰基-TyrGlyGlyPheGlyOMe制得110.1mg(68.0％)标题化合物，mp164～166℃，[α]²⁰_D＝+35.5°(C＝0.4，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：832[M+Na]⁺，848[M+K]⁺。

实施例63 17-β-雌二醇-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheGlyOH的制备

按照实施例34的操作，由193.5mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheGlyOH制得145.1mg(74.9％)标题化合物，mp110～112℃，[α]²⁰_D＝+24.0°(C＝0.5，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：992[M+Na]⁺，1008[M+K]⁺。

实施例64 17-β-雌二醇-3-氧亚甲羰基-TyrGlyGlyPheGlyOMe的制备

按照实施例34的操作，由193.8mg(0.20mmol)17-β-雌二醇-3-氧亚甲羰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheGlyOMe制得49.5mg(29.9％)标题化合物，mp112～114℃，TOF-MS(m/e)：826[M+H]⁺，848[M+Na]⁺，864[M+K]⁺。

实施例65 17-β-雌二醇-3-氧亚甲羰基-TyrGlyGlyPheGlyOH的制备

按照实施例26的操作，由165.1mg(0.20mmol)17-β-雌二醇-3-氧亚甲羰基-TyrGlyGlyPheGlyOMe制得132.3mg(81.5％)标题化合物，mp140-142℃，[α]²⁰_D＝+15.0°(C＝0.4，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：813[M+H]⁺，835[M+Na]⁺，851[M+K]⁺。

实施例66 雌二醇-17-β-丁二酸单酯

80.1mg(0.8mmol)丁二酸酐，2.54mg(0.02mmol)4-二甲氨基吡啶以及15ml无水二氯甲烷的混合物回流30分钟至完全溶解，往溶液中加入54.5mg(0.2mmol)17-β-雌二醇，再回流30分钟，TLC显示原料点消失，过滤，滤液减压浓缩至干，残留物用柱层析纯化(乙酸乙酯∶石油醚)洗脱，得71.9mg(65.7％)标题化合物，mp148～150℃，¹HNMR(CDCl₃)δ＝12.192(S，1H，COOH)，8.993(S，1H，3-OH)，7.040(d，1H，1-H)，6.500(d，1H，2-H)，6.427(S，1H，4-H)，4.504(t，1H，17-H)，0.657(S，3H，18-CH₃)；TAB-MS(m/e)：372[M⁺]。

实施例67 雌二醇-17-β-O-丁二酰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheLeuNH₂的制备

按照实施例33的操作，由74.5mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-丁二酸单酯与149.7mg(0.20mmol)HCl·Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPhe-LeuNH₂制得129.9(60.9％)标题化合物，mp156～159℃，[α]²⁰_D＝-28°(C＝0.2，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：1068[M+H]⁺，1090[M+Na]⁺，1106[M+K]⁺。

实施例68 雌二醇-17-β-O-丁二酰基-Tyr-GlyGlyPheLeuNH₂的制备

按照实施例34的操作，由213.4mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-丁二酰-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPhe-LeuNH₂制得70.9mg(39.1％)标题化合物，mp130～132℃，[α]²⁰_D＝+16°(C＝0.25，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：932[M+Na]⁺。

实施例69 雌醇-17-β-O-丁二酰基-Tyr(Cl₂Bzl)-GlyGlyPheGlyNH₂的制备

按照实施例33操作，由74.5mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-丁二酸单酯与138.5mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-HCl-Tyr(Cl₂Bzl)-Gly-GlyPheGlyNH₂制得标题化合物，mp120～122℃，[α]²⁰_D＝+34.3°(C＝0.7，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：1033[M+Na]⁺。

实施例70 雌二醇-17-β-O-丁二酰基-TyrGlyGlyPheGlyNH₂的制备

按照实施例34的操作，由202.0mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-O-丁二酰基-Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheGlyNH₂制得20.5mg(12％)标题化合物，mp132～136℃，[α]²⁰_D＝-80°(C＝0.3，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：854[M+H]⁺，877[M+Na]⁺，892[M+K]⁺。

实施例71 雌二醇-17-β-LeuPheGlyGlyTyr(Cl₂Bzl)Boc的制备

162.6mg(0.20mmol)Boc-Tyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheLeuOH，35.8mg((0.13mmol)17-β-雌二醇，18.3mg(0.14mmol)4-二甲氨基吡啶与20ml无水二氯甲烷的溶液于0℃下加入32.7mg(0.16mmol)DCC，室温反应20小时，TLC显示原料点消失。反应混合物按常规处理，得到109.7mg(51.4％)标题化合物，mp138～141℃，[α]²⁰_D＝+11.4°(C＝0.7，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：190[M+Na]⁺。

实施例72 雌二醇-17-β-O-LeuPheGlyGlyTyrBoc的制备

按照实施例34的操作，由212.6mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-LeuPheGlyGlyTyr(Cl₂Bzl)Boc肽酯制得91.0mg(50％)标题化合物，TOF-MS(m/e)：933[M+Na]⁺。

实施例73 雌二醇-17-β-O-LeuPheGlyGlyTyr·HCl的制备

按照实施例24的操作，由182mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-O-LeuPheGlyGlyTyrBoc制得150mg(92％)标题化合物，mp163～165℃，[α]²⁰_D＝+66.7°(C＝0.3，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：810[M+H]⁺，833[M+Na]⁺，848[M+K]⁺。

实施例74 雌二醇-17-β-GlyPheGlyGlyTyr(Cl₂Bzl)Boc肽酯的制备

按照实施例70的操作，由162.6mg(0.20mmol)BocTyr(Cl₂Bzl)GlyGlyPheGlyOH制得63.7mg(31.5％)标题化合物，mp140～142℃，1011[M⁺]。

实施例75 雌二醇-17-β-GlyPheGlyGlyTyr(Cl₂Bzl)Boc肽酯的制备

按照实施例33的操作，由202.2mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-GlyPheGlyGlyTyr(Cl₂Bzl)Boc肽酯制得75.2mg(44.5％)标题化合物，mp120～122℃，[α]²⁰_D＝+23.6°(C＝1.1，CHCl₃∶CH₃OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)：877[M+Na]⁺。

实施例76 雌二醇-17-β-O-GlyPheGlyGlyTyr·HCl的制备

按照实施例24的操作，由170.6mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-O-GlyPheGlyGlyTyr(Cl₂Bzl)Boc肽酯，制得143.5mg(95％)标题化合物，mp98～100℃，TOF-MS(m/e)：778[M+Na]⁺。

实施例77 本发明化合物的抗骨质疏松活性

①实验动物：体重为20±2g已过性成熟期的雄性昆明种小鼠，随机分组，正常对照组饲正常鼠料(含钙1.76％，含磷1.01％)，饮自来水，每天皮下注射空白溶剂(含吐温-801.83‰及苯甲醇9‰的注射用水)0.2ml；其余各组饲低钙鼠料(含钙0.1％，含磷0.4％)，饮去离子水，其中模型对照组每3天肌肉注射一次氢化泼尼松(6.3mg/kg)，给药治疗组除每天皮下注射一次本发明的化合物(18μg/kg)外，每3天肌肉注射一次氢化泼尼松(6.3mg/kg)。

②样本采集：四周后，称体重(表1)，摘除眼球取血，血液静置30分钟后3000转/分离心20分钟，得到血清。小鼠处死后取左侧股骨，用氯仿/甲醇(2∶1)浸泡2次脱脂，每次浸泡3小时。

③股骨干重：脱脂后的股骨置120℃烘箱中烘烤6小时，冷却后称重，结果列入表1。

④股骨灰重：已测干重的股骨置800℃马福炉中煅烧6小时，冷却后称重，结果列入表1。

  表1小鼠体重、股骨干重和股骨灰重

⑤血钙：按邻甲酚酞络合酮法，在721型紫外-可见分光光度计上测定对照管和测定管于570nm处的吸收度，利用钙标准曲线确定钙离子浓度。对照管中含4ml钙显色剂(由OPCP试液，二乙胺试液和甲醇按1.5∶1.5∶1组成)和50ul对照组小鼠的血清，测定管中含4ml钙显色剂和50ul给药组小鼠的血清。结果列入表3。

⑥骨钙：采用与血钙测定相同的方法。对此管中含4ml钙显色剂和50ml超纯水，测定管中含4ml钙显色剂和50p，1骨灰酸解液(灰化的股骨用0.5ml6mol/L盐酸溶解后，用超纯水稀释至5ml，取上0.05ml再用超纯水稀释至1ml即得)。结果列入表2。

⑦骨磷：用721型紫外-可见分光光度计在660nm处测定吸收度，空白管中含0.20ml超纯水，4.80ml亚铁-三氯乙酸试剂和0.63ml钼酸铵试剂，标准管中含0.20ml磷标准液，4.80ml亚铁-三氯乙酸试剂和0.63ml钼酸铵试剂，测定管中含0.20ml骨灰酸解液，48ml亚铁-三氯乙酸试剂和0.63ml钼酸铵试剂。结果列入表2。

 表2  小鼠骨钙和骨磷含量

n＝10，1)与正常对照组比P＜0.05；2)与模型对照组比，P＜0.05；3)与雌二醇及雌酮组比，P＜0.05。本表中的数据说明本发明的化合物大都显示了比雌二醇和雌酮更优秀的抗骨质疏松作用。

表3  小鼠血清钙和血清碱性磷酸酶活性

n＝10，1)与正常对照组比P＜0.05；2)与模型对照组比，P＜0.05；3)与雌二醇及雌酮组比，P＜0.05。本表中的数据说明本发明的化合物大都显示了比雌二醇和雌酮更优秀的抗骨质疏松作用。