测定血斑中血浆铜蓝蛋白浓度的方法及肝豆状核变性病筛选试剂盒和诊断试剂

具体实施方式

为了达到上述目的，本发明提供使用全血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体和全血浆铜蓝蛋白特异性单克隆抗体，利用通过酶联免疫吸附测定法得到的吸光度标准曲线测定血液斑点中全血浆铜蓝蛋白浓度的方法。

更详细的说明，本发明的利用酶联免疫吸附测定法，测定血液斑点中全血浆铜蓝蛋白浓度的方法包括：

制造血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体的步骤，

制造血浆铜蓝蛋白特异性单克隆抗体的步骤，

对上述血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体和血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体与辣根过氧化物酶的步骤，

制造除去血浆铜蓝蛋白的血液，在此血液里添加一定浓度的包含精制血浆铜蓝蛋白溶液，制造标准血液斑点和对照血液斑点的步骤，

利用上述血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体和血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体，根据标准血液斑点和对照血液斑点，通过酶联免疫吸附测定法制作吸光度标准曲线的步骤，和

利用上述标准曲线，从病人的血液斑点中，测定全血浆铜蓝蛋白浓度的步骤。

同时，本发明提供使用全血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体和全血浆铜蓝蛋白特异性单克隆抗体，利用通过解离强化的时间分辨荧光免疫测定法得到的标准浓度曲线测定测定血液斑点中全血浆铜蓝蛋白浓度的方法。

更详细的说明，本发明的利用解离强化的时间分辨荧光免疫测定法，测定血液斑点中全血浆铜蓝蛋白浓度的方法包括：

制造血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体的步骤，

制造血浆铜蓝蛋白特异性单克隆抗体的步骤，

对上述血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体和血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体标记铕的步骤，

制造除去血浆铜蓝蛋白的血液，在此血液里添加一定浓度的包含精制血浆铜蓝蛋白溶液，制造标准血液斑点和对照血液斑点的步骤，

利用上述血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体和血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体，从标准血液斑点和对照血液斑点，通过解离强化的时间分辨荧光免疫测定法制定标准浓度曲线的步骤，和

利用上述标准浓度曲线，从病人的血液斑点中，测定全血浆铜蓝蛋白浓度的步骤。

上述血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体是一种抗原，把包含全血浆铜蓝蛋白的精制的血浆铜蓝蛋白免疫兔子而制造；上述血浆铜蓝蛋白特异性单克隆抗体是一种抗原，把包含全血浆铜蓝蛋白的精制的血浆铜蓝蛋白免疫小鼠，得可以产生抗体的脾脏细胞，把这细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag14以现为广泛认识的融合法融合，在HAT选择培养液中培养，用酶联免疫吸附测定法，选择可产生抗体的杂交瘤细胞的方法而制造。

把从上述杂交瘤分泌的包含单克隆抗体的培养上清液，跟血浆铜蓝蛋白反应，而确认全血浆铜蓝蛋白的中和氧化酶活性的能力，从而筛选产生全血浆铜蓝蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株。

同时，给上述单克隆抗体和多克隆抗体标记辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase)，从而制备酶联免疫吸附测定所需的抗体；给上述单克隆抗体和多克隆抗体标记铕(Europium；Eu³⁺)，从而制备解离强化的时间分辨荧光免疫测定所需的抗体。

利用酶联免疫吸附测定法或解离强化的时间分辨荧光免疫测定法，测定全血浆铜蓝蛋白，而确认Wilson病患者和正常人之间的差别方法包括：制造除去血浆铜蓝蛋白的血液，给上述血液里添加一定浓度的包含全血浆铜蓝蛋白的精制的血浆铜蓝蛋白溶液制造标准血液斑点和对照血液斑点；利用上述标准血液斑点和抗体，以夹心法制备标准曲线；利用上述标准曲线以同样的方法从Wilson病患者和正常人的样品中测定全血浆铜蓝蛋白的浓度的步骤。

以下，通过实施例更详细的说明本发明。尽管下面叙述是通过本发明的优选实施例说明和解释的，但不只局限于下述实施例。

实施例1：血浆铜蓝蛋白特异性多克隆抗体的制造

本实施例使用了包含从Sigma公司购买的全血浆铜蓝蛋白的精制的人体血浆铜蓝蛋白。为了生成特异地针对抗原的多克隆抗体，以1mg/ml的浓度，把溶解在磷酸缓冲液中的精制的血浆铜蓝蛋白溶液400μl，用Freund′s佐剂(BRL公司上市)乳化后，给10周大的兔子以14天为间隔，进行了3次皮内注射。14天后以1mg/ml的浓度，把溶解在磷酸缓冲液中的精制的血浆铜蓝蛋白溶液400μl，注射在耳静脉内，7天后以心胀穿孔法采血。把采集的血液在常温中放30分钟，4℃的温度下放置一个晚上。当完全凝固后，在2,500rpm中离心分离30分钟，取上清液，的血清。采集到的血清里，为了使最终浓度成为40％，添加硫酸铵，沉淀后，在10mM的磷酸缓冲液中透析一个晚上。之后，用DEAEAffi-Gel Blue gel(Bio Rad公司上市)精制抗体。

实施例2：血浆铜蓝蛋白特异性单克隆抗体的制造

本发明使用的单克隆抗体是把1mg/ml的浓度的精制的血浆铜蓝蛋白100μl，用同量的Freund′s佐剂硫化后，，以2周为间隔，3次注射6-8周大的BALB/c小鼠腹腔内。最后注入后，确认抗血浆铜蓝蛋白抗体的生成，2周之后，用1OOμg的血浆铜蓝蛋白进行最后的免疫。3天之后，从小鼠抽出脾脏细胞，与Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞以10∶1的比率混合，把这混合液放置在50％的聚乙二醇1500溶液中3分钟，进行细胞融合。之后把这个在1,200rpm中离心分离8分钟，得细胞沉淀物后，使其在包含10％胎牛血清的HAT RPMI-1640培养液里悬浮，使每ml含3.5×1O⁶的细胞。之后，分注到96-孔板里，每孔0.1ml，在37℃，5％CO₂培养液里培养。3天后，每孔里添加含10％胎牛血清的HAT RPMI-1640培养液O.1ml。用新的培养液，每4天换一半左右的培养液。

HAT选择培养后，以酶联免疫吸附测定法确认杂交瘤细胞的抗体产生与否。即把上述用于免疫的血浆铜蓝蛋白，用0.01M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释后，每孔里放进50μl，在4℃的温度中涂覆一个晚上。之后，用磷酸盐缓冲液PBS(phosphate buffer saline，0.15％Tween 20)，洗涤3次，用1％白蛋白在室温中反应2个小时。把细胞的培养上清液，每孔里放进50μl，在常温中反应2各小时后，用PBST洗涤3次。把偶联有生物素的二级抗体-抗小鼠免疫球蛋白抗体(Biotin conjugated anti-mouse immunoglobulin antibody)，用1％BSA-PBST稀释到1μg/ml。之后，每孔里放进50μl，在37℃的温度中反应1个小时。再用PBST洗涤3次后，把Streptavidin-HorseradishPeroxidase，用1％四甲基联苯胺(Tetra-Methylbenzidine，TMB)溶液稀释1000倍，每孔里放进50μl，在37℃的温度中反应30分钟，之后，再次用PBST洗涤4次。作为进行酶反应的酶底物，每孔里放进50μl TMB溶液，在室温下反应后，用2N-硫酸停止反应，在450nm波长中，用ELISA读数仪测定吸光度。确认抗血浆铜蓝蛋白抗体的生成与否，在显示阳性的孔中得到的细胞，用限制稀释法(limiting dilution)亚克隆3次，培养为每孔0.3的细胞，进行单克隆化，得到了生成抗血浆铜蓝蛋白单克隆抗体的杂交瘤。

实施例3：确认抗体的血浆铜蓝蛋白氧化酶活性的中和

把精制的血浆铜蓝蛋白10μg与在实施例2得到同样体积的杂交瘤的培养上清液混合后，在37℃的温度中反应30分钟，之后，在4℃的温度中用非参数(nonparametric)丙烯酰胺凝胶(7.5％)电泳。电泳后，为了确认血浆铜蓝蛋白氧化酶活性，作为染色溶液，使用了具有1mg/ml浓度的对苯二胺的醋酸纳(0.1M，pH 5.7)缓冲液，在37℃的温度中染色凝胶体(gel)2个小时，在50％乙醇溶液中脱色。(图1)

从图1的结果中可知，精制的血浆铜蓝蛋白因自己的氧化酶活性，氧化无色的对苯二胺，形成紫色的带。相反，在血浆铜蓝蛋白和血浆铜蓝蛋白特异性抗体的混合液中，因抗体中和了血浆铜蓝蛋白的氧化酶活性，没有形成紫色的带。以此可知，在实施例2中制备的单克隆抗体，对具有氧化酶活性的全血浆铜蓝蛋白有特异性。

实施例4：全血浆铜蓝蛋白特异性单克隆抗体的精制

把实施例3中筛选出的、产生全血浆铜蓝蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，接种在有RPMI培养液的T75烧瓶中，在37℃，5％ CO₂培养基中培养7天后，进行离心分离，得到培养上清液，添加硫酸铵使最终浓度为50％，进行沉淀后，在10mM的磷酸缓冲液(pH7.0)透析过夜。之后，用DEAE Affi-Gel Blue凝胶精制了抗体。

实施例5：氧化酶结合抗血浆铜蓝蛋白抗体的制造

把在实施例1和实施例4中精制的抗体5mg，与同量的辣根过氧化物酶，在0.1M的磷酸缓冲液(pH6.8)混合透析一个晚上。添加以0.1M的磷酸缓冲液稀释的最终浓度为1％的甲醛溶液，在常温中慢慢搅拌3个小时，同时，添加2M的甘氨酸，使最终浓度达到0.1M后，在常温中放置2个小时，再用磷酸缓冲液透析1个晚上。之后，在10,000中离心分离而得到的上清液中添加同样体积的甘油，在-20℃储存。

实施例6：铕(Europium)结合抗血浆铜蓝蛋白抗体的制造

把在实施例1和实施例4中精制的抗体1mg，放进0.1M的碳酸钠缓冲液(Na₂CO₃ pH 9.3)里，透析一个晚上，浓缩到最终浓度为4mg/ml。之后，把250μg的抗体与0.2mg的己螯合铕的N¹-(对-异氰酸酯苄基)-二亚乙基三胺-N¹，N²，N³-四乙酸酯，[N¹-(p-isothiocyanate benzyl)-diethylentriamine-N¹，N²，N³-tetraacetate，简称为DTTA]慢慢搅拌后，在4℃的温度中反应一个晚上。之后，用Superdex 200柱(在Amersham公司上市)和TSA缓冲液(50mmol/L，Tris-HCl(pH 7.8)，0.9％ NaCl，0.05％叠氮化钠)过滤凝胶体后，添加白蛋白，使最终浓度成为0.1％，在-20℃储存。

实施例7：制造除去血浆铜蓝蛋白的血液的制造

把血液在3,000rpm中离心分离10分钟后，把上层的血浆部分扔掉。之后，添加磷酸缓冲液搅拌后，用同样的方法分离。反复洗涤10次后，离心分离，扔掉血浆部分，得除去血浆的红血球(RBC：Red Blood Cell)。

实施例8：标准血液斑点的制造

在实施例7中制造的除去血浆铜蓝蛋白的血液里，添加已知浓度的血浆铜蓝蛋白，决定标准的范围。0mg/dl、1mg/dl、5mg/dl、20mg/dl、50mg/dl，这5个为利用在酶联免疫吸附测定法的标准血浆铜蓝蛋白的浓度的范围；0mg/dl、1mg/dl、5mg/dl、10mg/dl、20mg/dl、30mg/dl，这6个为利用在解离强化的时间分辨荧光免疫测定法的标准血浆铜蓝蛋白的浓度的范围。制造标准血液斑点时，在实施例6中制造的血液里，以1∶1的比例添加已知的血浆铜蓝蛋白溶液。最后调整到原来的血细胞比容。因此，各标准浓度曲线时，浓缩2倍，跟实施例7里制造的血液混合，滴到过滤纸上，在常温晾干一个晚上。

实施例9：对照血液斑点的制造

对照血液斑点(control blood spot)的制造，与实施例8同样的方法进行。对照组的血浆铜蓝蛋白的范围为3mg/dl(1.40-4.80)、7mg/dl(5.0-9.0)、15mg/dl(10.5-19.5)三个范畴。跟标准血液斑点的制造方法一样，与血液以1∶1的比例混合，滴到过滤纸上，在常温晾干一个晚上。

实施例10：利用酶联免疫吸附测定法测定血液斑点中血浆铜蓝蛋白浓度

(单克隆抗体-单克隆抗体夹心法)

为了测定血液斑点中的血浆铜蓝蛋白的量，首先把在实施例2和实施例4制备的抗全血浆铜蓝蛋白特异性单克隆抗体用0.05M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释到2μg/ml，放进每孔里100μg，在4℃的温度中涂覆一个晚上。之后，用添加0.05％ Tween 20的磷酸缓冲液洗涤4次，用具有3％白蛋白的磷酸缓冲液，在室温反应5-8个小时。用同样的方法洗涤以后，使用冲头(punch)把血液斑点打孔1.5mm直径，放进各孔里。在这各孔里，放入100μl洗脱液(含1％白蛋白的磷酸盐缓冲液)，使血液斑点浸泡在溶液里，在4℃反应一个晚上。其后，除掉血液斑点，用具有0.05％ Tween 20的磷酸缓冲液洗涤4次以后，把在实施例5制备的与辣根过氧化物酶偶联的二级单克隆抗体用添加0.05％ Tween 20的磷酸缓冲液(含1％白蛋白)稀释到500∶1后，每孔里放入100μl，在室温中反应90分钟。之后，再次用添加0.05％ Tween 20的磷酸缓冲液洗涤6次，作为酶反应的酶底物，每孔里放入100μl TMB溶液，在室温反应后，用1N-盐酸停止反应，在450mm波长，用ELISA读数仪测定吸光度。

实施例11：利用解离强化的时间分辨荧光免疫测定血液斑点中血浆铜蓝蛋白浓度

(单克隆抗体-单克隆抗体夹心法)

为了测定血液斑点中的血浆铜蓝蛋白的量，首先把在实施例2和实施例4制备的抗全血浆铜蓝蛋白特异性单克隆抗体用0.05M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释到2μg/ml，放进每孔里100μg，在4℃的温度中涂覆一个晚上。之后，用添加0.1％ Tween 20和0.9％ NaCl的Tris-HCl缓冲液(50mmol/L Tris-HCl(pH7.8)0.9％ NaCl 0.1％ Tween 20)洗涤4次，用具有3％白蛋白且添加0.1％ Tween 20和0.9％ NaCl的Tris-HCl缓冲液，在室温反应5-8个小时。用同样的方法洗涤以后，使用冲头把血液斑点打孔1.5mm直径，放进各孔里。在这各孔里，放入100μl的为涌出的DELFIA分析缓冲液(Wallac公司上市)溶液，使血液斑点浸泡在溶液里，在4℃反应一个晚上。其后，除掉血液斑点，用添加0.1％ Tween 20和0.9％ NaCl的Tris-HCl缓冲液洗涤4次以后，把在实施例6制备的结合铕的2次单克隆抗体用DELFIA分析缓冲液稀释到250ng/ml后，每孔里放入100μl，在室温中反应90分钟。之后，再次用添加0.1％ Tween 20和0.9％ NaCl的Tris-HCl缓冲液洗涤4次，把DELFIA增强溶液(Wallac公司上市)溶液，每孔里放入200μl，过2分钟后，利用时间分辨荧光分析仪(time-resolved fluorometry)测定铕的拷贝数(copy of Europium)。

实施例12：利用酶联免疫吸附测定法测定血液斑点中血浆铜蓝蛋白浓度

(单克隆抗体-多克隆抗体夹心法)

为了测定血液斑点中的血浆铜蓝蛋白的量，与实施例10同样的方法测定，只是，二级抗体使用在实施例1和实施例5制备的偶联有辣根过氧化物酶的多克隆抗体。

实施例13：利用分离-强化时间分辨荧光免疫测定血液斑点中血浆铜蓝蛋白浓度

(单克隆抗体-多克隆抗体夹心法)

为了测定血液斑点中的血浆铜蓝蛋白的量，与实施例11同样的方法测定，只是，二级抗体使用在实施例1和实施例6制备的结合铕的多克隆抗体。

实施例14：利用酶联免疫吸附测定法测定血液斑点中血浆铜蓝蛋白浓度

(多克隆抗体-多克隆抗体夹心法)

为了测定血液斑点中的血浆铜蓝蛋白的量，与实施例10同样的方法测定，只是，涂覆抗体使用在实施例1和实施例5制备的偶联有辣根过氧化物酶的多克隆抗体。

实施例15：利用分离-强化时间分辨荧光免疫测定血液斑点中血浆铜蓝蛋白浓度

(多克隆抗体-多克隆抗体夹心法)

为了测定血液斑点中的血浆铜蓝蛋白的量，与实施例11同样的方法测定，只是，涂覆抗体使用在实施例1制造的多克隆抗体，二级抗体使用在实施例1和实施例6制备的结合铕的多克隆抗体。

实施例16：利用酶联免疫吸附测定法的正常人与Wilson病患者的血浆铜蓝蛋白的定量分析

采集5名正常人和12名Wilson病患者的血液，制造血液斑点，晾干一天后，按实施例10的方法，利用图2的标准浓度曲线，测定血浆铜蓝蛋白的浓度。

实施例17：利用解离强化的时间分辨荧光免疫测定法的正常人与Wilson病患者的血浆铜蓝蛋白的定量分析

采集5名正常人和12名Wilson病患者的血液，制造血液斑点，晾干一天后，按实施例11的方法，利用图3的标准浓度曲线，测定血浆铜蓝蛋白的浓度。

从图4可以看出，Wilson病患者的血浆铜蓝蛋白的浓度，与正常人比较，测定为明显的低。这结果说明本发明的诊断试液在诊断Wilson病有很高的筛选力。同时，从图4的Wilson病患者12(WD12)可以看出，在全体的Wilson病患者中，也有5％以内的，显示正常血浆铜蓝蛋白数值得情况。这种情况，不仅在这次开发的试剂盒(kit)，而且在以前利用血清的检测法也显示同样的数值。

发明的效果

本发明提供了早期诊断Wilson病的筛选检查试剂盒；提供与现今在使用的检查方法有区别的，用酶联免疫吸附测定法或解离强化的时间分辨荧光免疫测定法，定量分析用血液过滤纸采集的1-7岁幼儿的血液斑点中含铜的全血浆铜蓝蛋白的方法，从而，测定血浆铜蓝蛋白时，不必采集大量血液，用1-2滴血液，就能早期诊断Wilson病。

本发明提供Wilson病诊断试剂及Wilson病诊断用试剂盒，实现了使用全血浆铜蓝蛋白特异性单克隆抗体和多克隆抗体，标准血液斑点及对照血液斑点，利用通过酶联免疫吸附测定法或解离强化的时间分辨荧光免疫测定法得到的标准浓度曲线，测定血液斑点中全血浆铜蓝蛋白的浓度。从而，对样品的采集、搬运、保存提供了方便，而且能一次性的测定多量样品，对以多数认为对象的筛选检查更为有用。

尽管本发明是通过参考本发明的优选实施例说明和解释的，但不只局限于上述实施例，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，通过熟悉本领域的技术人员，可以在形式和细节对其进行各种修改和改变。