分离变性蛋白/包涵体蛋白复性混合液中蛋白聚集体的方法

                              发明领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种分离变性蛋白/包涵体蛋白复性混合液中蛋白聚集体的方法。

                              背景技术

无论在蛋白质实验室研究还是工业生产中，蛋白质的复性技术扮演着重要的角色。人们目前表达的蛋白已有4000多种，其中利用大肠杆菌表达的蛋白要占90％以上，而这些蛋白大多数是以无活性的包涵体形式表达的，必须利用高浓度的变性剂溶解蛋白以后，使目标蛋白复性。特别是对生产有药用价值的蛋白，包涵体表达的蛋白复性效率的高低，决定了药用蛋白产品的成本和应用。

在现有的蛋白复性手段中，传统的稀释复性、透析复性以及最近的层析复性，都不可避免存在蛋白聚集体的形成。由于变性剂中的蛋白分子，以无活性的伸展肽链的形式存在，大量暴露到水环境的疏水残基在变性剂瞬间除去的情况下，容易因为疏水相互作用而聚集，形成含有多个分子的蛋白聚集体；变性蛋白在变性剂除去的过程中，蛋白折叠成中间体，不稳定的中间体结构中一些疏水残基暴露在水中，也会产生聚集体，使一些折叠中间体转向形成聚集体的反应，不能进一步折叠成天然的结构形式。聚集体的形成涉及到至少两个以上分子之间的作用力，属高级反应。蛋白复性缓冲液中蛋白的浓度越大，形成的聚集体就越多，聚集体形成又降低蛋白质复性的效率。所以上述复性方法中需要的蛋白终浓度较低，但是，蛋白终浓度越低，需要的缓冲液的量就越多，需要更大的容器，这样不仅造成生产成本的提高，而且给以后的蛋白处理带来困难。大量的蛋白缓冲液需要增大设备的处理容量，也消耗更多的能量。所以，在蛋白的复性过程中，蛋白的聚集体的形成是不可避免的。

蛋白聚集体存在于蛋白复性的缓冲液中，其聚集体的存在使得一些没有完全折叠的多态链或者中间体与其结合，而形成更大的聚集体；正确折叠复性的蛋白也会因为聚集体的的疏水相互作用力的吸附而丢失蛋白活性，而造成复性收率的降低；特别对于蛋白的层析柱复性工艺中，如果直接收集混合在一起的复性组分，蛋白复性的收率就很低；而对从柱子里流出的组分进行分部收集，便可以大大提高蛋白复性的收率。通过研究发现：从柱子里流出的组分中无活性的成分主要是蛋白聚集体成分，蛋白聚集体成分的存在，降低了活性蛋白的收率。

理论上，在蛋白复性过程中除去变性剂，蛋白应该能自发的折叠复性，有人称蛋白多肽链的序列为遗传的另一种密码。但是，实际情况相当复杂，在蛋白复性过程中除了形成聚集体之外，蛋白折叠过程中也可能形成错误折叠，含有二硫键的蛋白有可能形成分子内或者分子间错配的二硫键；新合成的肽链在细胞内折叠时，分子伴侣、折叠酶、氧化还原环境等细胞内的因素，结合到新合成的肽链或者折叠的中间体上，稳定蛋白的结构，可以大大提高蛋白的折叠效率；并且，一些错误折叠的蛋白结构或者聚集体结构，可以被细胞内识别，并被降解或者纠下；二硫键形成酶可以促进正确二硫键的形成，并促进分子内二硫键的重排，减少或者消除错配二硫键的可能。但是在体外蛋白的复性过程中，没有细胞内的适于蛋白折叠的环境，也缺少辅助蛋白折叠的成分，蛋白折叠过程中，尤其折叠的中间体，很容易形成不同的折叠的终点，所以不可避免的会形成蛋白错误折叠的成分和蛋白的二硫键的错配；通过体内或者体外的研究发现，蛋白在折叠过程中，形成不止一种中间体，有些是错误的中间体，很容易造成聚集体和错误折叠的结构的形成。

另外，蛋白在复性过程中，所存在的多种成分，严重影响复性蛋白的使用。对于蛋白的结构或者其它性质的研究来讲，由于成分结构的不单一，使得一些研究数据不准确，因为这些研究数据是基于溶液中多个蛋白分子数据的平均值获得的。而对于药用蛋白来讲，其影响就更为严重；药用蛋白成分的不均一，聚集体和错误折叠成分的存在，不分离而直接注射入体内，极易引起体内的免疫排斥反应，甚至威胁生命的安全。所以，对复性后的蛋白的组分必须进行分离，以获得单一的组分。并且，对于聚集体或者错误折叠的组分能回收的话，利用高浓度的变性剂重新溶解聚集体，解开错误折叠的成分，加入DTT等其他还原试剂解开错误的二硫键，再经过复性，可以提高蛋白复性的收率，降低产品的成本，尤其对于较难表达或者表达稀少的昂贵蛋白成分，分离后进行再一步的变性复性处理是必要的。

在蛋白复性缓冲液中加入变性剂，多被用来溶解包涵体蛋白，提高蛋白在溶液中的稳定性(CN 1122339A，CN 118178A)；多聚物分子，经常在复性过程或者分离蛋白的过程中使用，以提高活性蛋白在水相缓冲液中的稳定性(JP平4-237496，JP昭56-34784，JP平9-227600)。但是，没有使用低浓度的添加物来分离复性后的各个成分的例子，虽然复性过程中错误折叠和聚集体的存在是公认的事实。为了克服复性后的蛋白使用中的这些缺点，发展了这种分离的方法。

在蛋白复性的文献中，虽然聚集体的形成是一个公认的复性中的难点也是复性研究中的热点，但是很少有对复性后的蛋白进行分离的报道。原因在于复性后蛋白的成分相当复杂，并且各种结构的蛋白分子之间和蛋白分子同分离的介质之间有各种作用力，彼此之间的作用力使得各种成分的分离相当困难。利用一般的凝胶过滤层析或者离子交换层析等分离手段，不能把各个成分有效地分开：在普通的凝胶过滤层析谱图上仅显示一个宽的峰。

                              发明内容

本发明的目的在于：提供一种有效的，适于实验室和工业中应用的分离变性蛋白/包涵体蛋白复性混合液中蛋白聚集体的方法。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的分离变性蛋白/包涵体蛋白复性混合液中蛋白聚集体的方法，其特征在于，首先用含有1-3mol/L变性剂和0.1-0.5mol/L盐离子的凝胶过滤层析缓冲液平衡凝胶过滤层析柱，再将变性蛋白/包涵体蛋白复性混合液进凝胶过滤层析柱，用该含有变性剂和盐离子的凝胶过滤层析缓冲液对其进行洗脱，便分离出变性蛋白/包涵体蛋白复性混合液中的蛋白聚集体；所述的变性剂为脲、盐酸胍、Triton或SDS；所述的盐离子来自含有Na⁺、K⁺或NH₄⁺离子的盐酸盐、醋酸盐、碳酸盐、磷酸盐或硫酸盐。

本发明通过改变缓冲液中变性剂和盐离子的浓度，对复性蛋白混合液中的各组分进行分离，可以改变聚集体和未折叠组分的含量，以收集不同要求的组分；通过改变缓冲液中变性剂的浓度，可以观察到聚集体逐步的降低，而错误折叠的成分逐步的增加，说明聚集体主要是疏水相互作用而不是分子间的二硫键形成的。

本发明通过对凝胶过滤缓冲液成分的调节，成功的分离复性蛋白溶液中的聚集体及其它成分，为获得单一的、活性蛋白的组分提供了可靠手段，并通过调节各个成分的含量，提供了分析组分形成和改变组分的有效方法。

                              附图说明

附图1为变性天然鸡卵白溶菌酶复性后的分离图谱；

附图2为不同脲浓度对分离复性后天然鸡卵白溶菌酶的影响图谱；

附图3为不同盐离子浓度对分离复性后天然鸡卵白溶菌酶的影响图谱。

                             实施方式

实施例1：分离变性天然鸡卵白溶菌酶蛋白复性混合液中的蛋白聚集体，以制得单一成分的天然鸡卵白溶菌酶蛋白，其步骤如下：

1.收集复性后的天然鸡卵白溶菌酶蛋白混合液，混合液中含有正确折叠复性的蛋白，尚未折叠或者错误折叠错的蛋白、以及蛋白聚集体等多种成分；

2.分离出复性后的天然鸡卵白溶菌酶蛋白混合液中的蛋白聚集提体

1)在0.1mol/L Tris-HCl，pH8.7的凝胶过滤层析缓冲液中加入0.15mol/L的NaCl和2mol/L的脲，制备一种含有0.15mol/L的NaCl和2mol/L的脲的凝胶过滤层析缓冲液；并用该缓冲液平衡Superdex 75(10/30)凝胶过滤层析柱；

2)将收集的复性后的天然鸡卵白溶菌酶蛋白混合液进柱，并用上述加入了NaCl和脲的凝胶过滤层析缓冲液对其进行流速为0.4mL/min的洗脱，便可分离出其中的蛋白聚集体，从而得到单一成分的天然鸡卵白溶菌酶蛋白。

附图1是本实施例典型的分离图谱，经过分析，可以确定其中的峰1是蛋白聚集体的吸收峰，峰2是完全复性的活性天然鸡卵白溶菌酶蛋白的吸收峰，比活为52000U/mg，峰3是尚未折叠或者错误折叠的蛋白组分的吸收峰。

实施例2：用含有变性剂和盐离子的缓冲液洗脱复性后天然鸡卵白溶菌酶蛋白，并以不含变性剂和盐离子的缓冲液作为对照，研究复性蛋白组分的形成情况：

所使用的凝胶过滤层析柱为Superdex 75预装柱，洗脱流速为0.4mL/min，附图2中的曲线1为：使用不含变性剂和盐离子的凝胶过滤层析缓冲液洗脱复性后的天然鸡卵白溶菌酶蛋白时，发现仅仅有一个洗脱峰(后面的峰为离子后峰)，并且出峰时间比较晚，提示三个峰的成分之间以及与层析柱发生了吸附作用；

当所使用的凝胶过滤层析缓冲液中含有低浓度的NaC，在改变其缓冲液中的脲浓度时，发现蛋白聚集体的峰逐渐降低，峰3组分逐渐增加，表示蛋白聚集体大部分由于疏水相互作用形成；而正确折叠的蛋白组分没有改变；但是加入脲和还原剂后，所有组分成单峰，出峰时间提前，说明峰3的未折叠或者错误折叠的组分已经形成了二硫键并且分子表观体积比较小，附图2显示了整个过程；

当所使用的凝胶过滤层析缓冲液中脲浓度为3mol/L，在改变其缓冲液中NaCl的浓度时，发现折叠的组分与未折叠组分逐渐分离，一直到没有变化，附图3显示了这个过程；

从该实施例可以看出，本发明不仅提供了有效的分离不同复性成分的方法，而且提供了研究不同成分的手段。

实施例3，使用含有1.5mol/L盐酸胍和0.1mol/L碳酸钾(或0.1mol/L的醋酸钾)的Tris-HCl缓冲液洗脱人溶菌酶包涵体复性后混合液中的蛋白聚集体，制得单一成分的天然鸡卵白溶菌酶蛋白，可得到同实施例1类似的分离效果。

实施例4，使用含有1mol/L盐酸胍、0.1％Triton X-100(0.015mol/L)和0.1mol/L的(NH₄)₂SO₄(或NH₄Cl)的缓冲液洗脱变性天然鸡卵白溶菌酶蛋白复性混合液中的蛋白聚集体，制得单一成分的天然鸡卵白溶菌酶蛋白，可得到同实施例1类似的分离效果。

实施例5，使用含有1mol/L脲、0.1％SDS(0.01mol/L)和0.1mol/L的K₂HPO₄的缓冲液洗脱变性天然鸡卵白溶菌酶蛋白复性混合液中的蛋白聚集体，制得单一成分的天然鸡卵白溶菌酶蛋白，可得到同实施例1类似的分离效果。