人白细胞介素－17受体样分子融合蛋白及其编码基因与表达细胞系

具体实施方式

实施例1、稳定分泌人白细胞介素-17受体样蛋白与可溶性Fc受体融合蛋白细胞系的建立

1、转染前一天，传代293T细胞至60mm培养皿(1X105)，使细胞在转染时达到40-80％的细胞汇合率(conflucence)；

2、在转染时，稀释5μg Fc融合蛋白表达质粒DNA于装有无血清和抗生素的细胞培养基的转染管。瞬时离心几秒钟。添加20μlSuperfection转染试剂于DNA溶液，瞬时离心10秒钟；

3、室温(15-25℃)孵育样品5-10分钟，允许转染复合体的形成；

4、在转染复合体形成时，轻柔吸弃培养盘中的培养基，PBS洗涤；

5、添加1000μl细胞生长培养基(含血清和抗生素)于转染复合体，轻柔混匀两次后，小心转移至培养盘中的细胞表面；

6、在正常细胞培养条件下，孵育转染复合体和细胞2-3小时；

7、吸取培养基(含转染复合体)，PBS洗涤一次，添加4ml新鲜的细胞生长培养基，培养36-48小时；

8、1∶10或1∶15传代细胞于含有1.2mg/ml G418的选择性培养基的6孔培养盘。每隔3天后，更新选择性培养基，直至15天左右，出现细胞克隆为止。(增强绿色荧光蛋白表达质粒作为转染对照，检测转染效率)；

9、扩大培养单克隆细胞至适宜密度。采用Northern blot(也可以用RT-PCR或Western blot)鉴定阳性克隆X931；

实施例2、采用HiTrap FF亲和层析柱，纯化培养细胞上清中的人白细胞介素-17受体样蛋白与可溶性Fc受体融合蛋白，根据紫外分光光度计初步测定的蛋白浓度，制作洗脱曲线，纯化出融合蛋白。采用BCA法蛋白定量，结果表明：每100ml转染细胞培养上清中约含100-150μg的Fc-受体融合蛋白。具体做法是：

1、添加100μl 1M Tris-HCl(pH9.0)收集液于1ml的收集管。装填HiTrapFF亲和层析柱。用至少5倍体积的去离子水或结合缓冲液洗柱；

2、采用5倍体积的流出缓冲液再生柱。采用5-10倍柱床体积的结合缓冲液平衡柱；

3、缓慢添加样品于亲和层析柱的中央，连接10ml的一次性注射器，打开流出阀，缓慢挤压使其流速约为1ml/min；

4、使用5-10倍柱床体积的结合缓冲液洗柱，直到流出液无蛋白为止；

5、采用2-5倍体积的流出缓冲液洗柱，小心收集最初的流出液。紫外分光光度计初步检测流出液的蛋白浓度；

6、填充5倍体积的20％的乙醇于层析柱，预防微生物的生长。密封层析柱的流出口。于4℃贮存；

7、采用BCA法(pierce)定量融合蛋白的浓度；

8、10％SDS-PAGE电泳，检测分离的融合蛋白的纯度。

实施例3、采用RT-PCR方法对细胞系X931分泌蛋白进行鉴定分别使用受体胞外区编码序列的正义引物：5’……ATAAAGCTTATGGAATCTCAACCTTTCCTG…..3’和人IgG1.Fc编码序列的反义引物：5’…AATTCTAGATCATTTACCCGGAGACAGGG…..3’，以野生型293T细胞为对照，采用RT-PCR方法对细胞系分泌蛋白进行鉴定，结果表明，细胞系X931含有Fc-受体融合蛋白的序列。

实施例4、采用Western blot对细胞系X931分泌蛋白进行鉴定

1、搜集X931细胞培养上清液，0.45um滤膜过滤；

2、将滤过的上清液经Hitrap HF亲和层析柱纯化，采用Millipore浓缩柱浓缩，-20℃或-80℃分装保存；

3、添加20μl上样缓冲液溶解500mg纯化的可溶性本发明融合蛋白上样，行10％SDS-PAGE；

4、于4℃冷室，100伏，300毫安转膜1.5小时；

5、于丽春红染液约5分钟染色，标记蛋白分子量Marker；

6、于封闭液(10％脱脂奶粉，TBST配制)，37℃孵育封闭45分钟；

7、采用TBST室温洗膜三遍，持续摇动，每次15分钟；

8、按照1∶5000-10000比例TBST稀释抗IgGl.Fc特异性抗兔血清，在37℃，一抗孵育膜45分钟，持续摇动；

9、采用TBST室温洗膜三遍，持续摇动，每次15分钟；

10、按照1∶1000比例TBST稀释二抗，在37℃孵育膜45分钟，持续摇动。采用TBST室温洗膜三遍，持续摇动，每次15分钟；

11、按照1∶5000比例TBST稀释三抗，在37℃三抗孵育膜45分钟，持续摇动；

12、采用TBST室温洗膜三遍，持续摇动，每次15分钟；

13、将膜放在滤纸上简短晾干，与ECF底物孵育2-10分钟后，phosphoimager(520nm)显影。

结果表明，细胞系X931含有预期表达的Fc-受体融合蛋白的编码序列，能够稳定表达预期融合蛋白。

                       序列表<160>2<210>1<211>1620<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1atggccccgt ggctgcagct ctgctccgtc ttctttacgg tcaacgcctg cctcaacggc    60tcgcagctgg ctgtagccgc tggcgggtcc ggccgcgcgc ggggcgccga cacctgtggc    120tggaggggag tggggccagc cagcagaaac agtgggctgt acaacatcac cttcaaatat    180gacaattgta ccacctactt gaatccagtg gggaagcatg tgattgctga cgcccagaat    240atcaccatca gccagtatgc ttgccatgac caagtggcag tcaccatcct ttggtcccca    300ggggccctcg gcatcgaatt cctgaaagga tttcgggtaa tactggagga gctgaagtcg    360gagggaagac agtgccaaca actgattcta aaggatccga agcagctcaa cagtagcttc    420aaaagaactg gaatggaatc tcaacctttc ctgaatatga aatttgaaac ggattatttc    480gtaaaggttg tcccttttcc ttccattaaa aacgaaagca attaccaccc tttcttcttt    540agaacccgag cctgtgacct gttgttacag ccggacaatc tagcttgtaa acccttctgg    600aagcctcgga acctgaacat cagccagcat ggctcggaca tgcaggtgtc cttcgaccac    660gcaccgcaca acttcggctt ccgtttcttc tatcttcact acaagctcaa gcacgaagga    720cctttcaagc gaaagacctg taagcagggg caaactacag agatgaccag ctgcctcctt    780caaaatgttt ctccagggga ttatataatt gagctggtgg atgacactaa cacaacaaga    840aaagtgatgc attatgcctt aaagccagtg cactccccgt gggccgggcc cgatatcgag    900tccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga attcgagggt    960gcaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggact    1020cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgta agccacgaag accctgaggt caagttcaac    1080tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac    1140aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc    1200aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccaa cccccatcga gaaaaccatc    1260tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat    1320gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tccaagcgac     1380atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc     1440gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg     1500tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac     1560acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatgactcg agcatgcatc tagagggccc     1620<210>2<211>531<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>序列号Met Ala Pro Trp Leu Gln Leu Cys Ser Val Phe Phe Thr Val Asn 1               5                  10                  15Ala Cys Leu Asn Gly Ser Gln Leu Ala Val Ala Ala Gly Gly Ser

            20                  25                  30Gly Arg Ala Arg Gly Ala Asp Thr Cys Gly Trp Arg Gly Val Gly

            35                  40                  45Pro Ala Ser Arg Asn Ser Gly Leu Tyr Asn Ile Thr Phe Lys Tyr

            50                  55                  60Asp Ash Cys Thr Thr Tyr Leu Asn Pro Val Gly Lys His Val Ile

            65                  70                  75Ala Asp Ala Gln Asn Ile Thr Ile Ser Gln Tyr Ala Cys His Asp

            80                  85                  90Gln Val Ala Val Thr Ile Leu Trp Ser Pro Gly Ala Leu Gly Ile

            95                  100                 105Glu Phe Leu Lys Gly Phe Arg Val Ile Leu Glu Glu Leu Lys Ser

            110                 115                 120Glu Gly Arg Gln Cys Gln Gln Leu Ile Leu Lys Asp Pro Lys Gln

            125                 130                 135Leu Asn Ser Ser Phe Lys Arg Thr G1y Met Glu Ser Gln Pro Phe

            140                 145                 150Leu Asn Met Lys Phe Glu Thr Asp Tyr Phe Val Lys Val Val Pro

            155                 160                 165Phe Pro Ser Ile Lys Asn Glu Ser Asn Tyr His Pro Phe Phe Phe

            170                 175                 180Arg Thr Arg Ala Cys Asp Leu Leu Leu Gln Pro Asp Asn Leu Ala

            185                 190                 195Cys Lys Pro Phe Trp Lys Pro Arg Asn Leu Asn Ile Ser Gln His

            200                 205                 210Gly Ser Asp Met Gln Val Ser Phe Asp His Ala Pro His Asn Phe

            215                 220                 225Gly Phe Arg Phe Phe Tyr Leu His Tyr Lys Leu Lys His Glu Gly

            230                 235                 240Pro Phe Lys Arg Lys Thr Cys Lys Gln Gly Gln Thr Thr Glu Met

            245                 250                 255Thr Ser Cys Leu Leu Gln Asn Val Ser Pro Gly Asp Tyr Ile Ile

            260                 265                 270Glu Leu Val Asp Asp Thr Asn Thr Thr Arg Lys Val Met His Tyr

            275                 280                 285Ala Leu Lys Pro Val His Ser Pro Trp Ala Gly Pro Asp Ile Glu

            290                 295                 300Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

            305                 310                 315Pro Glu Phe Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

            320                 325                 330Pro Lys Asp Thr Leu Met lle Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

            335                 340                 345Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

            350                 355                 360Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

            365                 370                 375Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

            380                 385                 390Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

            395                 400                 405Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Thr Pro Ile Glu Lys Thr Ile

            410                 415                 420Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

            425                 430                 435Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

            440                 445                 450Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

            455                 460                 465Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

            470                 475                 480Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

            485                 490                 495Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

            500                 505                 510Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

            515                 520                 525Ser Leu Ser Pro Gly Lys

            530 531