磁性荧光微球及其制备方法和采用该磁性荧光微球进行生物分子检测的方法

本发明涉及一种磁性荧光微球及其制备方法和采用该磁性荧光微球进行生物分子检测的方法。

自1977年Horan首次利用流式细胞仪将高分子微球应用于免疫学检测以来，以高分子微球作为载体的生物检测技术已经渗透到细胞生物学、分子生物学、免疫学测定、医学等各个领域，显示出广阔的应用前景。由于流式细胞仪具有可根据微球粒径及所带特征荧光信号对微球进行特异性识别的能力，因此如何利用高分子微球结合流式细胞仪建立高通量、自动化生物大分子的检测技术，已成为目前微球技术新的研究热点。

通过在高分子微球表面或内部掺入一种或多种荧光物质制备成的荧光高分子微球，最初被用作校准流式细胞仪和荧光显微镜的荧光准质微球，并逐渐被应用于细胞标记、生物分子标记及在活性条件下的示踪，也可固定蛋白质分子并跟踪其功能化过程。进入90年代，国外公司不断开发出具有特征荧光标记的微球阵列、能对微球进行特异识别的流式细胞仪及其相应的分析软件系统，并在此基础上产生了具有多重分析能力的荧光微球技术，其应用范围被进一步拓展到抗原-抗体检测、

酶-底物反应、核酸杂交、扩增、测序及核酸的基因型分析等领域。荧光微球可通过三个途径实现：[1].通过荧光染料与微球表面功能基团的共价结合使微球表面带有一种或几种荧光物质，参见美国专利U.S.Pat.No.5194300；U.S.Pat.No.4774189；[2].在高分子微球共聚过程中掺入一种或两种荧光物质，参见美国专利U.S.Pat.No.5073498；U.S.Pat.No.4717655；[3].微球形成后，通过物理吸附作用使微球标记荧光，参见美国专利U.S.Pat.NO.5723218。通过前述方法可得到若干组分别具有不同荧光特征的荧光微球阵列，其中每一种微球都能以其特征荧光被流式细胞仪特异识别。根据待检靶分子的不同，利用微球表面的功能基团将抗原、抗体、酶作用底物、受体配基、寡核苷酸等进行固定化，将经过上述处理的微球与待检样品混合，使这些生物分子与样品中相应的靶物分子反应，通过一种荧光物质标记的报告分子与荧光微球-靶物复合物孵育，最后经流式细胞仪检测，可对每一种荧光微球上发生的不同生物学反应进行识别、分析，并给出检测结果，从而使荧光微球具有在同一试管中同步检测多种靶物质的特征。

现有荧光微球技术虽具有较多优点，但仍存在下述缺陷：由于要在同一个反应体系中完成对样品多种靶物质的检测，反应体系复杂，因此需要多步的清洗、离心或酶处理等纯化步骤，除去干扰反应的物质，如二抗、引物、酶等，使得检测步骤较为繁琐，检测周期较长；在多步的清洗、离心过程中，易造成荧光微球的丢失，影响实验或检测结果，甚至会导致实验的失败，在实际应用中只能通过增加微球的用量，使微球的用量远远超过实际检测需要量，以防止微球丢失对结果的影响，但这必然增加了检测成本。

磁性微球是二十世纪八十年代初发展起来的一种用于分离和纯化的新型功能材料，其采用材料复合技术，将有机单体或高分子材料与磁粒子Fe₃O₄复合在一起，利用高分子直接包埋磁粒子或在磁流体存在下通过单体的乳液聚合、悬浮聚合、分散聚合等高分子聚合形成磁性高分子微球，即磁性微球。将磁性微球与抗体或抗原用物理吸附、化学偶联等方法形成免疫磁性微球，可广泛用于各种可溶性抗原的检测、分离与纯化、细胞标记与识别、核酸的分离、PCR检测等。但该技术的缺点是：检测通量不高。

本发明的目的在于避免上述现有技术中的不足之处，而提供一种检测通量大、灵敏度高、特异性强、检测步骤较为简便、检测周期短、检测结果准确、检测成本低的磁性荧光微球的制备方法及采用其进行生物分子检测的方法。

本发明的目的可通过以下措施来达到：

1].合成不同组具有特征荧光的磁性荧光高分子微球；

2].在不同组微球表面固定相应所需的抗体、寡核苷酸等生物分子；

3].将固定后的微球与待检生物样品反应后，加入荧光标记的报告基团，孵育；

4].用流式细胞计数仪对微球表面发生的反应进行定性或定量分析。

一种磁性荧光微球，其特殊之处在于：它是包括磁性纳米粒子和高分子微球构成的磁性高分子微球及荧光分子的直径为0.7～30μm的磁性荧光高分子微球，所述的磁性纳米粒子占磁性荧光高分子微球总重量的10～50％，荧光分子占磁性荧光高分子微球总重量的0.01～20％。

上述磁性纳米粒子通过荧光染料共聚在高分子微球内部掺入荧光分子，或通过吸附或化学键合在微球表面标记荧光分子即构成磁性荧光高分子微球。

上述磁性纳米粒子的粒径以5～12nm为佳。

上述磁性高分子微球可以是粒径为0.7～2μm、磁含量为磁性高分子微球总重量10～20％的磁性高分子种子微球。

一种如上所述磁性荧光微球的制备方法，其特殊之处在于：该方法的制备包括

1].用三价铁和二价过渡金属盐混合水溶液通过化学共沉淀法制备具有超顺磁性的金属氧化物磁性纳米粒子；

2].采用高分子聚合法制备高分子微球；

3].标记荧光染料；

4].最后，得到磁性荧光高分子微球。

上述制备磁性纳米粒子的二价过渡金属盐可为Fe(II)、Mn(II)、Ni(II)、Zn(II)或Cu(II)金属盐等。

上述超顺磁性金属氧化物磁性纳米粒子的制备可加入表面活性剂，形成表面具有疏水性的磁性纳米粒子。

上述磁性高分子微球可以是粒径为0.7～2μm的磁性高分子种子微球，该磁性高分子种子微球的制备方法可采用微悬浮聚合法，其包括：

1].用分散剂对制备得到的磁性纳米粒子进行表面处理，使其具有疏水性，并分散到溶有单体分子的有机相中，然后将引发剂和交联剂溶入体系中；

2].将上述磁性纳米粒子、单体、引发剂、交联剂等混合物加入含有悬浮剂的水中，借助搅拌作用经高速剪切乳化，形成稳定的悬浮液；

3].升温，引发聚合，制备出粒径为0.7～2μm、磁含量为10～20％的磁性高分子种子微球。

上述分散剂可采用聚乙二醇；所述的引发剂可采用过氧化苯甲酰(BPO)或十二烷酰过氧化物。

上述磁性高分子微球可采用悬浮聚合法的制备，其包括：

1].用长链脂肪酸对磁性纳米级粒子进行亲油化处理，使其表面形成一层亲油层；将亲油化处理的磁性纳米级粒子与亲油性单体溶液混合，形成油相；

2].溶解至少一种表面活性剂于水溶液中形成水相、分散油相于水相中形成水包油型悬浮液；

3].热引发聚合反应，形成磁性高分子微球。

上述高分子微球可由有机单体分子聚合或共聚而成，所述的有机单体分子可采用苯乙烯、丙烯酸、丙烯晴、丙烯酰胺、丙烯醛、丁二烯、乙酸内酯、对苯二甲酸乙二醇酯、异戊二烯、二乙烯基苯或甲基丙烯酸甲酯等。

上述对磁性高分子微球标记染料可包括：对所述磁性种子高分子微球进行二次溶胀时，在溶胀剂中掺入两种不同的荧光染料及功能性的共聚单体，使荧光物质通过共聚掺入磁性微球，制备出磁性荧光微球。

上述对磁性高分子微球标记荧光染料的方法可包括：

1].首先制备活性溶胀乳剂，对粒径为0.7～2μm的磁性种子微球进行第一次溶胀，形成活性溶胀后的种子乳胶液，然后加入稳定剂；稳定剂以采用碱性金属卤化物溶于溶胀用乳化剂的水性溶液为宜，浓度可为0.001～0.1M；碱性金属卤化物可以是钾或铯的氯化物、溴化物、碘化物等，以氯化钾为最佳；

2].在含有两种不同比例疏水荧光染料、反应单体和引发剂以及表面活性剂、等成分存在的条件下，加入上述种子乳胶液进行二次溶胀，使单体和引发剂等渗透至种子乳胶颗粒中，得到含荧光染料的溶胀颗粒混合物；最后升温，引发共聚得到粒径均匀分布的磁性荧光微球；所述的两种荧光染料是具有重叠的激发波长、具有不同的发射波长、既可被同一波长的激光所激发、又能分别被流式细胞仪识别的荧光染料。

上述对磁性高分子微球标记荧光染料可通过物理吸附法制备磁性荧光微球，将磁性高分子微球加入含有两种荧光染料的氯仿溶液，在25-55℃下搅拌2-5小时，直至磁球吸附荧光染料达到饱和为止，抽真空除去有荧光染料溶液，产物用磷酸盐缓冲液稀释、储存。

上述对磁性高分子微球标记荧光染料可包括：用微乳液聚合法制备纳米级的非磁性高分子微球(5-100nm)，使两组纳米级微球表面分别吸附两种不同的荧光染料，再将带有荧光染料的纳米微球通过共价结合偶联在制得的磁性微米级微球表面，调节微米级磁性微球表面的两种吸附不同荧光物质的纳米微球的比例，以调节磁性微球的荧光特征；所述的两种荧光染料是具有重叠的激发波长、具有不同的发射波长、既可被同一波长的激光所激发、又能分别被流式细胞仪识别的荧光染料。

上述对磁性高分子微球标记荧光染料可包括：在荧光磁性微球表面具有通过单体共聚形成的带有功能基团的高分子壳层。

一种采用上述磁性荧光微球进行生物分子检测的方法，其特殊之处在于：该方法的检测步骤包括：

1].在磁性荧光微球表面偶联生物活性物质

磁性荧光微球通过其表面的功能基团将多种生物活性物质以共价键偶联在其表面；

2].通过磁性荧光微球表面偶联的生物活性物质，将待检样品中相应的分子捕获至微球表面进行反应，使微球成为生物学反应的固相载体；

3].通过磁分离器进行磁性分离，对捕获至微球表面的反应物进行富集、分离和纯化；

4].通过流式细胞仪识别具有不同荧光特征的微球，对每种微球表面所发生的生物学反应进行区分；通过对待检分子或能与待检分子特异结合的分子上标记的第三种荧光物质的检测，得到对待检样品定性及定量的分析检测结果。

上述在磁性荧光微球表面偶联的生物活性物质可为抗体，其偶联的方法是将表面带羧基的磁性荧光微球30mg与碳二亚胺(EDC)溶液混和后，加入1.5mg抗体，在室温下搅拌24小时，加入牛血清白蛋白30mg/ml，孵育4小时终止反应；磁性分离，弃上清，用PH7.4的PBS洗一次，重新悬浮于PBS中保存。

上述在磁性荧光微球表面偶联生物活性物质可以是寡核苷酸探针，其步骤是用碳二亚胺作为偶联剂，加入1.5mg寡核苷酸探针，在室温下搅拌24小时，加入牛血清白蛋白30mg/ml，孵育4小时终止反应；磁性分离，弃上清，用PH7.4的PBS洗一次，重新悬浮于PBS中保存。

上述生物活性物质可为抗原-抗体，其检测方法是将待检样品与包被特异抗原的磁性荧光微球混合，避光作用10分钟，将相应待检抗体捕获至微球表面；用磁性分离器分离，将微球-抗原-抗体复合物纯化、富集；在上述复合物中加入FITC标记的二抗，避光作用10分钟，用流式细胞仪检测。

本发明与现有荧光微球技术相比具有如下优点：

本发明将具有超顺磁性的纳米粒子引入荧光高分子微球，制备出若干组具有不同荧光特征同时又具备良好磁响应性的磁性荧光高分子微球阵列，简称磁性荧光微球，以其作为生物活性物质和生物学反应的固相载体，能够对待检样品进行多重、定性、定量分析，且自动化程度高。由于微球具备超顺磁性，因而不需经离心及其它纯化步骤，只需通过一步简单的磁性分离，就可对捕获至微球表面的反应物进行富集、分离和纯化，从而提高检测的灵敏度和特异性，同时缩短了检测时间；此外磁性分离还可以避免微球的丢失，节省微球的用量，降低该技术的检测成本。本发明可广泛用于免疫学检测、基因诊断、SNP基因分型及生物大分子相互作用的研究等。

下面将结合具体实施例对本发明作进一步详述：

本发明磁性荧光微球的制备方法分为三个步骤：

步骤1：制备具有超顺磁性的磁性纳米级粒子

磁性纳米级粒子可采用化学共沉淀法制备。该方法用Fe³⁺和Fe²⁺在碱性条件下反应得到Fe₃O₄晶体沉淀。采用其它二价过渡金属盐，如Mn(II)、Ni(II)、Zn(II)、Cu(II)等亦可替代Fe(II)用于磁性纳米级粒子的制备。若要使磁性纳米级粒子分散得较好，可在介质中加入表面活性剂或改变水溶液的pH值。磁性纳米粒子的粒径以小于30nm为宜，以在5～12nm之间最佳。

步骤2：制备磁性高分子微球

方法1：采用微悬浮聚合法制备磁性高分子种子微球

(1).用分散剂对步骤1得到的磁性纳米粒子进行疏水表面处理后使其具有疏水性，并分散到溶有单体的有机相中，然后将引发剂和交联剂溶入体系中；

(2).将上述磁性纳米粒子-单体等混合物加入含有悬浮剂的水中，借助搅拌作用经过高速剪切乳化，形成稳定的悬浮液；

(3).升温，引发聚合，制备出粒径为0.7～2μm，磁含量为10～20％的磁性高分子微球。由于该种磁性高分子微球粒径较小，故又称磁性高分子种子微球。

本发明的分散剂可采用聚乙二醇(PEG)；引发剂可采用过氧化苯甲酰(BPO)、十二烷酰过氧化物(LPO)等。

方法2：采用悬浮聚合制备磁性高分子微球

(1).用长链脂肪酸对磁性纳米级粒子进行亲油化处理，使其表面形成一层亲油层；将亲油化处理的磁性纳米级粒子与亲油性单体溶液混合，以形成油相；

(2).溶解至少一种表面活性剂于水溶液中形成水相、分散油相于水相中形成水包油型悬浮液；

(3).热引发聚合反应，形成磁性高分子微球。具体可参见中国专利CN1253147A；专利申请号98124516.1。

适用于本发明的有机单体：如苯乙烯、丙烯酸、丙烯晴、丙烯酰胺、丙烯醛、丁二烯、乙酸内酯、对苯二甲酸乙二醇酯、异戊二烯、二乙烯基苯、甲基丙烯酸甲酯等。为得到表面含有功能基团如-COOH、-NH₂、-OH、-CHO、-SO₃H等的高分子微球，可采用带有功能基团的两种或两种以上有机单体共聚，如丙烯酸与苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯与甲基丙烯酸共聚得到表面具有含羧基的微球；用甲基丙烯酸羟乙酯HEMA及丙烯醛分别与苯乙烯共聚得到含羟基-OH和醛基-CHO的微球。

步骤3：对磁性高分子微球标记荧光染料

方法1：对步骤2-方法1中得到的磁性种子高分子微球进行二次溶胀，同时在溶胀剂中掺入两种不同的荧光染料及功能性的共聚单体，使荧光物质通过共聚掺入磁性微球内部，制备出磁性荧光微球。具体步骤如下

(1).首先用1-氯十二烷作为一次溶胀剂，对粒径为2μm的磁性种子微球进行第一次溶胀，形成活性溶胀后的种子乳胶液，然后加入稳定剂以使种子微球在溶胀和聚合过程中保持稳定。其它可选择的一次溶胀剂包括：1-氯壬烷乳、1-溴十二烷、十六烷醇等。

(2).在含有两种不同比例疏水荧光染料、有机单体和引发剂以及表面活性剂等成分存在的条件下，加入上述种子微球进行二次溶胀，使单体和引发剂等渗透至种子微球中，得到含荧光染料的溶胀颗粒混合物；最后升温，引发共聚。得到粒径均匀分布的磁性荧光微球。

通过改变两种荧光染料的比例，可得到具有不同荧光特征的微球。具有相同荧光特征的微球构成一组，具有不同荧光特征的微球可构成多组，每组微球可分别包被不同的生物分子。多组微球可满足同步检测不同靶分子的需求。

方法2：通过物理吸附法制备磁性荧光微球：将磁性高分子微球加入含有两种不同比例荧光染料的有机溶剂中，在25～55℃下搅拌2-5小时，直到磁球吸附荧光染料达到饱和为止，用磁式分离器对反应后的混合物进行分离，除去反应中多余的荧光染料和其它有机溶剂，然后将磁性荧光微球用磷酸盐缓冲液清洗并稀释储存于4℃冰箱中。

方法3：用微乳液聚合法制备纳米级高分子微球(5～100nm)，使两组纳米级微球表面分别吸附两种不同的荧光染料，再将带有荧光染料的纳米微球通过共价结合偶联在磁性高分子微球表面，通过调节微米级磁性微球表面的两种吸附不同荧光物质的纳米微球的比例可达到精确调节磁性微球的荧光特征的目的。为防止纳米荧光微球从磁性高分子微球表面脱落，可通过单体共聚在荧光磁性微球表面形成带有功能基团的高分子壳层。

本发明荧光染料的选择：选择油溶性的荧光染料，制备多种具有不同荧光特征的磁性荧光微球阵列，可选用两种荧光染料按不同的比例掺入。这两种荧光染料以具有重叠的激发波长，而具有不同的发射波长为佳，不同的发射波长相差至少大于10nm，以大于50nm最佳，从而使两种荧光物质既可被同一波长的激光光源所激发，而在不同的发射波长处分别测定各自的荧光强度并通过两个强度的比例确认荧光微球。如红色荧光物质7-Aminoactinomycin D(Ex＝546，Em＝647nm)和桔黄色荧光物质PO-PRO^TM-3iodide(Ex＝539，Em＝567nm)。

采用磁性荧光微球进行生物分子检测的方法

步骤1：磁性荧光微球表面偶联生物活性物质(生物活性分子)

根据检测需要，磁性荧光微球可通过其表面的功能基团将多种生物活性物质以共价键偶联在其表面，这些生物活性物质包括：抗原、抗体、激素受体、酶、核酸、寡核苷酸、半抗原等。

步骤2：用磁性荧光微球进行生物学检测

磁性荧光微球表面偶联的生物活性物质，可与待检样品中相应的分子发生反应，使微球成为生物学反应的固相载体；因微球具备超顺磁性，无需离心及其它的纯化步骤，而只通过磁分离器进行一步简单的磁性分离，就可对捕获至微球表面的反应物进行富集、分离和纯化，不但提高了检测的灵敏度和特异性，同时缩短了检测时间；由于磁性微球中按不同的比例掺入两种荧光物质可得到若干组具有不同荧光特征的微球阵列，每种微球均可通过自身标记的特征性荧光被流式细胞仪识别，因此流式细胞仪就能对每种微球表面所发生的生物学反应进行区分，这就使得在一个试管或反应孔中使用多组磁性荧光微球对同一样品进行多重分析成为可能；普通的流式细胞仪每秒钟可对5,000个微球上的荧光信号进行分析并给出数据，因此通过对待检分子或其它能与待检分子特异结合的分子上标记的第三种荧光物质，如FITC、PE等信号强度的检测，可得到对待检样品定性及定量的分析检测结果。

本发明磁性荧光微球制备方法的具体实例：制备方法实施例一：

步骤1：化学共沉淀法制备磁性纳米粒子

将0.5mol/l的Fe²⁺溶液和0.5mol/l的Fe³⁺液，按1∶2体积比取样加入到三口烧瓶中，搅拌均匀后，加入适量分散剂聚乙二醇，升温到70℃，缓慢滴加浓氨水，搅拌，反应30分钟，制备出粒径为20nm左右的Fe₃O₄粒子。反应产物经磁性分离后，用蒸馏水反复洗涤至中性，以悬液状态保存。(现有技术)

步骤2：悬浮聚合法合成聚苯乙烯磁性种子微球

用聚乙二醇分散剂将Fe₃O₄进行表面处理后分散到苯乙烯中，加入引发剂十二烷酰过氧化物(LPO)和交联剂二乙烯苯(DVB)，然后将上述混合液分散在水中，经过高速剪切乳化，形成稳定的悬浮液，倒入装有搅拌器、温度计、回流冷凝管和氮气氛导管的250ml四口烧瓶中，将烧瓶移入恒温水槽中进行微乳聚合，聚合温度为80℃，聚合时间为2.0h。聚合反应结束后。加入SDS作为分散剂，然后将滤液经过磁分离后即可得到粒径约2μm的聚苯乙烯种子磁球。

步骤3：制备带羧基的聚(苯乙烯-丙烯酸甲酯)磁性荧光微球

2ml 1-氯十二烷(CDD)与0.25％的SDS 5ml水溶液混匀作为一次溶胀剂，将10ml 10％磁性聚苯乙烯种子微球与0.25％50mlSDS溶液中混匀后，加入已配制好的一次溶胀剂，同时加入20ml的30％丙酮溶液使CDD更容易渗入微球，搅拌12小时；取2ml上述悬浮液加入20ml蒸馏水和40ml0.25％SDS，磁性分离，得到一次溶胀的种子微球。400mg4％过氧化苯甲酰引发剂溶入10ml含苯乙烯(90％)和丙烯酸甲酯(10％)溶液中，再加入等体积0.25％SDS，混匀，再按不同比例加入荧光染料7-氨基放线菌素D(7-Aminoactinomycin D)和PO-PRO^TM-3iodide制成单体-引发剂-荧光染料的均质混合溶液，然后取20ml上述混和溶液加入上述经一次溶胀后的种子微球，通入氮气保护，加热70℃，2小时引发溶胀种子的快速聚合。得到粒径5-6μm的磁性荧光微球。制备方法实施例二：

步骤1：制备磁性纳米粒子，同实施例一的步骤1。

步骤2：制备带羧基的磁性聚苯乙烯微球。

将上述Fe₃O₄纳米粒子35g加入苯乙烯50g、甲基丙烯酸(MAA)5g、二乙烯苯10g、过氧化苯甲酰(BPO)5g组成的有机相中，略经搅拌即可形成稳定分散的油相磁性胶体溶液；在1升圆柱形搅拌式反应器中加入500ml蒸馏水和10g聚乙烯醇，50℃恒温搅拌0.5小时后引入上述油相磁性胶体，调节搅拌速度至800rpm，升温到80℃反应6小时，再升温到95℃熟化4小时；冷却后，经磁性分离、洗涤等工序，即可得到粒径在5-15μm带羧基的磁性聚苯乙烯微球。

步骤3：通过物理吸附法制备磁性荧光微球

将磁性高分子微球加入含有两种荧光物质的二甲基亚砜(MDSO)溶液，此吸附液中一般荧光分子的浓度为0.1～1wt％，将5～10ml浓度是0.5～2wt％磁性微球稀释液加入0.5ml荧光分子的DMSO中，在25-55℃下搅拌2-5小时，直到磁球吸附荧光染料达到饱和为止，磁性分离出去多余的荧光染料溶液，产物用磷酸盐缓冲液清洗后稀释、储存。制备方法实施例三：

步骤1：制备磁性纳米粒子  同实施例一——步骤1；

步骤2：制备表面带羧基的磁性聚苯乙烯微球  同实施例二——步骤2；

步骤3：制备表面带胺基的纳米级荧光微球

先将少量约1/3的苯乙烯等单体、乳化剂SDS、助乳化剂1-戊醇、去离子水配成均相微乳液；将该微乳液搅拌并升温至25～80℃，向上述反应体系通氮气5～10分钟后，加入引发剂过硫酸钾(KPS)形成反应体系；同时将剩余单体、含胺基的功能单体甲基丙烯酸胺乙酯(AEM)、交联剂二乙烯苯(DVB)，逐滴加入反应体系，维持1～6小时滴完，伴以400～650转/分速度搅拌；滴加完毕继续反应0.5～3.5小时，即可得到表面带胺基的纳米微球。反应体系中，乳化剂浓度为2～40wt％，单体浓度为1～50wt％，功能单体浓度为0.2～20wt％，引发剂浓度为0.5～10mM。纳米微球吸附荧光分子的方法同例2.(3)。

步骤4：制备磁性荧光微球

表面带羧基的磁性荧光微球30mg与碳二亚胺(EDC)溶液混和后，加入按一定比例混合的两组表面分别吸附两种不同荧光染料的表面带胺基的纳米微球共3.0mg，在室温下搅拌24小时。磁性分离，弃上清。用PH7.4的PBS洗一次，磁性分离，弃上清。即得到偶联纳米荧光微球的磁性微球。

在上述产物中加入苯乙烯50g、甲基丙烯酸(MAA)5g、二乙烯苯(DVB)10g组成的有机相中作用1小时后，将其引入盛有500ml蒸馏水圆柱形搅拌式反应器中，加入过硫酸钾5g，调节搅拌速度至800rpm升温至95℃，升温到80℃反应2小时，再升温到95℃熟化2小时，即可在偶联纳米荧光微球的磁性微球表面形成带有功能基团的高分子壳层。冷却后，经磁性分离、洗涤、等工序，即可得到带羧基的磁性荧光聚苯乙烯微球。生物分子检测实施例一：磁性荧光微球表面偶联抗体

表面带羧基的磁性荧光微球30mg与碳二亚胺(EDC)溶液混和后，调节溶液的pH为4.5左右，加入1.5mg抗体，在室温下反应1～2小时，加入牛血清白蛋白(30mg/ml)，孵育4小时终止反应。磁性分离，弃上清，用pH7.4的PBS洗一次，重新悬浮于PBS中保存。生物分子检测实施例二：含羧基的磁性荧光微球表面偶联寡核苷酸探针

仍采用碳二亚胺作为偶联剂，将例4中的抗体换为寡核苷酸探针，长度可在5-500mer，最好为20-30mer。生物分子检测实施例三：应用磁性荧光微球技术进行抗原-抗体的免疫学检测

待检样品与包被特异抗原的磁性荧光微球混合，避光作用10分钟，以将相应待检抗体捕获至微球表面。磁性分离器分离，将微球-抗原-抗体复合物纯化、富集。在上述复合物中加入FITC标记的二抗，避光作用10分钟，流式细胞仪检测。生物分子检测实施例四：应用磁性荧光微球技术进行HLA-DNA分型检测

将HLA等位基因序列特异性寡核苷酸探针(SSOP)分别与不同的微球偶联，制备带有不同分型探针的磁性荧光微球。

待检血样收集；DNA抽提；HLA特定亚型DNA片段扩增，在扩增体系中加入FITC标记的ddNTP，使PCR扩增产物标记FITC；将结合有SSOP分型探针的磁性荧光微球与PCR扩增产物混合避光孵育1小时；磁性分离器分离；流式细胞仪检测，软件分析结果。

本发明未作特殊限定的微球均指高分子微米级微球。