利用野生大豆拓宽栽培大豆细胞质遗传基础的方法

[技术领域]

本发明涉及作物遗传育种领域，特别涉及大豆种质创新中野生大豆细胞质利用技术领域。

[背景技术]

目前，大豆品种的遗传基础越来越狭窄，育种工作者为了改变这种局面，努力拓宽栽培大豆的遗传基础。野生大豆蛋白质含量高，抗逆性强，成为拓宽栽培大豆遗传基础的重要种质资源，早已引起很多育种家的重视与利用。但通常认为，野生大豆作母本，不易克服蔓生倒伏性、裂荚性、粒小、细茎、深色种皮等缺点。同时，因野生大豆子房和胚襄很小，作为母本与栽培大豆杂交，一般不易成功。因此，国内外许多学者多以栽培大豆为母本，野生大豆、半野生大豆为父本进行杂交试验。

经中国农科院科技文献中心、中国AGRIS华北分中心、河北省农科院情报研究所检索，查阅了有关野生大豆的研究文献，除山西农大程舜华(参见中国农业科学院科技情报研究所编辑的《农牧情报研究》，1982年，第20期，第51页)是用野生大豆作母本与栽培大豆杂交一次，观察了一至三代性状的遗传分离表现外，国内外均无以野生大豆作母本与栽培大豆进行杂交和广义回交效果的研究报道(参见中国农业科学院编辑的《农业科技要闻》1993年，第18期，第5页)。

我国栽培大豆细胞质遗传基础单一狭窄主要表现在：

1、据东北农业大学张国栋博士(参见《大豆科学》1987年，第16卷，第

4期，第313页)研究，黑龙江省的大豆品种66.23％的细胞质来自黄

宝珠和白眉。

2、山东省农科院作物研究所李星华(参见南京农业大学编辑的《全国“七

五”大豆育种攻关学术交流论文汇编》1988年，第99页)分析了山东

省1949年以来推广的大豆品种的细胞质，有84.88％(86个)来源于

齐黄1号和莒选23。

3、中国农业科学院叶兴国研究员(参见《大豆科学》1995年，第14卷，

第3期，第216-217页)对黄淮海地区育成大豆品种的细胞质来源进

行了追溯分析，分析结果表明，齐黄1号，莒选23二个品种的细胞质

是黄淮海地区育成品种细胞质的主要来源，占105个品种的66.7％，

陕西省育成品种的细胞质主要来自于齐黄1号，占育成品种的57.1％。

可见，我国在大豆生产上大豆品种的细胞质遗传基础非常狭窄。

美国大豆育种工作者在对大豆核DNARFLP进行大量研究的同时，一些学者还对大豆胞质DNARFLP多态性进行了分析。根据Close等人(1989)(CloseP.S.，Shoemaker P.C.，Keim P.，1989，Distribution of Restriction SitePolymorphisms Within the Chloroplast Genome of Genus Glyme Subgenus Soja.TheorAppl Genet.77：768-776)对美国大豆叶绿体DNA(ctDNA)的RFLP研究，ctDNA具有一定的多态性，据此他们将美国大豆胞质来源分为6组。Crabau等人(1989)(Grabau.Davis W.H.，Gengcnvach B.G.，1989.Restriction FragmentPolymorphismsina Subclass of the Mandarin Cytoplasms.Crop Sci.29：1554-1559)首先对大豆线粒体DNA(mtDAN)RFLP的多态性进行了研究，然后对美国138个栽培大豆的mtDNA进行了更详细的分析。结果表明，这些品种的细胞质来源分为4组，其中Cincoln型27个，Arksoy型2个，Bedford型72个，Soia-forage(饲用)型7个。由此可见美国大豆细胞质来源也是相当单一的，多集中在Bedford和Cincoln两型之内(参见《大豆科学》1995年，第14卷，第4期，第337页)。以上结果表明，大豆，特别是栽培大豆的遗传基础是十分狭窄的。

前苏联学者Skvortzow(1927)和日本学者Takagif.c(1929)从事野生大豆研究至今已有67年历史(参见《大豆科学》1990年，第9卷，第2期，第89页)。此间，一些学者运用回交方法对大豆种间杂交性状的改良做过某些尝试。美国的Weher(1950)(参见《大豆的遗传与选种》1958年，第66页，科学出版社出版)利用野生大豆作父本与栽培大豆杂交，对种间杂种性状的分离作过系统研究。我国著名大豆育种家王金陵先生(参见《大豆科学》1986年，第5卷，第3期，第181页)在利用野生大豆作父本与栽培大豆杂交及对后代的杂交改良方面作了大量的理论研究工作。利用野生大豆作父本与栽培大豆杂交选育的还有吉林省通化农科所王荣昌(参见《农牧情报研究》1982年，第20期，第35页)、吉林省农科院大豆所郑惠玉(参见《吉林农业科学》1991年，第3期，第9页)、黑龙江省农科院大豆育种所姚振纯(参见《大豆科学》1993年，第12卷，第3期，第196页)、Ert.D.S.(1986)(参见《大豆科学》1990年，第9卷，第2期，第89页)。英国的LeRoy.A.R.(1991)(参见LeRoY.A.R《国外农学文摘》1991年，第5期，第40页，中国农科院科技信息中心编)，为了选育适于加工需要的小粒大豆新品种，也利用野生大豆作父本进行了杂交试验。黑龙江省农科院大豆研究所和吉林省农科院大豆所利用野生大豆作父本培育出了小粒大豆。此外，以半野生大豆熊岳小粒黄为亲本创造的中间材料5621作为桥梁亲本在育种中发挥了重要作用，但上述成果均是利用了野生大豆的细胞核。

[发明内容]

由上述可知，现有技术中存在的技术问题是大豆品种的遗传基础越来越狭窄，如何利用野生大豆作母本来拓宽栽培大豆细胞质遗传基础。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：先利用野生大豆作母本，用第一种栽培大豆作父本进行种间杂交，再用所述种间杂交后代的不同世代材料与第二种栽培大豆进行杂交选育。

一种拓宽栽培大豆细胞质遗传基础的方法，其特征在于先利用野生大豆作母本，用第一种栽培大豆作父本进行种间杂交，再用所述种间杂交后代的不同世代材料作母本，与第二种栽培大豆作父本进行杂交选育。

根据一种优选实施方式，经过杂交选育，使野生大豆的细胞核占到6.25-25％，更优选为6.25-12.5％。

根据另一种优选实施方式，所述第一种栽培大豆选用承豆1号，所述第二种栽培大豆选用通交81-1543。

根据一种优选实施方式，所述野生大豆选用新民6号。

根据一种优选实施方式，所述种间杂交后代的不同世代是指种间杂交后进行系谱选择的第一代或第二代及以后各个世代和稳定品系。

根据一种优选实施方式，所述父本是根据育种目标来确定的，或者所述父本选择具有与野生大豆相对应的部分或全部特征的品种或品系。

[有益效果]

本发明的有益效果在于：

(1)前人大豆种质创新是以野生大豆作父本，利用了野生大豆细胞核。本方法是以野生大豆作母本，与栽培大豆杂交，利用了野生大豆的细胞质和部分细胞核。

(2)本方法在种间杂交的基础上，利用优良栽培大豆有针对性地连续进行广义回交改良，以克服野生大豆茎细、粒小、深色种皮等不良性状，稳定有益性状。为利用野生大豆种质资源，开辟了更广泛而有效的新途径，创造了国内外野生大豆细胞质利用上的先例，拓宽了栽培大豆细胞质遗传基础，为培育大豆新品种提供了具有野生大豆细胞质的新的杂交技术和方法及亲本种质材料，为今后大豆育种和大豆生产将会产生深远影响。

(3)在国内首次分析了种间杂交后代育成品系DNA组成及与亲本遗传物质的关系。

(4)根据所选择的育种目标不同，育出的品种会增产11.1-27.2％，提高蛋白质4.89-7.4％，虫食率低，具有高抗或中抗大豆花叶病毒病3号的作用，且农艺性状好。

[具体实施方式]

当利用野生大豆作母本与栽培大豆杂交时，野生大豆可以选择蛋白质含量高，荚密，抗逆性强的野生大豆，如果野生大豆开花比父本晚，花期不能相遇时，野生大豆在出苗后遮光处理20天，下午5点至上午8点进行遮光处理。第一个栽培大豆父本可选择矮杆、粒大、有限型栽培大豆，如果要选育高蛋白品种，父本蛋白质含量也应尽量高些。如果父本选用适当，F2代可获得稳定纯合小粒黄豆类型。第二个栽培大豆父本，可选择高蛋白、粒大荚密、杆矮、杆粗有限型品种，这有利于后代尽快选出直立型、粒大高蛋白单株个体。第三个父本，目的是丰富杂交后代遗传基础，在性状选择上可以根据后代品系存在的缺点进行有针对性的选择亲本。如后代仍杆细、粒小，就应继续选择粒大杆粗的栽培大豆进行杂交。如果后代植株太矮小了，也可以选用有一定繁茂度的有限型品种进行广义回交。回交的次数也不宜过多，以野生大豆细胞核占25-12.5％为宜。如果还不理想，可以再杂交一次，使野生大豆细胞核占6.25％。除了在田间选择优良单株外，在室内还应进行详细的考种记载，有利于优良单株的种粒性状的选择。

本发明人用野生大豆作母本，以栽培大豆承豆1号作父本进行杂交，再用通交81-1543进行杂交后，经系谱选择法育成的品系有8702-2-4-1-2-3-3、8702-2-8-13-4-2-1、8650-1蓝-4-4-2-2。用8650-1蓝-1作母本，用第三个父本8412-3-1-1进行广义回交后，经系谱选择法育成的品系有8916-1-m-1-2，比对照种增产218％，野生大豆细胞核占12.5％。经中国农科院品资所化验，8650-1蓝-4-4-2-2蛋白质含量达到46.02％，比对照种冀承豆1号38.62％，提高7.4％。8702-2-4-1-2-3-3蛋白质含量为43.51％，比对照提高4.89％。

利用野生大豆作母本选育的高产高蛋白优良品系目前以野8702-2-4-1-2-3-3产量表现较高，稳产性、农艺性状较好。

表1.野8702-2-4-1-2-3-3与对照种产量结果比较表    承德长城公司品比1996-2001

表2.野8702-2-4-1-1-3-3主要农艺性状与对照种比较表1996-2001年品比

试验地点在承德市双桥区冯营子镇，土质为中壤质褐土，肥力中等，大豆育种试验一直是在不施基肥，也不追肥的条件下进行的。种植密度每亩13333株，行长5米，行距0.5米，株距0.1米。4月下旬播种，9月下旬成熟。出苗后15天长出一个大复叶时进行人工手间定苗。在干旱年份播种前7天应春灌，生育期间干旱严重也应进行灌水，8月份干旱对产量影响较大浇水是非常重要的。

根据优良品系分子标记的鉴定，用引物OPA04、OPE01、OPH02、OPK10、OPL18、OP008、OP020、OPS03分析优良品系和亲本的线粒体，基因组DNA观察到，3个品系均扩增出与野生亲本相同而没有栽培亲本特征的RAPD位点。这表明3个品系是以野生大豆为母本培育成功的。

从种间杂交组合(野生大豆×承豆1号)×通交81-1543，选育出3个后代品系8702-2-4-1，8702-2-8-13，8650-1蓝-4，用RAPD分析亲本及后代品系细胞核DNA。共筛选了79个引物，其中15个引物在亲本间具有多态性，这15个引物总扩增位点118个，其中，母本野生大豆有特异位点18个，父本承豆1号和通交81-1543各有特异位点4个和9个。通过对亲本RAPD位点的分析发现，野生大豆特异位点明显多于栽培大豆，证明了野生大豆遗传基础比较丰富，用其拓宽栽培大豆细胞质遗传基础是可行的。8702-2-4-1具有母本的特异位点4个，父本的特异位点5个。8702-2-8-13具有母本的特异位点3个，父本的特异位点8个，农艺性状表现更象父本。

8650-1-4-4具有母本的特异位点12个，父本的特异位点2个，在农艺性状上更多的继承了野生大豆的遗传特点，如多荚多分枝。这表明在F1代用通交81-1543杂交比F2代杂交，能较多地保持野生大豆的遗传物质。另外，亲本的一些特异位点在后代中加强，可能是超亲遗传或杂种优势的表现。

表3.由组合[(野生大豆×承豆1号)×通交81-1543]培育有三个后代品系

                     细胞核DNA的RAPD位点组成

表4.组合[(野生大豆×承豆1号)×通交81-1543]亲本及后代农艺性状

综上所述，尽管3个后代品系均是用野生大豆×承豆1号组合作母本，通交81-1543作父本育成的，其亲本遗传物质的理论组成是相同的，即野生大豆遗传物质所占的比例是25％。但前2个姊妹系是在组合[(野生大豆×承豆1号)的F2代×通交81-1543]进行回交选育成的，而8650-1-4-4是在组合[(野生大豆×承豆1号)F1代×通交81-1543]进行回交选育成的。用栽培大豆早回交比晚回交育成的品系更多地保留了野生大豆的遗传特性。既然不同杂交世代育成品系的产量水平和大豆花叶病毒病抗性等级都没有显著差异，因此，建议在大豆种质创新中应当尽可能扩大野生大豆在后代遗传物质中所占的比例。此研究结果与前人关于野生种的利用研究不同，因为其它作物野生种如玉米的利用由于不利性状的影响而受到限制。

本项大豆种间杂交方法利用野生大豆细胞质替换栽培大豆细胞质后，创造的栽培大豆新种质没有出现像玉米种间杂种后代那样的难于克服的缺点。同时，正反交F1代的产量因素分析表明，用野生大豆作母本与栽培大豆杂交，其F1代的蛋白质含量产生超高亲优势，有关产量性状如粒数和粒重在杂交分离世代有可供选择的优良个体，具体表现为一定的母本效应和质核互作效应。本项大豆育种方法为广泛利用野生大豆细胞质替换栽培大豆细胞质，创造新种质，丰富大豆育种遗传基础，创造和提供了实例及具体方法。为解决我国及国际大豆育种上细胞质遗传基础狭窄单一问题提供了有实用价值的新育种技术。

[实施方式]

下文中采用非限定性实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

(1)获得以野生大豆为母本的F1代真杂种

1984年对高蛋白的固新野生大豆进行种植，对开花期进行了观察，来源于冀南的固新野生大豆在冀北承德表现晚熟，8月20日才开始开花，而这时所有春大豆品种全部开完花了，授粉杂交工作没有做成。1985年又播种，出苗后进行了20天短日照处理，下午5点遮光至次日8点揭开，这样于6月23日就开花了，比自然条件下提前开花57天，为杂交创造了条件。为了降低种间杂交后代的株高和增加丰产性，选用有限性，株高60厘米，丰产性好的承豆1号作父本进行杂交，秋后获得1粒F0代种子。

1986年春将这1粒F0种子经清水浸泡后于5月3日播下，组合编号8530，5月13日出苗，到6月3日至4日，展出两个复叶时，叶片呈长椭形(母本野生大豆为椭圆叶，父本披针叶)，由此可确认是真杂种，F1百粒重5.8克。为了加强栽培性状，提高蛋白质含量，1986年又用有限型，株高65厘米高蛋白的通交81-1543进行了三交，并获得了1粒F0代种子。在1987年8530F2代中分离出1棵直立型植株，披针叶，白花，有限型。并在这株上又进行了三交。并获得12粒F0种子。组合编号8702，8702组合后代全部直立，如：8702-2-4、8702-2-8。

(2)获得三交F1代真杂种：

1987年5月1日将1粒三交F0种子播种，组合编号8650，5月13日出苗，7月24日开花，紫花，披针形叶。因为是种间杂交，表现了强大的杂交优势，植株生长特别繁茂，高大但主茎与分枝不明显，茎基部粗壮，单株结荚1262个，3156粒，单株粒重317.5克，百粒重10.7克，种皮黄绿色。1988年三交F2代分离出一株茎杆粗壮，粒大直立型号植株，以后世代也表现杆粗，并继续分离也粒大单株。如8650-1-4，在《河北农业科技》上发表了“用野生大豆作母本杂交获得成功”一文，刊登在1987年10期26页。

用8650-1蓝-1作母本，用第3个父本8412-3-1-1进行广义回交后，经系谱选择法育成的品系有8916-1-m-1-2，比对照种增产21.8％，野生大豆细胞核占12.5％。野8650-1蓝-1-3-3-2种粒较小，百粒重18.0克，用百粒重28克的84128变作第三个父本，进行广义回交改良，使后代百粒重提高到22.2克，比母本提高4.2克。具有完全野生大豆细胞质，野生大豆细胞核占12.5％。后代正在选育中。

实施例2

为了证实利用野生大豆作母本与栽培大豆杂交成功的重演性，1994年利用孔桥野生大豆作母本，在进行短日照处理18天，开花后，用有限型粒大的河南黄豆作父本杂交又获得成功，组合编号9441，F1和F2都进行了广义杂交工作，F3代用中品661又进行了广义杂交，获得5粒F0种子，组合编号9718。以后用9718F4和9441-7作母本，用多个栽培大豆如豫豆18，承豆5，中品5016，豫豆12，武邑闫忠英大豆，冀青1号，9039-1-8＝1等进行广义杂交工作现获得了一批(10个组合204个)杆粗、粒大直立型，具有野生大豆细胞质的种间杂交后代材料，这批材料正在选育中。

实施例3

为了拓宽栽培大豆细胞质遗传基础，提示我国栽培大豆细胞质遗传基础狭窄单一的原因及机理，1995年以野生大豆新民6号为亲本，分别与4个栽培大豆合丰25号，通农10号，承8412，开8157大豆进行了4对正反交杂交试验，1996-1998年详细观察分析了F1、F2、F3代正反交试验的主要农艺性状分离和母体效应。

试验结果表明：株高具有极显著的母本效应(达到0.01％显著)。主茎节数，单株荚数也有母体效应。单株粒数具有显著的母本效应，达到0.05％显著。百粒重最后一对组合表现母体效应。前3对组合表现野生大豆细胞质与栽培大豆细胞核间的质核互作优势效应。根据本项试验结果可以初步认为，我国栽培大豆细胞质遗传基础狭窄单一，可能是母体效应起着决定作用。野生大豆植株高、节多、荚多、粒多、蛋白质含量高，抗逆性强。所以，利用野生大豆作母本，来拓宽栽培大豆细胞质遗传基础，具有重要的现实和长远意义。