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法律状态
2008-04-30
授权
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2004-11-10
实质审查的生效
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2004-09-01
公开
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本发明涉及重组融合蛋白的二聚体、三聚体、四聚体或五聚体的二聚物或寡聚物，其中所述重组融合蛋白具有至少一种成分A和至少一种成分B。另外，本发明涉及这些类型的二聚物或寡聚物用于制备药物的用途和其用于体外诊断的用途。最后，本发明还涉及具有一种成分A和一种成分B的融合蛋白，其中所述成分B含有选自Clq-蛋白质或者Collectine家族的蛋白质的多聚和寡聚片段，或者这类片段的功能衍生物。编码该类型融合蛋白的DNA序列以及表达载体和包含该DNA序列和/或该表达载体的宿主细胞也是本发明的主题。
在自然界中存在许多生理上呈二聚体、三聚体、四聚体或五聚体的蛋白质。由于在溶液中这些二聚或多聚的蛋白质的表面相互作用，蛋白质可自发聚集，或者甚至例如动力学延迟型聚集，因为蛋白质的聚集取决于浓度或介质。对此起作用的是疏水性相互作用、氢键形成和/或库仑力。
然而，对于某些蛋白质也发现了结构运动，其导致由特定结构限定的分子间的超二级结构的形成，并因此形成蛋白质二聚体或多聚体。超二级结构的形成以形成这些二聚体或多聚体的蛋白质的特征氨基酸序列为基础。例如所谓的“绕线式螺旋”可以认为是超二级结构，其通过特征α-螺旋的相互作用影响蛋白质的二聚或多聚，在每一种形成卷曲螺旋形式的蛋白质的情况下都出现α-螺旋。作为蛋白质分子间“二聚或多聚结构域”的绕线式螺旋在结构上表现出相互缠绕的两股或多股的超螺旋。特别是对胞外蛋白质二聚体或多聚体，并且特别是对结缔组织蛋白质或蛋白质复合体出现这些类型的卷曲螺旋运动。
例如Beck等(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)(1996)256，909-923)描述结缔组织蛋白质，也称为软骨基质蛋白(CMP)，其在三链螺旋上聚集成同三聚体，这是三个互补螺旋(都是多肽成分)聚集的结果，是以卷曲螺旋模式为基础的。形成三链螺旋的该类型螺旋的氨基酸序列特征是七单元组模式(abcdefg)n。a和d位置的氨基酸通常携带非极性侧链，因此使得形成上述超螺旋结构，这里是三个螺旋组成的三链螺旋。
另外，文献还公开了另一种胞外基质蛋白(软骨寡聚基质蛋白)(COMP)中具有五螺旋绕线式螺旋形式，螺旋彼此相互作用并可因此形成五聚体。(Kajava，蛋白质：结构、功能和遗传性(PROTEINS：Structure，Function and Genetics)，24：218-226(1996)；Malashkevich等，Science，Vol.274，761-765，1996)。
除不属于胶原蛋白家族的蛋白质的基质蛋白COMP和CMP外，在胶原蛋白家族的蛋白质中也发现通过形成超二级结构的特定结构多聚现象。对此，胶原蛋白纤维的结构特征在于由三个螺旋状扭曲多肽组成的原胶原蛋白。头发的初原纤维也是由带有运动的“卷曲螺旋”的α-角蛋白的三链螺旋构成的，但是在这种情况下是左手螺旋。
为了提高配体的亲合力，Tershikh等(PNAS，Vol.94，1663-1668，1997)提出使用具有配体功能的短肽和基质蛋白COMP的“卷曲螺旋”结构域的融合蛋白。对于这些五聚体可证实提高的亲合力，对此通过这种方法不能获得更高级的聚集体。
另外，由于在它们各自的多聚序列片段中它们的序列同源性，将蛋白质Clq、胶原蛋白α1(X)、α2(VII)、冬眠蛋白、ACRP30、内耳结构蛋白、小脑肽(Cerebellin)和Multimerin归为Clq蛋白家族(Kischore和Reid，免疫药理学(Immunopharmacol.)，42(1999)15-21)，同样地发现其结构是二聚体或多聚体。在该家族存在聚合特征的蛋白质中，例如，补体体系已知的蛋白质Clq的结构的特征在于各自具有球形的所谓“头”部结构域和“胶原蛋白样”螺旋序列片段的单体。这些单体通过该形成卷曲螺旋三链螺旋的螺旋序列片段进行三聚合。六个这些Clq三聚体再形成寡聚物，而该蛋白质三聚体的寡聚作用以各卷曲螺旋三链螺旋之间的相互作用为基础。结果是该蛋白质中或者该多聚(寡聚)蛋白质复合体Clq中的这种结构排列产生称为“花束”的结构，从而保证18个球形，C-末端排列的头部结构域与三聚体的六聚物连接。
对于蛋白质ACRP30也可以看到和蛋白质Clq类似的结构，蛋白质ACRP30也是一种Clq家族的蛋白质(Hu等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)Vol.271，No.18，10697-10703，1996)。脂肪细胞(Adipozyten)分泌的这种血清蛋白很可能是三聚体的四聚物，对此，和Clq蛋白质一样，球形C-末端结构域同样通过胶原样三链螺旋结合。可能有四种这样的三链螺旋最后通过相应的相互作用再形成寡聚物。在Shapiro和Scherer的出版物中(当代生物学(CurrenrBiology)1998，8：335-338)给出了借助X-射线结构分析测定的ACRP30同三聚体的结构。
另外，在文献中以胶原蛋白样结构域、颈区和另外的球形羧基末端凝集素结合结构域为特征的Collectine类蛋白质是已知的。Collectine生理上也以三聚体的寡聚物存在。例如，肺表面活性物质蛋白质A(SP-A)和甘露糖结合蛋白(MBP)，这两者都属于Collectine家族，通过它们的“胶原蛋白样”结构域的相互作用三聚合，并且发现最后形成三聚体的六聚物(Epstein等，Current Opinion inImmunology Vol.8，No.1，1996，29-35)。因此，属于Collectine的已知蛋白质也形成多聚体(例如三聚体)的寡聚物(例如六聚物)。
文献还表明，无数生理学作为信号分子起作用的蛋白质只有在某些条件下才传导生物信号。例如，膜结合sFasL是生物学即编程性细胞死亡有效的，而从膜结合片段(称为FasL)上裂解胞外蛋白质片段之后，这种非膜-结合sFasL级分不再能够对靶细胞带来编程性细胞死亡作用。Schneider等的公开物(J.Exp.Med.Vol.187，No.8，1998，1205-1213)陈述正如前面所解释的，从膜-结合蛋白质片段裂解之后获得的sFasL-三聚体的生物学作用仍然可通过使用交联抗体使它们的生理功能再活化。为了该目的构建、表达由FasL的三聚结构域、短连接体序列和Flag标记(携带Flag氨基酸序列(单字母代码)DYKDDDDK)组成的融合蛋白，并且该类型非结构三聚(即不是通过以形成超二级结构为结果的特定二级结构相互作用)的融合蛋白通过抗Flag标记定向的抗体交联。
这种通过抗体结合交联的sFasL分子表现出比非交联的sFasL-三聚体显著提高的特异编程性细胞死亡活性。但是这种Schneider等提出的方法确实有缺点，即除了带有三聚结构域的重组的、非膜-结合的FasL蛋白质外，也必需使用特异性抗体，换句话说，只有在另外的分子级分的前提下才能实现生物活性的提高。另外，根据Schneider等提出的理论，不可能保证多聚体寡聚的精确预定或可确定程度。也就是说抗体具有这样的作用，即FasL-三聚体结合成二聚物或者甚至发生广谱寡聚复合体形成大的sFasL/抗体聚集体。因为要求具有最大效率的精确最终产物，例如用于药物应用，结果是Schneider等提出的用于再激活和/或提高sFasL活性的方法是不实用的。
因此本发明的中心目的是提供避免现有技术缺点的化合物，特别是具有提高的生物活性或者引起生物活性的再激活的化合物。
通过权利要求1的主题，即重组融合蛋白的二聚体、三聚体、四聚体或五聚体的二聚物或寡聚物实现本发明目的，特征在于所述融合蛋白具有至少一种成分A和至少一种成分B，其中成分A包括具有生物学功能，特别是具有结合功能的蛋白质或者蛋白质片段，并且成分B包括将具有生物学功能的重组融合蛋白的二聚体、三聚体、四聚体或五聚体二聚或寡聚而没有第三分子的作用或者将融合蛋白聚集成二聚体或多聚体并且同时将这些二聚体或多聚体结合成二聚物或寡聚物而没有第三分子的作用的蛋白质或者蛋白质片段。
在本发明的说明中将术语二聚体、三聚体、四聚体或五聚体概括为多聚体，并且要理解为两个、三个、四个或五个结合的多肽(蛋白质)的蛋白质复合体。相反，将下面较高级的聚集体，即，两个或多个上面意义的二聚体、三聚体、四聚体或五聚体的聚集称为二聚物或寡聚物。具有生物学功能的蛋白质或蛋白质片段(融合蛋白中的成分A)特别是指具有配体功能的蛋白质，特别是对于抗体或受体具有配体功能的蛋白质(即作为结合配偶体与一个或多个分子发生相互作用)、修饰的氨基酸序列，例如经共价或非共价偶联活性化合物(可能是有机化学性质)的氨基酸序列、具有互补位的抗体或抗体片段或者甚至是激素，例如肽激素。特别地，本发明涉及作为融合蛋白中成分A的信号蛋白的氨基酸序列，其作为单体已经是生物活性的了，并且其作用因为作为根据本发明的复合体中的成分而提高，或者其只有通过根据本发明引发的多聚或寡聚或者通过只有根据本发明才引发的寡聚才变得有活性(只要成分A已经以三聚体存在)。关于生理学膜-结合信号蛋白，例如，关于TNF细胞因子，优选含有膜外，特别是胞外蛋白质片段的裂解产物。但是也可以使用作为抗原发挥功能的氨基酸序列作为重组融合蛋白中的成分A。最后，受体，例如来自TNF受体家族的受体，例如属于I型膜蛋白家族(例如FasR)，或者这样的受体的片段或衍生物，也可以用作成分A，其也具有结合功能(即作为结合配偶体与另一种分子相互作用)，因此属于本发明意义上的术语“配体”。如果在患者中存在非生理性高浓度的互补生物学配体，则这些类型的有结合能力的生物受体片段特别适合用作药物。
在优选实施方案中，成分A可以具有在根据本发明的寡聚物中存在的多聚体，即二聚体、三聚体、四聚体或五聚体，相同的成分A(同二聚体或同多聚体的寡聚物)或者不相同的成分A(异二聚体或异多聚体的寡聚物)。该方法中，具有不同的成分A、任选具有不同的生物学功能的蛋白质可与本发明的寡聚物的二聚体或多聚体连接。在二聚物或寡聚物中聚集的杂二聚体或杂多聚体各也可以是相同的或不同的，即根据本发明的二聚物或寡聚物也可以由不同的杂二聚体或杂寡聚体组成。
然而也可能的是，作为二聚物或寡聚物的亚单元的各二聚体或多聚体中的融合蛋白是相同的，而作为二聚体或多聚体排列的在二聚物或寡聚物中的各亚单元是不同的(同二聚体、同三聚体、同四聚体或同五聚体的杂二聚物或杂寡聚物)。用这种方法，例如，根据本发明的三聚体的六聚物中可以缔合最多6个同三聚体，这些同三聚体就成分A来说是不同的。用这种方法，通过选择、排列、特定组合和/或通过二聚物或寡聚物中成分A的数目一般可以精确调节生物学活性。已知某些生物学作用只有通过至少两个配体(生物学意义，不是本发明扩展的意义)的共同相互作用才能带来期望的生物学影响，例如细胞激活。例如针对作为T-细胞或B-细胞激活剂的作用与某些白细胞介素组合是值得追求的。根据本发明，在根据本发明的复合体中可以排列只有在组合中才有效的该类型效应子。然而，可想象提供例如就各成分A来说含有不同类型的寡聚物的组合物。
在另一个优选的实施方案中，重组融合蛋白中的成分A是肽激素、生长因子、细胞因子、白细胞介素或它们的片段，优选有结合能力的片段。但是，上述肽和/或蛋白质的功能衍生物也可以用作重组融合蛋白中的成分A，其是根据本发明的寡聚物的组成成分。
特别是将保持生物学功能但是同时与相应的天然序列具有序列差异的蛋白质描述为生物活性蛋白质、蛋白质片段或肽的功能衍生物。这种序列偏差可以是一处或多处插入、缺失或取代，其中优选至少70％序列同源性，而使用的衍生物和天然序列之间至少85％的序列同源性是特别优选的。特别是那些与生理序列相比具有保守型取代的氨基酸序列属于术语“功能衍生物”。保守型取代是其中同类氨基酸中的一个取代另一个的那些取代。特别有带脂肪族侧链的氨基酸、带正电荷或负电荷侧链的氨基酸、侧链中有芳香基团的氨基酸或者其侧链可以参与形成氢键的例如带有羟基官能团侧链的氨基酸。这意味着，例如，带极性侧链的氨基酸被也带极性侧链的另一个氨基酸置换，或者，例如，特征在于疏水侧链的氨基酸被也具有疏水侧链的另一个氨基酸取代(例如丝氨酸(苏氨酸)被苏氨酸(丝氨酸)取代，或者，亮氨酸(异亮氨酸)被异亮氨酸(亮氨酸)取代)。
根据本发明，配体应理解为是参与结合反应的所有的分子。因此，配体可以是通常描述为受体的蛋白质。如果其结合信号分子，则这种类型的受体也是本发明意义上的“配体”。
本发明中，优选重组融合蛋白的三聚体的寡聚物，特别是三聚体的三聚物或四聚物(3×3或4×3)或者三聚体的六聚物(6×3)。
当重组融合蛋白中的成分A是TNF细胞因子家族的细胞因子、该类型TNF细胞因子的片段或者TNF细胞因子的功能衍生物或者相应的TNF细胞因子片段的功能衍生物时，特别优选重组融合蛋白的二聚体、三聚体、四聚体或五聚体的二聚物或寡聚物。这里使用的TNF细胞因子在细胞中通过与相应的受体结合能够产生例如编程性细胞死亡、增殖或激活作用。在非穷指的名单中，特别考虑蛋白质CD40L、FasL、TRAIL、TNF、CD30L、OX40L、RANKL、TWEAK、Lta、Ltab2、LIGHT、CD27L、41-BB、GITRL、APRIL、EDA、VEGI和BAFF可以用作TNF细胞因子。对此，上述膜-结合的TNF-细胞因子的胞外片段或者其功能衍生物优选用作重组融合蛋白中的成分A。当它们各自的生物学功能，特别是它们结合各自受体的能力得以保留时，这些裂解产物是特别优选的。上述TNF-细胞因子或者TNF-细胞因子的片段在上述意义中的功能衍生物也可以用作融合蛋白的成分A。在特别优选的实施方案中，重组融合蛋白的成分A选自hFasL(AA 139-261)，hTRAIL(AA 95-281)，hCD40L(AA 116-261)和m或hTNFα(AA 77-235)。
另外，在优选的实施方案中，受体(膜-结合的或胞内的受体)，特别是TNF细胞因子家族蛋白质的受体，特别是上述TNF细胞因子的生理受体或者受体片段或者受体衍生物用作重组融合蛋白中的成分A。在受体片段用作成分A的情况下，其特别是生理学膜外排列的这些类型受体的生理蛋白质序列的片段。这里特别考虑这些类型受体的胞外片段。例如，根据本发明，受体，特别是结合TNF细胞因子家族的细胞因子的受体的结合域(例如FasR、CD30、CD40、GITR、TNF-R1和/或TNF-R2)可以负载在二聚免疫球蛋白(二聚Fc-片段)上，并且这些二聚体可以再通过成分B，例如具有将二聚体或多聚体二聚或寡聚能力的胶原蛋白样片段，二聚或寡聚成根据本发明的二聚物或寡聚物复合体。为此目的，例如，可以考虑二聚体或多聚体的四聚物(例如通过ACRP30的四聚片段)、二聚体或多聚体的五聚物(例如通过用作成分B的来自COMP复合体的单体的相应的序列片段)，或者甚至二聚体或多聚体的六聚物(例如通过Clq复合体的单体的六聚片段)。
因此，本发明给出下面的可能性：要成为根据本发明的寡聚物的组成成分的用于重组融合蛋白所选择的成分A已经作为二聚体或多聚体存在于溶液中。这种情况下，成分B只会增强成分A的二聚或多聚，并主要导致重组融合蛋白的二聚或寡聚。例如，如果作为成分A，在溶液中一般已经三聚合的至少一种TNF配体或者TNF配体的片段或衍生物应作为融合蛋白的成分被寡聚，则发现这种情况。但是，在成分A在溶液中不表现出表面相互作用介导的二聚或多聚的情况下，根据本发明，成分B不仅一定要保证成分A的二聚或多聚，而且还要保证二聚或多聚的重组融合蛋白的二聚或寡聚。对于例如受体或者其片段形成重组融合蛋白中的成分A的情况这一般是必须的。
在本发明的范围内，公开了重组融合蛋白的二聚体、三聚体、四聚体或五聚体的二聚物或寡聚物，其中成分A优选是抗原或者抗原的片段。符合期望的是使用来自病毒、细菌或原生动物病原体的抗原。这些可以是任何典型的病原体抗原，例如，蛋白质片段和/或特定碳水化合物结构，但是它们一般是各病原体的表面抗原或者也表现出抗原性质的病原体表面蛋白质的片段。例如，可以使用下面可以接受的非穷指例子：血细胞凝集素、神经氨酸酶、PreS1、PreS2、HBs-抗原、gp120、gp41或者甚至某些典型的肿瘤抗原。
在优选的实施方案中，重组融合蛋白中的成分A也可以是适合作为受体激动剂或受体拮抗剂的载体的氨基酸序列。例如，作为药理活性物质的小的有机化学分子一般可以通过共价键与该类型氨基酸序列偶联，例如通过醚键与苏氨酸或丝氨酸偶联，通过类酰胺键或者通过酯键偶联。通过本发明，可以获得各自连接受体激动剂或受体拮抗剂的例如18个融合蛋白的大的寡聚物复合体(例如3×6融合蛋白)。用这种方法，有可能实现这些类型的有机化学分子对它们各自的二聚物或寡聚物蛋白质载体上负载的受体的效力或亲合力的可观的改进，例如用作人用药物或兽用药物。
存在于二聚物或寡聚物中的二聚或多聚的重组融合蛋白的成分B一般是Clq蛋白质或Collectine家族的蛋白质。如果只有重组融合蛋白中的它们的二聚/多聚序列或二聚/寡聚序列被转录或翻译，则特别优选的是Clq蛋白质或Collectine家族的蛋白质作为重组融合蛋白的成分，即作为成分B。因此，天然单体的序列中包含的主要是球形的头部结构域(图14)作为翻译产物将不出现在根据本发明的重组融合蛋白中，因此不是该蛋白质中成分B的组成成分。根据本发明的重组融合蛋白中的上述成分B有这样的序列，其一般大多具有重叠的用于二聚/多聚或二聚/寡聚的官能团，因为用作成分B的上述家族蛋白质的胶原蛋白样片段一般参与例如三链螺旋的形成，该三链螺旋又具有与其它三链螺旋形成二聚物或寡聚物结构(例如，例如三链螺旋的四聚体或六聚体)的能力。
因此，一般情况下，多聚和寡聚的融合蛋白具有作为成分B的Clq蛋白质或Collectine家族蛋白质的结构域，它们负责二聚和多聚和/或二聚和寡聚，而其各自的头部结构域被作为成分A、同样具有生物学功能的其它蛋白质或蛋白质片段置换。因此术语“重组融合蛋白”在本发明范围内应理解为至少一种成分A和至少一种成分B被人工融合到重组融合蛋白中，即本发明意义的融合蛋白与天然存在的蛋白质不一致。
Clq家族或Collectine家族蛋白质的功能衍生物，即二聚或寡聚衍生物，或者上述蛋白质的片段的衍生物，也可以用作用于将重组融合蛋白聚集为二聚物或寡聚物的成分B。在这种情况下，例如，成分B将包含下面的蛋白序列：Clq、MBP、SP-A(肺表面活性物质蛋白质A)、SP-D(肺表面活性物质蛋白质D)、BC(牛血清共凝集素)、CL43(牛collectin-43)和/或ACRP30，或者上述蛋白质至少一种的二聚或寡聚片段的序列，或者这些蛋白质的功能衍生物的序列，或者功能衍生物的片段的序列。当重组融合蛋白的成分B是蛋白质Clq或蛋白质ACRP30的蛋白质片段时，特别是人变体或其它哺乳动物变体，更特别是鼠变体时，重组融合蛋白的二聚物或寡聚物是特别优选的，其中该类型的各种蛋白质片段一般不具有天然蛋白质Clq或蛋白质ACRP30的球形头部结构域。
其成分B包含根据图6A(读框序列)或图6B的氨基酸序列或者这个/这些氨基酸序列的功能衍生物和/或这个/这些序列的片段的重组融合蛋白的二聚体、三聚体、四聚体或五聚体的二聚物或寡聚物代表本发明最优选的实施方案。对此，典型地是蛋白质mACRP30(m：鼠)的片段，例如具有18-111个氨基酸，或者是人变体(hACRP30)的片段，例如具有18-108个氨基酸。特别地，根据本发明，可以提供融合蛋白，其成分A和成分B是人源的，以排除在治疗应用期间可能的人的免疫反应。
特别优选的是具有来自不同的宿主生物的序列的那些融合蛋白的二聚体或多聚体的二聚物或寡聚物。如果它们来源于嵌合融合蛋白，则根据本发明的聚集体是最优选的，其中成分A与成分B基于不同类型的动物。如果成分A相当于来自小鼠、大鼠、猪或者其它脊椎动物，特别是来自哺乳动物的氨基酸序列，或者相当于它们的功能衍生物，而成分B是人源的，则是有利的，反之亦然。其成分A相当于来自病毒、细菌或原生动物的序列，与人源的成分B结合，这样的这些融合蛋白质的根据本发明的复合体也是优选的。自然地，根据本发明的融合蛋白中的成分A和成分B的序列也可以来源于相同类型的动物。
在本发明另一优选的实施方案中，通过在重组融合蛋白中作为成分B存在的6个氨基酸以上，优选8至20个氨基酸之间的短氨基酸序列进行融合蛋白的多聚和/或寡聚。不是通过超二级结构而是通过作为二聚体或多聚体在溶液中的表面相互作用已经存在的一般通过该短氨基酸序列实现的融合蛋白的二聚或寡聚优选以二硫桥的形成为基础，这通过重组融合蛋白中的特定氨基酸序列是可能的。这意味着成分B优选具有至少一个半胱氨酸，其在氧化条件下能够与至少一种其它二聚体或多聚体的融合蛋白的至少一个半胱氨酸共价连接。氨基酸序列(单字母代码)VDLEGSTSNGRQCAGIRL是成分B包含8至20个氨基酸的短二聚或寡聚氨基酸序列的优选情况的一个例子。这种18个氨基酸的序列在11位有一个半胱氨酸残基，其可以在二聚体或多聚体之间形成二硫桥。
这些含有18个氨基酸的序列的功能衍生物或片段可以用作成分B。这里要特别提到序列VDLEGSTSNGRQSAGIRL，其中尽管丝氨酸残基取代了11位的半胱氨酸残基，但是其仍然保证融合蛋白多聚体的二聚或寡聚。
在优选的实施方案中融合蛋白可以这样排列，即除了二聚或多聚融合蛋白的二聚或寡聚之外可以形成更高级聚集体，例如通过抗体交联可以再提供包括两个或多个二聚物或寡聚物的这种更高级聚集体。所述抗体定向抗根据本发明的复合体的融合蛋白上的表位，优选抗成分B的表位。但是，除成分A和成分B之外，融合蛋白也可以具有另外的作为交联抗体的抗原的序列片段。在本发明范围内，在该说明书中优选所谓的标记序列(Tag-Sequenzen)，例如Flag标记，换句话说是氨基酸序列DYKDDDDK，或者还有，例如，His-标记(包含几个连续的组氨酸)。
但是，根据本发明特别优选提供通过重组融合蛋白中包含的一个以上成分B的更高级聚集体。因此，优选地，对于形成更高级聚集体，融合蛋白要含有用于形成二聚物或寡聚物的成分B1和另外至少一种一般不同于成分B1的其它成分B(例如成分B2)。在根据本发明的二聚物或寡聚物的至少一种融合蛋白中一定会出现的成分B2确保二聚物或寡聚物交联形成更高级聚集体。例如，成分B1可以是Clq或Collectine蛋白质家族蛋白质的二聚或寡聚片段，而成分B2是形成至少一个二硫桥的具有8个至例如28个氨基酸的序列。在两个不同的寡聚物之间形成至少一个二硫桥的情况下，可以提供根据本发明的更高级聚集体，例如寡聚体的二聚物。
另外，优选的是在成分A和成分B之间插入所谓连接体序列，或者，如果融合蛋白中有几个成分B，则也在至少两个成分B之间插入。这些连接体序列使得重组融合蛋白中不同的功能成分在结构上隔开，并且能够优选也接受“绞合”功能，即代表具有柔顺结构的氨基酸序列。
根据本发明一般性公开二聚物或寡聚物或者更高级聚集体，它们的特征在于提高的生物效能和/或在于对补体蛋白的提高的亲合力。这样，作为本发明的另一个主题，也公开了提高本发明意义的具有配体功能的生物分子或药物的生物效能和/或亲合力的方法。该方法特征在于相应于具有生物学功能的蛋白质或蛋白质片段的至少一种成分A与至少一种二聚或多聚和二聚或寡聚成分B的重组，对此通过重组融合蛋白然后通过多聚和寡聚成二聚体和多聚体的二聚物或寡聚物而二聚或寡聚来实现成分A的生物活性的提高和/或亲合力的提高。当成分A是TNF-细胞因子、TNF-细胞因子片段或者这样一种蛋白质或蛋白质片段的功能衍生物时该方法是最优选的。另一优选的方法是至少一种成分A和至少一种成分B重组成重组融合蛋白，对此至少一种成分A是受体或受体片段，优选TNF-受体的片段。关于根据本发明的这种优选的实施方案，上述二聚物或寡聚物的优选的实施方案同样适用。
本发明的二聚物或寡聚物可以用来制备药物及用于治疗疾病或失调的药物用途，即用于人用或兽用药物。根据本发明由二聚物或寡聚物形成的更高级聚集体也适合用作药物或者用于制备药物。用根据本发明要求保护的二聚物或寡聚物或者用更高级聚集体可以治疗很多种疾病和失调。这种类型的二聚物或寡聚物或者更高级聚集体可以用来制备治疗下面非穷指列出的疾病或失调的药物：超炎症疾病、自身免疫疾病、以超编程性细胞死亡或低编程性细胞死亡反应为基础的疾病、神经变性疾病，但是也用于治疗传染病、肿瘤和/或内分泌失调。关于传染病，对于细菌或原生动物感染，特别是对病毒感染，可使用二聚物和寡聚物，这里特别优选抗体或携带抗原互补位的抗体片段作为重组融合蛋白中的成分A。例如用在用于治疗和/或制备用于治疗肿瘤特别是淋巴系统肿瘤的药物所必需的生物活性细胞因子进行治疗疾病的情况下，二聚物或寡聚物或者更高级聚集体是特别适合的。
另外，根据本发明的二聚物或寡聚物也用作疫苗或者用于制备用于抗传染病的主动免疫或被动免疫的疫苗。在主动免疫的情况下，适合接种的抗原用作重组融合蛋白中的成分A。对此，尤其可以使用细菌、病毒或原生动物，例如疟原虫或锥体虫的表面抗原或表面抗原片段。非穷指地列出，可以使用含有这些的二聚物或寡聚物或者更高级聚集体的疫苗，其中重组融合蛋白具有至少一种成分A，换句话说，一种或多种病原体的相同或不同的抗原，用于接种以抵抗风疹、麻疹、脊髓灰质炎、狂犬病，破伤风、白喉、BCG、疟疾、黄热病、HIV或流感，例如鼻病毒。二聚物或寡聚物或者从二聚物或寡聚物形成的更高级聚集体中不同抗原的复合根据本发明也是可能的，其中来自相同病原体的不同的抗原可以在二聚物或寡聚物中复合，或者来自两种或多种病原体的抗原可以在二聚物或寡聚物或者更高级聚集体中复合。对此典型地，融合蛋白中可以含有两种或多种成分A1、A2至AX，其然后是根据本发明的二聚物或寡聚物或者更高级聚集体的成分，或者可以通过至少一种成分B将涉及至少一种成分A的两种或多种不同的融合蛋白复合到二聚物或寡聚物或者更高级聚集体中。
优选地，用作药物或者作为疫苗或者用于它们的制备的组合物中可以含有根据本发明的至少两种不同的二聚物或寡聚物类型。
在根据本发明的另一个实施方案中，根据本发明的融合蛋白中的成分A是免疫调节剂，例如白细胞介素(IL)，特别是IL-2。
另外，在本发明的范围内也公开了根据本发明的二聚物或寡聚物用作免疫和/或接种佐剂的用途。已知很多抗原用于免疫只对试验的人触发不令人满意的免疫反应。佐剂的任务就是提高免疫原作用。这种类型的佐剂可以用作根据本发明的融合蛋白中的成分A，因此作为根据本发明的二聚物或寡聚物的组成成分。例如，成分A可以含有来自CD40-配体(CD40L)的氨基酸序列，或者白细胞介素例如白细胞介素1-12之一的序列或序列片段。CD40L的生理任务是控制静止的B细胞向细胞周期的转化。白细胞介素，例如IL-4、IL-5、IL-6和/或CD40L可以在根据本发明的二聚或寡聚复合体中复合(二聚物或寡聚物中不同的重组融合蛋白)，或者它们也可以作为一种组合物成份出现(至少两种不同类型的二聚物或寡聚物，每一种都可以由相同或不同的融合蛋白构成)，该组合物除了免疫原外，一般还含有至少一种，优选两种或多种不同类型的根据本发明的二聚物或寡聚物的组合物。
这种类型组合物的二聚物或寡聚物或者更高级聚集体可以由关于成分A是相同或不同的融合蛋白组成。对此，各自具有共同刺激特征和/或激活免疫系统(细胞或体液免疫应答)特征的生理序列可以作为成分A。这些可以是生理化合物或合成化合物。对此，也公开了除一种或多种免疫原外还含有一种或多种根据本发明的二聚物或寡聚物类型的组合物，其中优选如此排列本发明的二聚物或寡聚物类型使得该类型二聚或寡聚复合体中包含一种以上免疫调节剂/免疫调节剂佐剂，换句话说，存在杂二聚物或杂寡聚物。如果需要，本发明的杂二聚物或杂寡聚物可以既联合作为成分A的具有免疫原的一种或多种融合蛋白，还可以联合作为成分A的具有佐剂成分例如CD40L的至少一种融合蛋白。在根据本发明的杂寡聚物中也可接受各自带有不同的佐剂或免疫调节成分的两种或多种融合蛋白。对此，本发明也公开了这些类型的同寡聚物或杂寡聚物或者含有至少一种类型的根据本发明的同寡聚物或杂寡聚物的组合物在人用药物或兽药中作为药物或疫苗的用途。
在本发明的范围内，优选使用二聚物或寡聚物来制备以适合肠胃外施用，即，例如，皮下、肌内或静脉内施用，或者甚至口服或鼻内施用这样的方式给药的药物以及用于治疗上述疾病或失调。施用这些作为疫苗或者制备疫苗的基础的二聚物或寡聚物或聚集体也优选以肠胃外形式或口服形式，但是如果需要，也可以鼻内施用。
根据本发明的二聚物或寡聚物和/或更高级聚集体可以单独用作药物或者可以用于药物的制备。但是，它们也可以和作为药物的其它活性物质成分结合使用。根据本发明的二聚物或寡聚物和/或更高级聚集体也可以与药学可接受载体、助剂或添加剂组合。合适的制备途经公开于“Remington’s Pharmaceutical Sciences”(Mack.Pub.Co.，Easton，PA，1980)，这是本发明的公开内容的一部分。可以用于肠胃外施用的载体材料的例子是无菌水、无菌氯化钠溶液、聚亚烷基二醇、氢化萘和特别是生物相容的交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或者聚氧乙烯/聚氧丙稀共聚物。
根据本发明的二聚物或寡聚物或者相应的更高级聚集体优选也可以在体外诊断领域使用，或者，例如，用于生物化学纯化方法。可考虑将这些根据本发明的二聚物或寡聚物和/或更高级聚集体用于纯化柱，纯化柱可以装填这些类型的复合体。因此，在本发明的范围内，也公开了这些类型的复合体用于检测目的的用途。
另外，在本发明的范围内，公开了制备特异性结合的蛋白质的制备方法，由于它们的相互作用发生于蛋白质表面，并因此在溶液中以二聚或多聚形式存在。特别是在使用在溶液中三聚的TNF细胞因子，或者优选地在使用该类型细胞因子的可溶性片段的情况下，预计以确定化学计量的以纯的级分提供。在能够相互结合的不同蛋白质，例如三种不同的TNF细胞因子或者这样的TNF细胞因子的不同的片段的简单共同表达情况下，在表达之后结合的三聚体中发现共同表达的蛋白质的可能的统计学分布，换句话说，例如，来自蛋白质P1、P2和P3的期望的三聚体，还有来自两个蛋白质P1和一个蛋白质P3的三聚体等。
为了获得确定的期望的杂多聚体，例如TNF细胞因子的杂三聚体或者该类型TNF细胞因子的片段，可以根据本发明方法使用根据本发明的寡聚物。为此目的，构建不同的融合蛋白并且优选在宿主细胞中表达。这里表达的融合蛋白具有从杂多聚体，例如由三个不相同链形成的杂三聚体形成同寡聚物的蛋白质作为成分B的序列片段，其中相同的三聚体二聚或寡聚。优选地，融合蛋白中的这些成分B相应于来自补体或Collectine家族的蛋白质，例如Clq的序列片段，其形成杂三聚体的同六聚物。因此，在融合蛋白中，将为使杂多聚体中的链多聚提供的天然蛋白质的序列片段作为成分B与成分A例如TNF细胞因子结合，而其它融合蛋白(应出现在杂三聚体中)各自具有使另一种成分A，例如另一种TNF细胞因子或者其片段，与另一种用于杂多聚的天然蛋白质例如Clq蛋白质中存在的序列片段，的化合作用。
优选在宿主细胞中表达能够形成杂多聚体的不同的融合蛋白。该杂多聚体化合成同多聚体，因为成分B只能将相同的杂多聚体寡聚。根据本发明，例如，能够表达三种不同的融合蛋白，每一种具有不同的成分A，换句话说，优选不同的TNF细胞因子，它们各自或者与多聚或者与寡聚的Clq的α、β或γ链化合。然后在结合的寡聚物中只发现带有所有三种TNF细胞因子的杂多聚体。相反，没有发现不同化学计量的其它杂多聚体。因此，根据本发明，仅通过选择融合蛋白，可以获得一种产物，其化学计量是特定的并且不是统计学分布的。
另外，优选的是使用这样的融合蛋白或方法以获得给定化学计量在成分A和成分B之间具有连接体的杂多聚体。如果允许连接体包含至少一个酶切位点，那么最优选连接体将(杂多聚体的)同寡聚物复合体的成分A与成分B分开。用这种方法获得一种级分，其仅由期望的杂多聚体组成，例如，来自三个不同的TNF细胞因子的杂三聚体。连接体中的酶解位点优选是凝血酶共有序列。
作为本发明的另一个目的，这里描述了融合蛋白，其适合将二聚体或多聚体二聚或寡聚，只要重组融合蛋白含有至少一种成分A和至少一种成分B，其中成分A含有具有生物学功能，特别是对于抗体或受体的配体功能的蛋白质或者蛋白质片段或者含有抗体或者抗体的片段，而成分B含有选自Clq蛋白质或Collectine家族蛋白质的这样的片段的二聚或多聚和二聚或寡聚片段或者其功能衍生物。如果重组融合蛋白中的成分B含有蛋白Clq、SP-A、SP-D、BC、CL43和ACRP30的多聚和/或寡聚片段，则特别优选这些类型的蛋白质。在本发明的范围内也可以使用上述蛋白质的这样的片段的功能衍生物。在这种情况下，融合蛋白一般除了含有具有生物学功能的成分A外还含有只负责聚集前述蛋白质的片段但是优选不是球形“头部”结构域的成分B。
含有特别是哺乳动物变体，更特别是人变体的配体EDA的寡聚胶原蛋白结构域的氨基酸序列，或者这样的结构域的寡聚片段或其功能衍生物的氨基酸序列的序列也优选考虑作为根据本发明的融合蛋白的成分B。甚至更优选地，可以使用含有人EDA蛋白质的氨基酸160-242或功能衍生物例如一个片段的序列片段作为成分B。优选地，可应用的是六聚体。
本发明的另一个目的是编码上述类型融合蛋白的DNA序列。在表达载体中表达该类型DNA序列，其中相应的包含根据本发明的融合蛋白的DNA序列的表达载体也是本发明的主题。
另外，用编码根据本发明的融合蛋白的DNA序列转染的宿主细胞也属于本发明。本发明特别优选的是用表达载体转染的宿主细胞，其中所述表达载体又包含编码根据本发明的融合蛋白的DNA序列。
本发明的另一个目的是受体，特别是结合以二聚或多聚的TNF细胞因子家族的信号分子配体的受体。例如，这种受体、受体的衍生物或者受体的片段或者衍生物的片段，特别是包括受体的胞外结构域的片段(对此优选结合结构域)可以作为融合蛋白的成分A，该融合蛋白是二聚体或多聚体的组成成分。通过与免疫球蛋白特别是Fc-片段的片段重组可以实现二聚，而例如在与相应的蛋白质的多聚结构域重组之后可以实现多聚。为此目的，通过形成超二级结构例如绕线式螺旋，或者一般的胶原蛋白样三链螺旋(例如CMP、COMP、胶原蛋白、层粘连蛋白)产生二聚体或多聚体的所有的蛋白质的序列片段都是合适的。来自Clq-家族或Collectine的蛋白质的片段一般也适合受体或受体片段的二聚或多聚。例如，通过与相应的COMP的五聚合结构域重组可以将TNF受体家族成员的胞外片段例如作为五聚体形式的成分A的Fas受体(FasR)表达为成分B。这里可以是具有受体或受体片段的融合蛋白的同二聚体、杂二聚体或杂多聚体。
这些带有包含受体或受体片段的成分A的重组蛋白的二聚体或多聚体也可以作为药物或者用于制备药物。如果在疾病症状中存在相应的受体配体的增大的胞外浓度，则它们特别有用。在这种情况下也涉及细胞上膜-结合信号分子，例如TNF细胞因子本身或者可溶性信号分子的增大的浓度。但是，如果应通过使用根据本发明的捕获信号分子并且由包含受体或者受体片段作为成分A的融合蛋白组成的异源可溶性二聚体或多聚体阻止或降低一般相应的膜-结合受体上触发的信号传导链的激活，则基本上这种多聚体的用途也总是期望的。
利用下面的附图详细解释本发明：
图1是根据本发明的寡聚物(FasL-六聚物)，换句话说三聚体的二聚物中存在的根据本发明的重组融合蛋白(2)的单字母代码氨基酸序列。将hFasL的序列片段(AS 103或139至281)称为成分A，而具有序列VDLEGSTSNGRQCAGIRL的特定(结果二聚的)连接体作为成分B。图1还包含重组融合蛋白(1)的氨基酸序列，其根据现有技术状态只表现为FasL三聚体的成分，换句话说不具有此处的多聚体，在这里是三聚体二聚或寡聚的成分B。图1中标出两个融合蛋白(1)和(2)的重组片段，序列上方详细说明它们各自的功能。
图2包括图2A中在还原(r)和非还原(nr)条件下，带有特定连接体序列(成分B)的根据本发明的融合蛋白(2)的凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果。在非还原条件下，在溶液中，寡聚物洗脱为根据本发明的6个多肽的天然复合体(融合蛋白(2))，因为根据本发明在根据本发明的两个融合蛋白(2)(其各为不同的三聚体的组成成份)的成份B之间形成一个二硫桥。因此，结果是根据本发明的寡聚物是分子量相当于根据本发明的单体形式的融合蛋白(2)的分子量的6倍的Fa sL六聚体。如果存在变性条件(例如在SDS-PAGE上)，在没有还原剂存在下融合蛋白作为二聚体迁移，是两个单体之间的二硫桥的形成引起的。相反，在还原和变性条件下，根据本发明的融合蛋白(2)的单体在SDS凝胶中迁移。图2B示出和图1中所示一样，为根据本发明的融合蛋白(2)的根据本发明的寡聚物，这里是三聚体的二聚物。
图3是对于A20细胞或者Jurkat细胞，在存在(■，▲)或者不存在(□，△)抗-Flag M2抗体下，根据FasL三聚体(根据现有技术的三种融合蛋白的三聚体，例如，根据图1的不具有成分B的融合蛋白(1))的浓度，或者图2B图示的根据本发明的FasL二聚物(作为三聚体的二聚物的六聚体)的浓度的细胞毒性测试结果。490nm处的光密度是细胞生存力的量度(高光密度相应于加入的物质的低编程性细胞死亡作用，因此是高细胞存活率)。根据本发明的三聚体的FasL二聚物(六聚体)对A20细胞(图3A和3B)和对Jurkat细胞(图3C和3D)的编程性细胞死亡作用相对于没有二聚或寡聚成分B的融合蛋白的FasL三聚体的作用提高了3-10倍(现有技术，图3A和3C，各种情况下以□表示)。对于另外加入定向抗图1所示融合蛋白(1)和(2)的Flag序列，并且通过交联也进一步提高例如根据本发明的融合蛋白的寡聚程度的抗-Flag抗体，在所有的试验中提高了编程性细胞死亡作用(图3A至3D，分别是■或▲)。
图4给出考虑特定连接体部分(融合蛋白(3)的成分B)(“超FasL”)中(C→S)取代作用的根据本发明的融合蛋白(3)的氨基酸序列。其余参见图1的说明。凝胶试验证明“超FasL”在溶液中是根据本发明的二聚形式作为六聚体存在。在SDS-PAGE上变性条件下，即使不存在还原剂情况下，根据本发明的融合蛋白(3)作为单体迁移，因为由于氨基酸取代作用C→S在连接体部分不能形成二硫桥。
与图3类似，图5说明存在(●)或者不存在(○)抗-Flag M2抗体下，在如图4所示的(“超FasL”)根据本发明的融合蛋白(3)的根据本发明的聚集体加入之后A20细胞(图5B)或Jurkat细胞(图5D)的存活率。根据本发明的融合蛋白(3)带来编程性细胞死亡作用，其比用作比较的根据现有技术的没有二聚或寡聚成分B的FasL三聚体的作用(图3A(A20细胞)和图3C(Jurkat细胞))大约强至少1000倍。与没有抗Flag抗体的试验相比，通过将“超FasL”进一步寡聚为根据本发明的更高级聚集体，加入抗-Flag M2抗体(●)对A20和Jurkat细胞都能稍微提高编程性细胞死亡活性，大约2倍，优选至少1.5倍(图5B和5D)。其结果是通过根据本发明用作成分B的融合蛋白(3)的特定连接体产生的寡聚程度(这里作为三聚体的二聚物)对于任选通过细胞表面上的寡聚作用触发编程性细胞死亡已经几乎是最适宜的，并且利用根据本发明的更高级聚集体还能够稍微提高。
图6A给出根据本发明的融合蛋白(4)FasL-ACRP30的氨基酸序列，其中该融合蛋白(4)(从N至C末端)的序列具有Flag序列、作为成分B的连接体序列、蛋白质mACRP30(m：鼠)的氨基酸18-111、连接体LQ和接着作为成分A的hFasL的氨基酸139-281。
图6B给出另一种融合蛋白。其包括人ACRP30配体(hCRP30，具有氨基酸18-111)的胶原蛋白结构域，其中其N-末端融合Flag标记(DYKDDDDK)并且其C-末端融合人FasL的胞外结构域(AS139-281)。在hACRP30的C-末端和hFasL之间插入连接体序列(MHVD)，同样在Flag标记和hACRP30的N-末端之间插入连接体(GPGQVQLQ)。所有的上述描述都用氨基酸的单字母代码。
图6C说明在加入抗-Flag抗体M2(+)和没有加入抗-Flag抗体M2(-)下，一方面用FasL另一方面用融合蛋白hACRP30/FasL对Jurkat-T-细胞滴定结果的曲线。因此向Jurkat-T-细胞中加入用FasL或hACRP30/FasL瞬时转染并且表达这些蛋白质的293-细胞的上清液(OPTIMEM)。图6C的X轴给出下面的实验中使用的递减的浓度，并且通过在别处描述的标准细胞毒性测试测定了Jurkat-T-细胞各自的存活率。从图中清楚地看到，没有交联的M2抗体的FasL是失活的(◆)，并且只有M2抗体的交联作用才引起细胞毒性作用。与此相反，不加入M2抗体(▲)，根据本发明的融合蛋白，即hACRP30/FasL已显示出相应的作用。加入M2抗体基本上不提高根据本发明的融合蛋白的作用。
与图3类似，图7说明在存在(▲)或者不存在(△)抗-Flag M2抗体的下，加入不能二聚或者寡聚的FasL三聚体(以根据图1；图7A的融合蛋白(1)为基础的对比实验)和加入按照图6A的根据本发明的融合蛋白(4)的根据本发明的寡聚物，这里是三聚体的四聚物，换句话说是十二聚体，之后，BJAB细胞的存活率。在通过与Flag序列(图7A，(△))结合而寡聚的抗体不存在的情况下不是根据本发明的FasL三聚体对BJAB细胞不产生编程性细胞死亡作用的同时，融合蛋白(4)的根据本发明的十二聚体(三聚体的四聚物)在大约10ng/ml的浓度下就已经诱导细胞死亡(K50＝8ng/ml)(图7B)。这可以通过490nm处OD的减小而十分清楚地看到。通过向由根据本发明的FasL-ACRP30融合蛋白组成的根据本发明的十二聚体的组合物中加入抗-Flag M2抗体，可以稍微提高这种编程性细胞死亡活性，即根据本发明的十二聚体代表就编程性细胞死亡活性来说事实上最适宜的聚集状态。相反，通过相应的抗体触发的进一步聚集为更高级聚集体不能带来任何进一步的显著的生物效果。
图8给出与包含作为成分B的ACRP30的寡聚结构域(AS18-111)结合的作为成分A的hTRAIL的氨基酸95-281的根据本发明的融合蛋白(5)的氨基酸序列(TRAIL-ACRP30)。因此，根据本发明，融合蛋白(5)在溶液中是以一种寡聚物，即是三聚体的四聚物存在。
图9说明存在(▲)或者不存在(△)抗-Flag M2抗体的情况下，加入根据现有技术没有二聚或寡聚能力的TRAIL三聚体(在N-末端具有Flag序列和人TRAIL的氨基酸95-281的融合蛋白)(对比实验，图9A)之后，和加入根据本发明的融合蛋白(5)的根据本发明的十二聚体TRAIL-ACRP30之后，Jurkat细胞的存活率。图9中实验的观察相应于图7中所示的发现。在不存在通过与Flag序列结合而寡聚的抗体的情况下，TRAIL三聚体对Jurkat细胞不产生编程性细胞死亡作用(图9A，(△))的同时，融合蛋白(5)的根据本发明的十二聚体在大约100ng/ml的浓度(≈K50)下也在该实验中诱导细胞死亡(图9B，(△))。此外，联合附加TRAIL十二聚体和抗Flag抗体可从根据本发明的寡聚物通过进一步提高寡聚程度形成其根据本发明的更高级聚集体，它在这种情况下具有提高了(至少10倍)的诱导编程性细胞死亡的活性(图9B，(▲))。
图10给出与包含作为成分B的mACRP30的寡聚结构域(AS 18-111)和在N-末端具有连接体的Flag序列结合的作为成分A的mTNFα(m：鼠)的氨基酸77-235的根据本发明的融合蛋白(6)的氨基酸序列(TNFα-ACRP30)。这意味着，融合蛋白(6)在溶液中是以一种十二聚体，即多聚体(四聚体)的寡聚物(三聚体)存在。
图11说明细胞增殖实验的结果。测定了作为没有成分B的根据现有技术的融合蛋白的三聚体(N-末端具有来自鼠TNFα的氨基酸77-235的Flag和连接体序列)的浓度函数的对小鼠CT6细胞掺入3[H]-胸苷的CT6细胞的细胞增殖的数值，即测定了mTNFα三聚体(图11A)的、或者根据图10的根据本发明的融合蛋白(6)的十二聚体(4×3)的、mTNFα-ACRP30(图11B)的数值。以每分钟计数(cpm)表示3[H]-胸苷掺入量。该实验在存在(▲)或者不存在(△)抗-FlagM2抗体的下进行。这里现有技术已知的mTNFα的三聚体在与TNF受体2(TNF-R2)结合之后对CT6细胞只是稍微具有增殖作用(图11A)。只有在加入抗-Flag抗体(▲)之后通过其交联因此而发生寡聚作用之后才观察到显著提高的增殖作用。
与此相反，在图11B中，根据本发明的三聚体寡聚物，这里是根据本发明的融合蛋白(6)的十二聚物，表现出在5ng/ml(△)就已经观察到强增殖作用。相反，作为参照的交联抗-Flag抗体和根据本发明的十二聚物的结合(▲)与只加入根据本发明的十二聚物的结果相比，只带来增殖作用的稍微增加。从这可以看出，根据本发明的寡聚物，这里是十二聚物形式，已经产生几乎最适宜的增殖作用。
图12给出了包含与作为B的ACRP30的寡聚结构域(AS 18-111)结合的作为成分A的hCD40L(h：人)的氨基酸116-261的根据本发明的融合蛋白(7)的氨基酸序列(CD40L-ACRP30)。
图13和图11的方式完全一样，给出细胞增殖实验的结果。但是，在这种情况下，与图11相反，使用了人PBL(外周血淋巴细胞)。该图给出与如图12所示的根据本发明的融合蛋白(7)的根据本发明的十二聚体(CD40L-ACRP30)的作用(图13B)相比较的在溶液中呈三聚体形式的(Flag和连接体序列，如图12所示，具有接着的没有寡聚成分B的hCD40L的AS 16-261的序列；图13A)的传统CD40L对细胞增殖的作用。在没有(△)抗-Flag M2抗体存在下进行的实验表明，CD40L三聚体几乎没有增殖作用，而在图13B中，用低得多的浓度的hCD40L就已经能够检测到响应的增殖作用。在图13B中，X轴表示“1/稀释度”的变量，换句话说，不是绝对的浓度，因为加入的是其绝对浓度是未知的浓缩上清液。作为参照的交联的抗-Flag抗体和根据本发明的融合蛋白(7)的十二聚体的结合(▲)可通过形成更高级聚集体而产生相应的增殖作用的进一步向低浓度的迁移。
图14图示给出寡聚的多聚体的结构。图14A和14B图示表明出现具有它们原来天然寡聚结构的天然“束状蛋白”(图14A：形成补体蛋白Clq的头部结构域三聚体的六聚物；图14B：形成通过脂肪细胞产生的血清蛋白质ACRP30的头部结构域三聚体的四聚物)。对此，在Clq或ACRP30复合体中的天然单体的头部区域被多聚和寡聚。在从三个不同的基因产物形成Clq寡聚复合体的同时，ACRP30寡聚复合体是同十二聚体，即相同的多聚和寡聚基因产物。以上述天然寡聚复合体为基础的各多肽链各自具有头部区域，能够形成胶原蛋白三链螺旋的序列片段，和能够分别将6个(Clq复合体)或4个(ACRP30复合体)胶原蛋白三链螺旋寡聚为18或12单体的螺旋束的序列片段。
图14C是具有四个三聚TNF配体(例如TNF配体FasL)或者TNF配体的片段作为成分A的根据本发明的融合蛋白的根据本发明的寡聚多聚体(例如如图6所示融合蛋白(4)，FasL-ACRP30的寡聚多聚体)的示意图，所述成分A通过作为成分B的ACRP30蛋白质的胶原蛋白样序列片段寡聚成根据本发明的同十二聚体，其存在于例如根据本发明的融合蛋白中。
图15A描述了根据本发明的另一种的融合蛋白即hEDA/FasL的结构。这里，人EDA的胶原蛋白结构域(氨基酸160-242)作为成分B，Flag表位通过连接体与成分BN-末端融合，在图15A中FasL(AS139-281，即FasL的胞外结构域或者其片段)作为成分A也是通过连接体与成分B的C-末端偶联。根据本发明的融合蛋白hEDA/FasL以六聚体2×3单元存在。EDA蛋白质是TNF家族的另一个成员，其除跨膜结构域和TNF结构域之外也具有胶原蛋白结构域(上面图15A)，并且包括其人形式的391个AS。
图15B说明使用根据本发明的融合蛋白hBDA/FasL的研究。对于制备该融合蛋白，最初通过相应的引物扩增人EDA(AS160-242)的胶原蛋白结构域，然后分别在N-和C-末端融合相应的序列Flag和人FasL的胞外结构域(AS 139-281)。图15B表示加入抗-Flag M2抗体和不加入抗-Flag M2抗体下，一方面用FasL和另一方面用hEDA/FasL对Jurkat T细胞滴定得到的曲线。因此向Jurkat T-细胞中加入用FasL或hEDA/FasL瞬时转染并且表达这些蛋白质的293-细胞的上清液(OPTIMEM)。图15B的X轴给出相继的实验中使用的所述蛋白的递减的浓度，并且通过在别处描述的标准细胞毒性测试测定了Jurkat T-细胞各自的存活率。从图中清楚地看到，没有交联的M2抗体的FasL是失活的(□)，并且在这种情况下只有M2抗体的交联作用才引起细胞毒性作用(■)。与此相反，根据本发明的融合蛋白即hEDA/FasL不加入M2抗体(○)已达到了相应的作用。在这种情况下，加入M2抗体仍然能够提高根据本发明的融合蛋白的作用(●)。
通过下面的实施例更详细地解释本发明：
只要是有关的并且不相应于上述公开的修饰，那么下面的实验(a)至(f)涉及下列6个实施例：
(a)用于FasL-、TRAIL-、TNFα-和CD40L-融合蛋白的载体的构建
在其中缺失720-769碱基(PS038)的修饰的PCRIII载体(InVitrogen，NV Leek，Netherlands)的限制性位点HindIII和BamHI之间克隆编码血细胞凝集素信号肽的DNA片段，包括5’-区中没有翻译的序列(CAA AAC ATG GCT ATC ATC TAC CTC ATC CTC CTG TTCACC GCT GTG CGG GGC)的6个碱基和Flag表位(GAT TAC AAA GACGAT GAC GAT AAA)、连接体(GGA CCC GGA CAG GTG CAG)、限制性位点PstI、SalI、XhoI和BamHI。对于三聚FasL的表达载体，利用PCR扩增限制性位点PstI和EcoRI读框编码人FasL的序列的氨基酸139-281，并且在修饰的PCRIII载体中克隆。
对于六聚的FasL，将设计成在EcoRI限制性位点两侧编码以及再在5’-端连接连接体序列GGCTT并且在3’-端连接中止密码子(TAA)的编码氨基酸103-281的编码序列和天然的没有翻译的序列(GAG AAGCAC TTT GGG ATT CTT TCC ATT ATG ATT CTT TGT TAC AGG CAC CGAGAT GTT GAA GCC)克隆到载体PS 038的EcoRI限制性位点。通过在载体PS 038的连接体序列中引入基因点突变产生“超FasL”(图4，融合蛋白(3))，其中借助于PCR诱变方法用CAGTCTGCAG置换EcoRI限制性位点的5’-侧的序列CAGTGTGCTG。然后用如上所述方法将FasL(氨基酸103-281)克隆到修饰的PS 038中。
对于人TRAIL、鼠TNFα和人CD40L，通过PCR扩增在5’-端携带PstI限制性位点并且在3’-端携带终止密码子和SpeI和EcoRI限制性位点的胞外域的部分(TRAIL：氨基酸95-281，TNFα：氨基酸77-235，CD40L：氨基酸116-261)并且克隆到载体PCRII(Invitrogen)中。对于作为三聚体的配体的表达，首先在载体pQE-16(Qiagen)(PS 330)中限制性位点BamHI和PstI之间插入编码Flag标记的序列GAT TACAAA GAC GAT GAC GAT AAA，和连接体序列GGA CCC GGA CAG GTG CAG。然后将配体作为PstI/SpeI片段亚克隆到PS 330中。
用下面的方法构建用于FasL-ACRP30的表达载体。利用EST克隆AA673154，通过PCR方法将NsiI和PstI限制性位点限定的编码鼠ACRP30的氨基酸序列18-111的序列克隆到编码三聚的FasL的载体的PstI限制性位点中(以这样的方法使得融合的NsiI/PstI限制性位点位于该编码序列的5’-侧)。通过用各种配体序列取代表达载体FasL-ACRP30中的相应的FasL序列进入限制性位点PstI和EcoRI，产生用于表达其它具有ACRP30的TNF细胞因子的融合蛋白的载体。
(b)重组融合蛋白的表达和纯化：
对于三聚体TRAIL、TNFα和CD40L，在细菌(携带质粒pRep4的菌株M15，Qiagen)中建立稳定克隆。各克隆在37℃下在有氨苄青霉素(100微克/毫升)和卡那霉素(50微克/毫升)的LB肉汤中预先培养过夜并且用来接种主要培养物(稀释度1∶50，37℃下生长)，一小时之后用0.5mM IPTG(Sigma)诱导表达6小时。利用离心收集细胞，用PBS洗涤两次，在“French press”中溶解，并且通过离心将溶解液与不溶物分离。对于所有FasL蛋白质通过在800微克/毫升G418中筛选完成在HEK293细胞中的稳定克隆(参见已引述的：Schneider等，实验药物学杂志(J.Exp.Med.)1998)。
利用在M2-琼脂糖(Sigma Switzerland)上的亲和色谱从稳定克隆的上清液或者从细菌溶解液纯化三聚和六聚配体以及超FasL，使用50mM柠檬酸盐氢氧化钠(pH＝2.5)洗脱并且立即用0.2体积的Tris-HCl(pH＝8)中和。在浓缩器中(Centrikon-30，Amicon Corp.，Easton，TX，USA)用PBS置换缓冲液。
用下面的方法纯化FasL与鼠ACRP30的融合体。将上清液与50mM氯化钠和1mM氯化钙混合并且用盐酸/氢氧化钠将pH调节至7.0。然后将该重组蛋白结合到M1-琼脂糖(Sigma Switzerland)上并且用TBS-EDTA(10mM)洗脱。在浓缩器中用PBS置换缓冲液。通过二辛可宁酸方法(Pierce Chemical Co.，Rockforf，IL，USA)使用牛血清白蛋白作为标准物测定纯化的蛋白质的浓度并且通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色测定样品纯度。
在各项测试中加入用下面的方法制备的以富集的上清液形式的TRAIL、TNFα 和CD40L与ACRP30的融合蛋白：通过磷酸钙方法用各表达质粒转染293T细胞。细胞与沉淀物温育16小时之后，用PBS洗涤细胞并且在没有血清的培养基(Optimem，Gibco BRL)中温育4天。通过浓缩器将上清液体积减小至原来体积的二十分之一，并且利用蛋白质印迹检查蛋白质的存在。在TRAIL-ACRP30和TNFα-ACRP30的情况下，为了测定各重组融合蛋白的浓度，将这些蛋白质的滴定度与纯化的三聚体TRAIL或TNFα的滴定度相比较。
(c)通过凝胶渗透色谱检查多聚体的分子量：
通过在Superdex 200 HR10/30(Pharmacia)的凝胶过滤测定不同的融合蛋白的大小。将重组蛋白与内标过氧化氢酶和卵清蛋白，在三聚配体和六聚配体情况下，与铁蛋白和用于ACRP30融合蛋白的卵清蛋白以200微升体积加载到柱子上，用PBS(0.5毫升/分钟)洗脱，并且以0.25毫升收集级分。用蛋白质印迹测定通过三氯乙酸沉淀之后不同级分中蛋白质的存在。借助于由甲状腺球蛋白(669kDa)，铁蛋白(440kDa)，过氧化氢酶(262kDa)，醛缩酶(158kDa)，牛血清白蛋白(67kDa)，卵清蛋白(43kDa)，胰凝乳蛋白酶原A(25kDa)和核糖核酸酶(13.7kDa)的回归线测定蛋白的大小。
(d)细胞：
在含有5％热灭活FCS的DMEM中保持鼠B-淋巴瘤A20细胞。在含有10％FCS的RPMI中培养人T-淋巴原质体-Jurkat细胞、BJABBurkitt-淋巴瘤细胞。在含有2％FCS的DMEM多物质混合物F12(1∶1)中培养人胚胎肾细胞293。所有的培养基含有抗生素(青霉素和链霉素，各5微克/毫升，和新霉素，10微克/毫升)。在加有10％FCS、1mM丙酮酸钠、50μM 2-巯基乙醇、10mM hepes和10％经调节的EL-4细胞上清液的RPMI中培养IL-2依赖性鼠细胞毒性T-细胞系CT6。
(e)细胞毒性测试
基本上根据先前Schneider等所述(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，272：18827-18833，1997)进行细胞毒性测试。在100微升培养基中将五万个细胞培养16小时，从而在有或没有1微克/毫升M2抗体(对于TRAIL是2微克/毫升)下培养基含有显示的配体浓度。借助PMS/MTS(Phenanzinmethosulphat 3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-5-[3-羧甲氧基苯基]-2-[4-磺基苯基]-2H-四唑鎓盐)(Promega Corp.，Madison，WI)测定细胞存活率。显色时间按要求进行(一般是1-3小时)。在490nm下测定吸光度。
(f)B细胞增殖测试：
用磁珠利用FACS分类从人PBL(外周血淋巴细胞)筛选CD19-阳性细胞并且纯化，而用3000rad照射CD-19阴性细胞。在96孔板中，在有或没有M2抗体(10微克/毫升)下，在含有滴定过的可溶性CD40L融合蛋白的120微升培养基(RPMI 10％FCS，抗生素)中用100000个照射过的自体的CD19-阴性PBL培养一万个纯化的CD19-阳性细胞72小时。接着用[3H]-胸苷对细胞脉冲处理6小时，并且用液体闪烁计数器测定掺入量。
另外参见Schneider等(实验药物学杂志(J.Exp.Med.)Vol.187，No.8，1998，1205-1213)关于实施实施例中所使用的方法的描述及其引作参考的文献。
实施例1
表达重组融合蛋白(2)，其具有hFasL(h：人)的氨基酸103-281作为成分A和成分A的氨基酸103的N-末端具有18个AA长的序列(VDLEGSTSNGRQCAGIRL，称为特定连接体)作为成分B。另外，在该融合蛋白的N-末端(成分B的N-末端)偶联具有氨基酸DYKDDDDK的Flag序列和其连接体序列GPGQVQLQ(图1)。
对于对比实验，表达融合蛋白(1)，其在N-末端也具有上述Flag序列和接着其C-末端的相同的连接体序列，并且在C-末端连接hFasL的氨基酸139-281。因此，融合蛋白(1)与融合蛋白(2)的不同之处在于缺失特定连接体和hFasL的氨基酸103-138(图1)。
根据(a)中描述的方法构建融合蛋白(1)和(2)的载体构建体。根据(b)中描述的方法表达和纯化融合蛋白。
对纯化的融合蛋白(1)施加还原或非还原条件，然后通过凝胶电泳分离(图2)，与粗略测定分子量的各个泳带连接。
最后，使用根据(d)培养的A20和Jurkat细胞并且根据(e)进行细胞毒性测试。在存在或不存在抗-Flag M2抗体(Sigma，Buchs，Switzerland)下用递增浓度的三聚融合蛋白(1)或融合蛋白(2)的三聚体的二聚物(换句话说是六聚体)对两个细胞系的每一个进行测定(图3)，在OD 490mm下测定吸光度。
实施例2
表达重组融合蛋白(3)，其具有hFasL的氨基酸103-281作为成分A并且成分A的氨基酸103的N-末端具有18个AA长的序列(VDLEGSTSNGRQSAGIRL，称为特定连接体)作为成分B。另外，在该融合蛋白的N-末端(成分B的N-末端)偶联具有氨基酸DYKDDDDK的Flag序列和连接它的连接体序列GPGQVQLQ(图4)。
对于对比实验，以和实施例1相同的方法表达融合蛋白(1)(图4)。
根据实施例1中描述的方法构建融合蛋白(3)和(1)的载体构建体。根据(b)中描述的方法表达和纯化融合蛋白。
最后，使用根据(d)培养的A20和Jurkat细胞并且根据(e)进行细胞毒性测试。在存在或不存在抗-Flag M2抗体(Sigma，Buchs，Switzerland)下用递增浓度的三聚融合蛋白(3)对两个细胞系的每一个进行测定(图5)，在OD490mm下测定吸光度。
实施例3
表达重组融合蛋白(4)，其具有hFasL的氨基酸139-281作为成分A并且成分A的氨基酸139的N-末端首先有具有序列LQ的连接体二聚体，然后在N-末端具有来自mACRP30的94个AS长的序列(AS18-111)的寡聚结构域作为成分B。另外，在该融合蛋白(4)的N-末端(成分B的N-末端)偶联具有氨基酸DYKDDDDK的Flag序列和连接它的连接体序列GPGQVQLH(图6A)。融合蛋白(1)被用作对比实验。
根据(b)中描述的方法表达和纯化融合蛋白。
最后，使用根据(d)培养的BJAB Burkitt-淋巴瘤细胞并且根据(e)进行细胞毒性测试。该测试在存在或不存在抗-Flag M2抗体(Sigma，见上文)下，用递增浓度的融合蛋白(1)的三聚体或者融合蛋白(4)的寡聚三聚体(十二聚体)，即重组FasL-ACRP30(4×3)，对两个细胞系的每一个进行测定(图7)，在OD 490mm下测定吸光度。
实施例4
表达重组融合蛋白(5)，其具有hTRAIL(h：人)的氨基酸95-281作为成分A并且成分A的氨基酸95的N-末端首先有具有序列LQ的连接体二聚体，然后继续在N-末端具有来自mACRP30的94个AS长的序列(AS 18-111)的寡聚结构域作为成分B。另外，在该融合蛋白的N-末端(成分B的N-末端)偶联具有氨基酸DYKDDDDK的Flag序列和连接它的连接体序列GPGQVQLH(图8)。
对于对比实验，表达一种融合蛋白(图8中没有给出)，其在溶液中以三聚体(TRAIL三聚体)存在。该对比实验蛋白质(自N-末端至C-末端)具有Flag序列、具有序列GPGQVQLH的连接体和最后的hTRAIL(AS 95-281)。与融合蛋白(5)不同，该成分B(mACRP30：AS 18-111)和具有序列LQ的连接体缺失。
根据(b)中描述的方法表达和纯化融合蛋白。
最后，使用根据(d)培养的T-淋巴原质体Jurkat细胞并且根据(e)进行细胞毒性测试。在存在或不存在抗-Flag M2抗体(Sigma，见上文)下，用递增浓度的没有ACRP30序列的融合蛋白的三聚体(用于对比)或者融合蛋白(5)的寡聚三聚体，即重组TRAIL-ACRP30(4×3)十二聚体进行测定(图9)，在OD 490mm下测定吸光度。
实施例5
表达重组融合蛋白(6)，其具有mTNFα(m：鼠)的氨基酸77-235作为成分A并且成分A的氨基酸85的N-末端首先有具有序列LQ的连接体二聚体，然后进一步在N-末端具有来自mACRP30的94个AS长的序列(AS 18-111)的寡聚结构域作为成分B。另外，在该融合蛋白的N-末端(成分B的N-末端)偶联具有氨基酸DYKDDDDK的Flag序列和连接它的连接体序列GPGQVQLH(图10)。
对于对比实验，表达一种融合蛋白(图10中没有给出)，其在溶液中以三聚体(TNFα三聚体)存在。该对比实验蛋白质(自N-末端至C-末端)具有Flag序列、具有序列GPGQVQLH的连接体和最后的mTNFα(AS 77-235)。与融合蛋白(6)不同，该成分B(mACRP30：AS 18-111)和具有序列LQ的连接体缺失。
根据(b)中描述的方法表达和纯化融合蛋白。
根据(f)中的增殖测试，测定在存在或不存在抗-Flag M2抗体(Sigma，见上文)下，加入递增浓度的TNFα三聚体或者TNFα-ACRP30寡聚物(TNFα的同十二聚体)对CT6细胞的作用。
为此目的，在增殖实验之前在降低浓度的EL-4上清液的存在下(2.5％)使CT6细胞生长4天。在存在或不存在2微克/毫升M2-mAK和不存在EL-4上清液下将细胞与指定浓度的TNFα-ACRP30寡聚物或者mTNFα一起在96-孔滴定板(每孔40000个细胞)温育16小时。用3[H]-胸苷(0.5μCi/孔)对细胞进行脉冲另外6小时，并且进行三次冷冻和解冻循环并且最后收获。最后利用液体闪烁方法检查3[H]-胸苷掺入量(图11)。
实施例6
表达重组融合蛋白(7)，其具有hCD40L(h：人)的氨基酸116-261作为成分A并且成分A的氨基酸95的N-末端首先有具有序列LQ的连接体二聚体，然后进一步在N-末端具有来自mACRP30的94个AS长的序列(AS 18-111)的寡聚结构域作为成分B。另外，在该融合蛋白的N-末端(成分B的N-末端)偶联具有氨基酸DYKDDDDK的Flag序列和连接体序列GPGQVQLH(图12)。
对于对比实验，表达一种融合蛋白(图12中没有给出)，其在溶液中以三聚体(CD40L三聚体)存在。该对比实验蛋白质(自N-末端至C-末端)具有Flag序列、具有序列GPGQVQLH的连接体和最后的hCD40L(AS 116-261)。与融合蛋白(7)不同，该成分B(mACRP30：AS 18-111)和具有序列LQ的连接体缺失。
根据(b)中描述的方法表达和纯化融合蛋白。
最后，类似地根据(f)对PBL进行细胞增殖测试，其中在存在或不存在抗-Flag M2抗体(Sigma，见上文)下，加入CD40L三聚体或CD40L-ACRP30寡聚物(同十二聚体)(图13)。
实施例7
7.1实验方法
该实施例7关于融合蛋白，其由多聚和寡聚成分A和作为成分B的受体组成。
(A)载体构建
以下面顺序(5’至3’)根据可互换的组件的排列从修饰的PCR-3载体(购自Invitrogen)构建融合蛋白：
(a)包含受体胞外结构域和前面的Kazak序列GCCACC的HindIII/SalI组件(在hTNF-R1(氨基酸1-211)；h-TRAIL-R1(氨基酸1-239)；h-TRAIL-R2(氨基酸1-212)；h-TRAIL-R3(氨基酸1-240)；和hCD40(氨基酸1-193)的情况下或者在5’-未翻译区的24个核苷酸之前置hFasR(氨基酸1-170)的情况下)；(b)SalI/XhoI-盒内14个氨基酸长的连接体(PQPQPKPQPKPEPE)(如Terskikh等(1997)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94，1663所述)；(c)在OPG情况下XhoI/NotI-组件中的寡聚结构域(氨基酸187-401，这里描述为δN-OPG)、CMP(氨基酸451-493)，GenBank 115555)；COMP(氨基酸32-75，GenBank 1705995)；(d)包含His6-myc-标记和终止密码子联合的NotI/XbaI-盒。在N-和C-末端由氨基酸序列GGCC和ARTPGGGS连接寡聚结构域。对于所有的构建体使用连接体。在Fc-构建体的情况下，如上所述克隆作为SalI/XhoI-盒的“绞合”区，CH2和CH3结构域和hIgG1的终止密码子(Schneider等(1997)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，272：18827；Schneider等(1998)，实验药物学杂志(J.Exp.Med.)，187，1205)。通过上述方法(Schneider等(1997)，上文)通过在800微克/毫升G418中筛选，建立用于生产重组蛋白的稳定的HEK-293派生的细胞系。
(B)瞬时转染
如上所述(Schneider等(1997)，上文)通过氯化钙方法转染293T细胞并且用PBS洗涤，然后在没有血清的Optimem培养基中温育3天。将上清液浓缩30倍，在使用之前保持冷冻。借助于纯化的Fas/COMP作为标准物通过“蛋白质印迹”滴定，测定浓缩的Optimem培养基中Fas/δN-OPG和Fas/CMP融合蛋白的浓度。
(C)重组蛋白的纯化
将稳定转染的293-细胞的上清液加到M2-琼脂糖(作为配体)或者蛋白质A-琼脂糖凝胶(Fc融合蛋白)上，用PBS冲洗并且用50mM柠檬酸盐-氢氧化钠(pH 2.5)洗脱。用Tris-HCl(pH8)中和洗脱液并且在Centrikon30浓缩器(购自Amicon，Easton，Texas)中将缓冲液变为PBS。在HiTrap-螯合剂柱上纯化COMP和CMP融合蛋白。为此目的，对稳定转染的293细胞上清液补加500mM氯化钠和10mM咪唑，并且加到预包被有0.5M硫酸锌(pH 2.5)的柱子上，并且用PBS平衡。用PBS洗涤该柱子并且用含有50mM EDTA的PBS洗脱蛋白质。如上所述将缓冲液变为PBS。
如上所述制备Flag-FasL和Flag-TRAIL(Schneider等(1997)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，272：18827，和Thome等，1997，自然(Nature)386，517)。这两篇参考文献全部包括在本发明应用主题的公开中作为参考。和对于Flag-TRAIL所述一样，在细菌中表达Flag-CD40L(AS 116-261)并且在M2-琼脂糖上纯化。通过二辛可酸方法测定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE和考马斯蓝标记检查纯化程度。
(D)凝胶渗透色谱
对于凝胶渗透色谱，将体积200微升的各融合蛋白的量加到Superdex 200 HR 10/30柱(购自Pharmacia)上并且用PBS以0.5毫升/分钟洗脱，同时测定280nm吸光度。如下所述，在细胞毒性测试中分析各级分(0.25毫升)。对于分子量测定，用标准蛋白质甲状腺球蛋白(669kDa)，铁蛋白(440kDa)，过氧化氢酶(262kDa)，醛缩酶(158kDa)，牛血清白蛋白(67kDa)，鸡卵清蛋白(43kDa)，胰凝乳蛋白酶原A(25kDa)和核糖核酸酶(13.7kDa)校正柱子。
(E)竞争ELISA
如下进行竞争ELISA。用受体/Fc-融合蛋白(0.2微克/毫升PBS溶液，100微升，16小时，25℃)包被96-孔-ELISA-平板。在37℃下在PBS中将孔饱和一小时，所述PBS含有5％胎牛血清(作为封闭剂)。对于使用sCD40L的情况下，封闭剂是PBS，其含有4％脱脂牛奶和0.05％Tween-20。将竞争Fc或COMP融合蛋白系列溶解于100微升有或没有1微克/毫升蛋白质A的封闭缓冲剂中。以不变的浓度加入配体(sFasL：2微克/毫升，36nM，sTNFα：0.02微克/毫升，0.36nM；sTRAIL：0.1微克/毫升，1.4nM；sCD40L：0.5微克/毫升，9.2nM；都在封闭缓冲剂中)，并且在37℃下结合1小时。用M2-抗-Flag抗体(存在于封闭缓冲剂中1微克/毫升，100微升，45分钟，37℃)，过氧化物酶-偶联的山羊-抗-小鼠抗体(封闭缓冲剂中1∶2000稀释，100微升，30分钟，37℃)和邻苯二胺盐酸盐(0.3毫克/毫升，于50mM柠檬酸中，100mM磷酸氢二钠，0.01％H2O2)鉴定结合的配体。在490nm处测定吸光度。
(F)细胞毒性测试
基本上根据上文引述的Schneider等(1997)所述以100微升体积在96-孔平板中进行细胞毒性测试。在含有一定量的能够诱导95％以上的细胞死亡的细胞毒性配体的培养基中系列稀释嵌合受体。如所指出的，以1微克/毫升的浓度使用蛋白质A。在1微克/毫升M2存在下使用sFasL，在2微克/毫升M2存在下使用sTRAIL。对使用TNFα的实验系列不使用M2抗体。温育细胞16小时，并且通过使用PMS/MTS测试系统(phenacinemethosulfate/3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-5-[3-羧甲氧基苯基]-2-[4-磺基苯基]-2H-四唑鎓，盐形式)(Promega，Madison，Wisconsin)测定存活率。在490nm处测定吸光度。为了指示各融合蛋白的摩尔浓度，如下估计分子量：[(对于每一个前述的N-偶联的Glyan的理论Mr+3kDa)x多重性]。Fas:Fc，:COMP，:CMP，:δN-OPG：分别是98，172，100和105kDa。TRAILR2:Fc，:COMP，:CMP，:δN-OPG：是86，142，82和93kDa。TNFR1:Fc，:COMP，:104和187kDa。CD40:Fc，:COMP:101和180kDa。TRAILR2:Fc:86kDa。TRAILR3:Fc:127kDa。Flag-TRAIL，Flag-FasL，Flag-TNFα，Flag-CD40L：分别是71，55，56和54kDa。
(G)BIAcore测定
以5微升/分钟的流速，在CM5-羧甲基葡聚糖-修饰的传感器芯片(购自BIAcore AB，Uppsala，Sweden)上进行BIAcore测定。通过50微升剂量的N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺的1∶1的混合物活化CM5-芯片。然后经活化的表面引入10mM碳酸氢钠(pH5.5)中100微克/毫升M2-抗-Flag单克隆抗体溶液6微升。用50微升剂量的1M乙醇胺-HCl灭活剩下的N-羟基琥珀酰亚胺酯。该方法所需固定化的M2-抗体的量是大约4600单位。为了分析FasL-Fas：融合蛋白和TRAIL-TRAIL-R2：融合蛋白的相互作用，在M2-修饰的表面固定化恒定量的标记的配体。为了实现该目的，向该表面施加7微升剂量的2.5微克/毫升的Flag-FasL或Flag-TRAIL。这导致大约100至150单位的结合。除此之外，这些条件使得配体从M2表面解离程度最小，同时保证足够的接替的受体结合用于分析。然后通过注射15微升浓度在1和100微克/毫升之间，相应于100至150单位，的纯化的受体：融合蛋白来分析受体：融合蛋白的结合。测定3分钟缔合动力学并且测定3-5分钟解离动力学。然后通过5微升剂量的50mM柠檬酸盐-HCl(pH2.5)使表面再生(对于简单的M2表面)。最多连续重复30次结合和再生，固定的M2-抗体的结合特征没有显著变化。使用AB＝A+B和A+B＝AB模型借助于生产商提供的动力学分析程序来分析解离和缔合动力学。
(H)初级小鼠肝细胞的培养
对于初级小鼠肝细胞的培养，杀死C57BL/6小鼠并且立即取出胆囊之上的肝部分，然后将其保持在“肝细胞-附着培养基”(HAM)中。最初，为了去除血红细胞，用16毫升10mM Hepes(pH7.6)灌注肝区，然后使用Hepes(4mM氯化钙)中的12毫升0.5毫克/毫升胶原蛋白酶H(购自Boehringer Mannheim)处理，然后在培养皿中的Hepes中匀浆。用Hepes洗涤细胞，然后离心(100xg，30秒)并且重新悬浮于HAM中60％等渗Percoll溶液(购自Pharmacia)中，并且再次离心(700xg，2分钟)。所有的缓冲液和培养基都在37℃下使用。将沉降的细胞再次悬浮于HAM中，计数，在扁平状的(flachschaligen)微量滴定平板上接种(每孔10000个，200微升)，并且能相应地附着。加入实验混合物(系列稀释的抑制剂，sFasL(终浓度：400ng/ml，7nM)和M2-抗体(终浓度：1微克/毫升))，然后将细胞再温育16小时。取出上清液，加入新鲜HAM(100微升)，并且如上所述进行存活率试验PMS/MTS。
(I)激活作用-诱导的细胞死亡
37℃下，用PBS中的抗-人CD3 TR66(10微克/毫升)包被扁平状的微量滴定平板3小时。该平板用PBS洗涤两次并且用RPMI 1640培养基洗涤一次。将Jurkat细胞(每毫升5×105个细胞，100微升)与所述抑制剂混合并且分布到各个孔中，然后离心(200xg，3分钟)，并且37℃下温育24小时。如上所述测定细胞的存活率(在OD 490nm下)。如下计算特异性细胞保护(％)[(抗-CD3+抑制剂)-抗-CD3]/[(对照)-(抗-CD3)]×100。
为提供混合的白细胞培养物，将来自穿孔素缺乏或gld C57BL/6小鼠(H-2b)的脾细胞与来自Balb/c-小鼠(H-2d)的γ-照射(36Gy)的脾细胞一起培养5天，使用之前，通过在Ficoll-Paque(购自Pharmacia Biotech)上梯度离心从样品去除不存活的细胞。根据上述方法(Kataoka等)进行标记。简言之，用[51Cr]铬酸钠(得自Dupont，Boston，MA)标记目标细胞(A20细胞)1小时，然后用RPMI 1640洗涤三次。在200微升终体积中40微克/毫升的Fas:Fc和Fas:COMP存在或不存在下，在U-形微量滴定平板中将MLC细胞与目标细胞(每孔104个细胞)混合，并且将该平板离心(200xg，3分钟)。温育4小时之后，取出上清液并且测定其放射性。通过下式确定特异性[51Cr]释放(％)：[(实验释放量)-(自发释放量)/(最大释放量)-(自发释放量)]×100。
(K)FACS-标记
为了FACS-标记，将CD40L+-Jurkat克隆D 1.1(5×105细胞)与FACS缓冲液(PBS，10％胎牛血清，和0.02％NaN3)中的2微克CD40:COMP温育。使用Fas:COMP作为阴性对照。通过1微克9E10抗-myc抗体，并且接着用FITC-标记的山羊-抗-小鼠抗体(1∶100)处理检测受体：COMP。在4℃下在50微升FACS缓冲液中进行温育20分钟。
(L)B细胞增殖测试
为了进行B细胞增殖测试，通过磁珠纯化来自人外周血淋巴细胞(PBL)的CD19+-细胞，并且用3000rad照射其余的CD-19-细胞。在120微升培养基中混合105个纯化的CD19+细胞和105个CD-19-自体的照射过的PBL，所述培养基中含有100ng/ml(1.8nM)浓度的sCD40L、10微克/毫升M2-抗体加或者减1微克/毫升浓度的蛋白质A和指定浓度的CD40:Fc或者CD40:COMP。然后在96-孔板中将细胞培养72小时，用[3H]-胸苷(1μCi/孔)对细胞脉冲处理6小时并且收集细胞。用液体闪烁计数器测定[3H]-胸苷的掺入量。
7.2实施例7的结果
本领域公知由与IgG的Fc部分(受体：Fc)融合的受体的胞外域组成的融合蛋白是用于研究受体配体相互作用的抑制剂。在实施例7中，通过大小排阻色谱测定纯化的Fas:Fc-融合蛋白的大小，并且发现洗脱出具有预计保留时间的单峰。当考虑估计实验中的Fas:Fc与FasL的比值是大约1000时，含有Fas:Fc的级分能够保护暴露给致命剂量的可溶性FasL(sFasL)抵抗细胞死亡，尽管该保护的力度(最多50％)非常低。
对洗脱液的几个前级分发现弱的保护活性，其很可能含有少量的检测不到的高分子量Fas:Fc复合体。根据本发明认识到，这样的融合蛋白的更高级聚集体能够作为FasL-诱导的细胞死亡的潜在的抑制剂起作用。因此，最初通过加入免疫球蛋白交联剂蛋白质A提高聚集的Fas:Fc的高分子量级分。一旦在只有大约10％的注入的Fas:Fc迁移到前洗脱级分条件下进行分析，就明显地看出高分子量Fas:Fc复合体是FasL诱导的细胞毒性的有效拮抗剂。与此相比较，发现其余的Fas:Fc级分仍然作为二聚体被洗脱出来，尽管有10倍高的浓度，其对细胞也只有部分保护作用。根据本发明，实施例7的这些结果表明形成更高级Fas:Fc聚集体大大提高了特异性保护作用。
因此，根据本发明，在这些发现的基础上构建融合蛋白复合体，其由于提高了Fas的寡聚程度而表现出比FasL更好的亲合力，并且改善了抑制特征。根据本发明的融合蛋白是，例如，这样的融合蛋白，其中TNF家族受体的胞外域，例如Fas、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TNF-R1或CD40，通过一个14个氨基酸长的连接体，与所谓软骨寡聚基质蛋白((COMP)；融合蛋白称为：受体：COMP)的或者所谓软骨基质蛋白((CMP)；融合蛋白：受体：CMP)的寡聚结构域融合。这些基质蛋白和它们的结构域分别具有分别形成五聚体和三聚体卷曲螺旋结构的天然性质。在哺乳动物细胞中表达上述融合蛋白(以及受体：Fc融合蛋白作为对照)，并且通过在金属螯合柱上或者在蛋白质A上通过亲和色谱进行纯化。在实施例7中，受体Fas和TRAIL-R2也与TNF家族的蛋白质Osteoprotegrin的C-末端二聚结构域结合(受体：δN-OPG)。
如可通过在非还原条件下在聚丙烯酰胺凝胶中的缓慢迁移显示，与COMP或CMP融合的受体发生了寡聚。通过应用凝胶渗透色谱方法分别测得洗脱的Fas:COMP和TRAIL-R2：CMP确定的峰分别具有大约400和170kDa的表观分子量。该分子量分别相应于融合蛋白的五聚和三聚结构。因此，可以从实施例7的实验得出结论，即上述基质蛋白的卷曲螺旋寡聚结构域的聚集特征不受与TNF受体家族蛋白质(或者蛋白质结构域)的融合的影响。
当使所述融合蛋白与应用的Fas:Fc竞争sFasL-结合时，融合蛋白Fas:COMP表现出比Fas:Fc低的KD值。与此结果相吻合，对FasL-Fas:COMP相互作用测定得到的解离常数为0.77nM，其比对Fas:Fc的对比值低大约8-至9倍。对于试验的大多数细胞系表明Fas:COMP的抑制活性比二聚融合蛋白Fas:Fc的高大约10至20倍，而对于通过交联蛋白质A(Fas:Fc/PA)引起的Fas:Fc聚集体的结果表明是Fas:COMP和Fas:Fc的那些值之间的值。二聚Fas:δN-OPG融合蛋白的保护活性可与二聚Fas:Fc复合体的活性相比较。三聚Fas:CMP大约和Fas:Fc/PA一样有效抑制sFasL-介导的溶胞作用-因此，结果比Fas:COMP效果小5倍。Fas:COMP的抑制活性良好或者比阻断FasL的单克隆抗体Nok-1、4H9和4A5的抑制活性更好。与Fas:Fc复合体相比较，从使用初级鼠肝细胞的实验或者从使用抗-CD3-激活Jurkat细胞的激活作用-诱导的细胞死亡的模型系统也证明了Fas:COMP的卓越抑制活性。所有的这些实验中，Fas:Fc-PA得出中等保护水平。此外，检查了Fas:COMP是否能够抑制在CTLs上表达的FasL的作用。4小时测试系统中A20-细胞的死亡只取决于穿孔素和FasL-依赖性信号传导途经，因为缺少穿孔素以及缺少FasL的CTLs对这些细胞没有效果。在一个相应的实验中，正如所预期的，缺少穿孔素的CTLs以及缺少FasL的CTLs都杀死A20细胞。Fas:Fc和Fas:COMP特异性引起一定程度的对于暴露于缺少穿孔素的CTLs的细胞的保护作用。
在通过竞争ELISA的sCD40L对CD40:Fc、CD40:Fc/PA或者根据本发明的CD40:COMP的亲和性的比较中，对于五聚受体观察到亲和性大大提高了(30-倍)，同时对于CD40:Fc/PA也存在中等作用(8-倍)。关于CD40:COMP是否也能识别膜-结合的CD40L的问题，使用组成型表达表面蛋白CD40L的Jurkat派生细胞系D1.1用于借助于CD40融合蛋白作为样品的FACS标记分析。对根据本发明的CD40:COMP发现明显标记，由此表明CD40-COMP确实能够结合天然未处理的CD40L。为了研究生物系统中CD40融合蛋白的特异活性，试图了抑制用抗-B-细胞受体共同刺激的人B细胞的CD40L-依赖性增殖。CD40:Fc和CD40:Fc/PA即使在高剂量施用情况下也都不能显著阻止增殖作用。相反，根据本发明的CD40:COMP在相对低的剂量下就已经能够阻断增殖作用。
总之，从本发明实施例的观察得出结论，即通过竞争抑制剂对FasL-诱导的编程性细胞死亡的抑制随寡聚的程度而增强，并且对各种细胞系来说各种抑制剂的相对活性(表示为它们各自IC50值的比例)保持相对恒定。根据本发明的Fas:COMP与Fas:Fc相比提高的抑制活性可能是其更高的亲合力的结果。对于根据本发明的CD40融合蛋白的亲合力也确定了类似结果。体外就对初级D细胞的CD40L-诱导的抑制作用来说，根据本发明的CD40:COMP显著优越于CD40:Fc。因此实施例7的结果表明对于例如Fas和CD40这样的天然的特征在于对于它们的配体的中等亲和性的受体，如果，根据本发明的计划，它们是特征在于更高度寡聚的融合蛋白的组成成分，能够获得低纳摩尔范围内的解离常数。
序列表
<110>Apotech Research and Development Ltd.
<120>重组融合蛋白的二聚体，三聚体，四聚体或五聚体的二聚物或寡聚物
<130>AP01P004WO
<140>PCT/EP00/13032
<141>2000-12-20
<160>7
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>159
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：FasL-三聚体
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(8)
<223>Flag
<220>
<221>结构域
<222>(9)..(16)
<223>连接体
<220>
<221>结构域
<222>(17)..(159)
<223>人FasL aa 139-281
<400>1
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu Gln
1 5 10 15
Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn
20 25 30
Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu
35 40 45
Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr
50 55 60
Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys
65 70 75 80
Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr
85 90 95
Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr
100 105 110
Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn
115 120 125
Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu
130 135 140
Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu
145 150 155
<210>2
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：FasL-六聚体
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(8)
<223>Flag
<220>
<221>结构域
<222>(9)..(16)
<223>连接体
<220>
<221>结构域
<222>(17)..(34)
<223>特定连接体
<220>
<221>结构域
<222>(35)..(70)
<223>人FasL aa 103-138
<220>
<221>结构域
<222>(71)..(213)
<223>人FasL aa 139-281
<400>2
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu Gln
1 5 10 15
Val Asp Leu Glu Gly Ser Thr Ser Asn Gly Arg Gln Cys Ala Gly Ile
20 25 30
Arg Leu Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu
35 40 45
Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gln Ile Gly
50 55 60
His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His
65 70 75 80
Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp
85 90 95
Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly
100 105 110
Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr
115 120 125
Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr
130 135 140
Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys
145 150 155 160
Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr
165 170 175
Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn
180 185 190
Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe
195 200 205
Gly Leu Tyr Lys Leu
210
<210>3
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Super-FasL
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(8)
<223>Flag
<220>
<221>结构域
<222>(9)..(16)
<223>连接体
<220>
<221>结构域
<222>(17)..(34)
<223>特定连接体
<220>
<221>结构域
<222>(35)..(70)
<223>人FasL aa 103-138
<220>
<221>结构域
<222>(71)..(213)
<223>人FasL aa 139-281
<400>3
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu Gln
1 5 10 15
Val Asp Leu Glu Gly Ser Thr Ser Asn Gly Arg Gln Ser Ala Gly Ile
20 25 30
Arg Leu Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu
35 40 45
Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gln Ile Gly
50 55 60
His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His
65 70 75 80
Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp
85 90 95
Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly
100 105 110
Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr
115 120 125
Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr
130 135 140
Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys
145 150 155 160
Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr
165 170 175
Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn
180 185 190
Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe
195 200 205
Gly Leu Tyr Lys Leu
210
<210>4
<211>252
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：FasL-ACRP30
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(8)
<223>Flag
<220>
<221>结构域
<222>(9)..(16)
<223>连接体
<220>
<221>结构域
<222>(17)..(108)
<223>小鼠ACRP30 aa 18-111
<220>
<221>结构域
<222>(109)..(110)
<223>连接体
<220>
<221>结构域
<222>(111)..(252)
<223>人FasL aa 139-281
<400>4
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu His
1 5 10 15
Glu Asp Asp Val Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Val Pro
20 25 30
Pro Pro Lys Gly Thr Cys Ala Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly His
35 40 45
Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr Pro
50 55 60
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ala Gly Leu Leu Gly Pro Lys Gly
65 70 75 80
Glu Thr Gly Asp Val Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly Phe
85 90 95
Pro Gly Thr Pro Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Leu Gln Glu Lys
100 105 110
Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg
115 120 125
Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Leu Leu Ser Gly
130 135 140
Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr
145 150 155 160
Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu
165 170 175
Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp
180 185 190
Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln
195 200 205
Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser
210 215 220
Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe
225 230 235 240
Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu
245 250
<210>5
<211>296
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：TRAIL-ACRP30
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(8)
<223>Flag
<220>
<221>结构域
<222>(9)..(16)
<223>连接体
<220>
<221>结构域
<222>(17)..(108)
<223>小鼠ACRP30 aa 18-111
<220>
<221>结构域
<222>(109)..(110)
<223>连接体
<220>
<221>结构域
<222>(111)..(296)
<223>人TRAIL aa 95-281
<400>5
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu His
1 5 10 15
Glu Asp Asp Val Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Val Pro
20 25 30
Pro Pro Lys Gly Thr Cys Ala Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly His
35 40 45
Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr Pro
50 55 60
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ala Gly Leu Leu Gly Pro Lys Gly
65 70 75 80
Glu Thr Gly Asp Val Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly Phe
85 90 95
Pro Gly Thr Pro Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Leu Gln Thr Ser
100 105 110
Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro
115 120 125
Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala Ile Thr Gly Thr
130 135 140
Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys
145 150 155 160
Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His
165 170 175
Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His
180 185 190
Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln
195 200 205
Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr
210 215 220
Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser
225 230 235 240
Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser
245 250 255
Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe
260 265 270
Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser
275 280 285
Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
290 295
<210>6
<211>268
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：TNFa-ACRP30
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(8)
<223>Flag
<220>
<221>结构域
<222>(9)..(16)
<223>连接体
<220>
<221>结构域
<222>(17)..(108)
<223>小鼠ACRP30 aa 18-111
<220>
<221>结构域
<222>(109)..(110)
<223>连接体
<220>
<221>结构域
<222>(111)..(268)
<223>小鼠TNFa aa 77-235
<400>6
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu His
1 5 10 15
Glu Asp Asp Val Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Val Pro
20 25 30
Pro Pro Lys Gly Thr Cys Ala Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly His
35 40 45
Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr Pro
50 55 60
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ala Gly Leu Leu Gly Pro Lys Gly
65 70 75 80
Glu Thr Gly Asp Val Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly Phe
85 90 95
Pro Gly Thr Pro Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Leu Gln Thr Leu
100 105 110
Thr Leu Arg Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His
115 120 125
Val Val Ala Asn His Gln Val Glu Glu Gln Leu Glu Leu Ser Gln Arg
130 135 140
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Asp Leu Lys Asp Asn Gln Leu
145 150 155 160
Val Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Ser Gln Val Leu Phe
165 170 175
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Asp Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser
180 185 190
Arg Phe Ala Ile Ser Tyr Gln Glu Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Val
195 200 205
Lys Ser Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro
210 215 220
Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly
225 230 235 240
Asp Gln Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Phe Ala
245 250 255
Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Val Ile Ala Leu
260 265
<210>7
<211>255
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：CD40L-ACRP30
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(8)
<223>Flag
<220>
<221>结构域
<222>(9)..(16)
<223>连接体
<220>
<221>结构域
<222>(17)..(108)
<223>小鼠ACRP30 aa 18-111
<220>
<221>结构域
<222>(109)..(110)
<223>连接体
<220>
<221>结构域
<222>(111)..(255)
<223>人CD40L aa 116-261
<400>7
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu His
1 5 10 15
Glu Asp Asp Val Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Val Pro
20 25 30
Pro Pro Lys Gly Thr Cys Ala Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly His
35 40 45
Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr Pro
50 55 60
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ala Gly Leu Leu Gly Pro Lys Gly
65 70 75 80
Glu Thr Gly Asp Val Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly Phe
85 90 95
Pro Gly Thr Pro Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Leu Gln Gly Asp
100 105 110
Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys
115 120 125
Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Thr Met Ser Asn
130 135 140
Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln
145 150 155 160
Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu
165 170 175
Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro
180 185 190
Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser
195 200 205
Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu
210 215 220
Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln
225 230 235 240
Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
245 250 255
机译： 重组融合蛋白二聚体，三聚体，四聚体或五聚体二聚体或寡聚体
机译： 重组融合蛋白的二聚体，三聚体，四聚体或五聚体的二聚体或寡聚体
机译： 重组融合蛋白的二聚体，三聚体，四聚体或五聚体的二聚体或寡聚体
