鸡常见传染病诊断性基因芯片及其用途

实施例

实施例1基因芯片制备的通用策略

关于本发明所述基因芯片的制备，可采用如下详述的通用策略

(一)基于载玻片作为固相支持物的基因芯片：

1.载玻片处理：取载玻片数片，置于2mol/L NaOH的70％乙醇溶液中浸泡2小时，取出后用水荡洗数次，110℃烘干并冷却至室温，将载玻片置于1％的3-氨丙基三乙氧基硅烷95％丙酮溶液中浸泡2分钟，取出用丙酮洗10次，110℃烘30分并冷却至室温备用。

2.点样：依据需要制备的本发明的基因芯片的具体类型，将所述基因芯片中所选择的病原基因特征性DNA片段各取17μl，加入20×SSC缓冲液3ul混匀，转移至96孔板中，将板置于pixsys7500 DNAMicroarray system(cartesian Technologies Inc；制造)的点样平台上，以3×10排列在处理好的载玻片上制作基因芯片。每份基因芯片中均至少包括一个阳性对照，和一个阴性对照。

将点好的阵列置湿盒中水化5分钟，取出置100℃平台上30秒，然后面朝下置于紫外透射仪上，以功率0.5mW/cm²波长230nm紫外光照射18分钟固定。备用。

(二)基于硝酸纤维素膜作为固相支持物的基因芯片：

1.硝酸纤维素膜的处理：取硝酸纤维素膜，置于2×SSC溶液(20×SSC＝NaCl 175.5g 3Mol/L，柠檬酸钠C₆H₅O₇Na 2H₂O 88.2g 0.3Mol/L，加水溶解，调H至7.0，加水稀释成1L，滤清，此液稀释10倍即得2×SSC)，湿润均匀，放在滤纸上，夹在两块玻璃板中，37℃烘干，即可点样。

2.点样：依据需要制备的本发明的基因芯片的具体类型，将所述基因芯片中所选择的病原基因特征性DNA片段各取17μl，加入20×SSC缓冲液3ul混匀，以3×3的阵列格式点在硝酸纤维素膜上，将点好的阵列放在滤纸上，夹在两块玻璃板中，80℃烘烤2小时，制作基因芯片。每份基因芯片中均至少包括一个阳性对照，和一个阴性对照。

实施例2本发明所述基因芯片检测待测样品的通用策略

(一)采用生物素标记样品及其检测

1.待测样品的标记

依照所检测对象的不同，选择具体的待测样本，依照如下方法提取核酸样品，并对所得待测样品核酸进行生物素标记：

i)按RNA提取方法(参见分子克隆：实验指南中文第三版2002年J.萨姆布鲁克等箸黄培堂等译518-522页)；对待测样品的核酸进行提取，以提取的核酸作模板，采用RT-PCR方法进行扩增标记，在混合液(80ul)中应用随机引物(产品号：D3801公司：TaKaRa)，dNTP(dTTP少加0.5ul)，另加入0.5ul的1mmol/L的Biotin-dUTP进行标记，扩增产物用PCR纯化试剂盒(产品号D301，公司TaKaRa)纯化，产物最终溶解在适量的5×SSC，0.2％SDS溶液中，终浓度为50mg/L。

ii)光敏生物素标记

按RNA提取方法(参见分子克隆实验指南中文第三版2002年J.萨姆布鲁克等箸黄培堂等译518-522页)；对待测样品总RNA进行提取，以提取的核酸作模板，在混合液(100ul)中依照(兽医微生物学1998年中国农业科学院哈尔滨兽医研究所编著中国农业出版社出版691页)中所述的方法，将需标记的核酸溶液加入离心管中，加入等量的1μg/μl光敏生物素(产品号2133222，公司EZ-link)溶液，充分混匀；光照射25-30分钟；完毕后，加灭菌水至总体积为100μl，加入100μl仲丁醇，旋涡混合，3000转/分离心1分钟，小心吸去上层丁醇相。再如上述加入与溶液等量的丁醇提取一次，吸去丁醇；在此混合液中加入5μl 3mol/L醋酸钠(NaOOCCH₃ 2.46g/10ml)充分混合。加100μl冷无水乙醇，置-70℃分钟或-20℃过夜，4℃离心15分钟。弃上清。用80％冷乙醇洗一次，沉淀抽空干燥；沉淀溶于0.1mMol/LEDTA(C₁₀H₁₄N₂O₈Na₄ 4H₂O，45.2mg/L)-20℃冷冻保存，或冻干后4℃保存，用紫外法测定标记核酸含量，备用。

2.基因芯片与待测样品的杂交

配制以下溶液

1)3％BSA封闭液：3gBSA溶于70ml水中，以浓盐酸调PH至3.0。煮沸20分钟后至室温。用10mM NaOH调PH至7.5，加入10ml下述缓冲液(1M Tris-HCl PH7.5；加入MgCl₂190mg，Triton X-100 0.05mlNaCl5.8g，溶解，加水到100ml)。

2)50×Denhardt’s溶液：1g Ficoll 400聚蔗糖，1g PVP40，1g B溶于水，配成100ml。

3)小牛胸腺DNA的制备：100mg/10ml水浸泡软，搅拌，用无针头注射器吸入，装上针头推出，反复几次至DNA长链断裂，溶液变稀。

4)1M PBS/L：NaCl 18g KCl 0.2g Na₂HPO₄ 1.44g KH₂PO₄0.24g加蒸馏水800ml，用HCl调到PH7.4，加水补足到1000ml。

5)100mM/L EDTA：37.2g EDTA溶于1000ml水中。

6)临用前按每cm²用80ul的量配制预杂交和杂交液。如用5×10cm2需用4ml预杂交液和杂交液。配制如下：

                                      预杂交液4ml  杂交液4ml

试剂                                   用量           用量

甲酰胺                                 2.0ml          1.8ml

20×SSC                                1.0ml          1.0ml

50×Denhartd’s                        0.4ml          80ul

小牛胸腺DNA^*                          0.2ml          80ul

光标样品核酸^**                                       80-400ng

1M PBS，PH6.4                          0.2ml          80ul

100mM EDTA                             0.2ml

20％硫酸葡聚糖钠                                      1.0ml

^*用前煮沸10分钟变性，速置冰水中冷却；^**煮沸变性10分钟冷却再加入

预杂交：将点有DNA阵列的膜放入杂交盘圆孔中，加入预杂交液，盖上盖玻片，于42℃中预杂交1-2小时。

杂交：弃去预杂交液，按量加入杂交液和标记好的样品核酸，盖上盖玻片，根据所选的基因芯片，按照发明详述部分披露的具体杂交条件，将膜转移到另外盛有0.1×SSC溶液的孔中洗膜3-4次，准备显色。

3.杂交结果的检测

1)对于生物素标记的样品，显色：

①用3％BSA封闭液42℃封闭2-4小时；

②吸去封闭液，加入4mlAV-AP酶联液(缓冲液：100mM Tris-HClpH7.5，1.0M NaCl，2mM MgCl₂，0.05％(v/v)TritonX-100；4ml缓冲液加入亲和素-碱磷酸酶(AV-AP)8-16U(1U/ul)，在室温下避光轻轻振荡反应15分钟。

③将膜片移到盛有洗涤液(Tris 1.21g NaCl 5.8g MgCl₂ 19mg TritonX-100 0.05ml加80ml水，用HCl调PH至7.5，加水至100ml)的孔中洗涤4次。

④将膜片移到盛有底物溶液(100mM Tris-HCl pH9.5，100mMNaCl，5mM MgCl₂)、BCIP(10mgBCIP溶于200ul DMF中)、NBT(15mgNBT溶200ul 70％的DMF中)的孔中，避光放置几分钟至1小时，直至出显兰紫色斑点，再用水终止反应。

⑤观察记录或用数码像机记录，用计算机软件进行分析。

(二)采用荧光素标记样品及其检测

1.待测样品的标记

按RNA提取方法(参见分子克隆实验指南中文第三版2002年J.萨姆布鲁克等箸黄培堂等译518-522页)对待测样品总RNA进行提取，以提取的核酸作模板，采用RT-PCR方法进行扩增标记，在(体积为80ul)混合液中应用随机引物(产品号D3801公司TaKaRa)，dNTP(dTTP少加0.5ul)，另加入0.5ul的1mmol/L的Cy3-dUTP进行标记，扩增产物用PCR纯化试剂盒(产品号D301公司TaKaRa)纯化，产物最终溶解在适量的5×SSC，0.2％SDS溶液中，终浓度为50mg/L。

2.基因芯片与待测样品的杂交

取标记好的待测样品溶液，加至预先经100℃煮沸30秒变性DNA阵列上，盖上盖玻片置于湿盒中，根据所选的基因芯片，按照说明书详述部分具体披露的杂交条件进行杂交，然后置2×SSC、0.1％SDS溶液中洗5分钟，0.1×SSC、0.1％SDS溶液中洗5分钟，0.1×SSC溶液中荡洗数遍晾干。

3.杂交结果检测

将杂交完毕晾干的DNA阵列用Scan Array 3000(GST LumonicsInc制造)激光共聚焦扫描仪在适当条件下扫描检测其杂交信号。

实施例3本发明所述基因芯片检测结果

采用本发明所述基因芯片，分别对100例病猪的样品进行检测，结果如下：在100个样品中，检测出病毒CSFV的有17例，FMDV有6例，SIV有4例，PRV有23例，PRRSV有13例，TGEV有7例，PPV4有7例，PRCV有6例，PRTV有14例，JEV有3例。其中3例TGEV和PRTV混合感染，2例PRCV和SIV混合感染，5例CSFV和PRV混合感染，14例PRV和PPV混合感染。

上述检测结果，与现有技术之病毒分离法、ELISA法，检测上述病毒符合率为96％。

实施例4

采用本发明所述基因芯片，分别对每种病100例病鸡的样品进行检测，并与现有技术中的血凝抑制法(HI)、病毒分离法(VI)、PCR法进行比较，结果如下表1所示。

表l

从上表可看出基因芯片检测敏感性高于HI、AI，比PCR略低，但PCR一次只能一种病原，而基因芯片一次能检出多种病原。

                        序列表

<110>山东澳兰生物工程研究院

<120>鸡常见传染病诊断性基因芯片及其用途

<130>IDC020045

<160>35

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>508

<212>DNA

<213>Classical swine fever

<400>1

gctcctggtt ggtaacctcg ggaaatcttg ggacggaggt gggagatttg gaacaccttg     60

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<210>2

<211>197

<212>DNA

<213>foot-and-mouth disease

<400>2

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ccaaccctgg gcccttc                                                   197

<210>3

<211>217

<212>DNA

<213>pseudorabies

<400>3

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ttccccacgg aggacgagct tcaacggggg cgtggac                             217

<210>4

<211>255

<212>DNA

<213>procine reproductive and respiratory syndrome

<400>4

cctcctgtat gaacttgcaa actggcaaac tgtcacccct tgtactctta agaaacagta     60

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caagttcgag gacct                                                     255

<210>5

<211>591

<212>DNA

<213>Swine Influenza

<400>5

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<210>6

<211>570

<212>DNA

<213>Transmissible Gastroenteritis

<400>6

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<210>7

<211>429

<212>DNA

<213>Porcine Respiratory Coronavirus

<400>7

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tggcactgc                                                            429

<210>8

<211>158

<212>DNA

<213>Porcine Parvovirus

<400>8

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tgtccatctg gcaagttctc ttgatggcag gcctcttgca gctgcaggga tcgtggtaac    120

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<210>9

<211>887

<212>DNA

<213>Porcine Rotavirus

<400>9

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caatacatcg gcttgcatgt attcaaaggt tataaatggt ccgaaat                  887

<210>10

<211>374

<212>DNA

<213>Japanese Encephalitis

<400>10

cattccaagc gaagcaggag atcctggcag gcctcttgca gctgcaggga tcgtggtaac     60

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ccaacatgga cgtc                                                      374

<210>11

<211>541

<212>DNA

<213>Porcine Epidemic Diarrhoea

<400>11

aggaacgtga cctcaaagac atcccagagg cgtgtgcaaa agccccgttg gaggcataca     60

acaggacact gactactttg ctcacccccc ttggtgattc tatccgcagg atacaagagt    120

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g                                                                    541

<210>12

<211>362

<212>DNA

<213>Newcastle Disease

<400>12

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cc                                                                   362

<210>13

<211>601

<212>DNA

<213>Avian Influenza

<400>13

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cttgtctgta agcacaacca agggatttgc ctcagcactc gtccgtggat tcttgatcgt    600

c                                                                    601

<210>14

<211>367

<212>DNA

<213>Marek’s Disease

<400>14

taacggcgcg cctttaactg aggtacctca ggaattggac tgtataaaaa ttacacagca     60

ggttggtgta gaactcaacc tgtacctaac tgaattgact acagtattcg ggccacaaat    120

aacttcccct gccttaactc agctgactat ccaggcgctt tacaacctag ctggtggtaa    180

tatggattac ttgttgacta agttaggtgt agggaacaac caactcagct cattaattgg    240

tagcggcttg atcaccggca accctattct gtacgactca cagactcaac tcttgggtat    300

acaggtaact ttaccctcag tcggaaacct aaataatatg ccgcgtatcg ctggtctcta    360

tggagtc                                                              367

<210>15

<211>479

<212>DNA

<213>Infectious bursal Disease

<400>15

acccttgtgc tagaccagtg ggtcggttct gtgatagaag aacttgacac ttcatactgt     60

atagagaccg atttggattt gtattgtaca agaatagtga cattccctat gtctcctggt    120

atttattcct gtttgaacgg caatacatcg gcttgcatgt attcaaagac tgaaggcgca    180

cttactacgc catacatgac tctcaaaggc tcagttattg ccaattgcaa gatgacaaca    240

tgcagatgtg cagacccccc gggtatcata tcgcaaaatt atggagaagc tgtgtctcta    300

atagataggc actcatgcaa tgtcttatcc ttggacggga taactttgag gctcagtggg    360

gaatttgatg caacttatca aaagaatatc tcaatactag attctcaagt aatagtgaca    420

ggcaatctcg atatctcaac tgagcttggg aatgtcaaca actggaggca aaggggttc     479

<210>16

<211>600

<212>DNA

<213>Infectious Bronchitis

<400>16

cataactaac ataagggcaa ataaagaggc gtgtgcaaaa gccccgttgg aggcatacaa     60

caggacactg actactttgc tcacccccct tggtgattct atccgcagga tacaagagtc    120

tgtgactaca tccggaggaa ggagacagaa acgctttata ggtgctatta tcggcagtgt    180

agctcttggg gttgcaacag ctgcacagat aacagcagcc tcggccctga tacaagccaa    240

tcagaatgct gccaacatcc tccggcttaa ggagagcatt actgcaacca atgaagctgt    300

acatgaggtc actgacggat tatcacaact agcagtggca gttgggaaga tgcagcagtt    360

tgttaatgac cagtttaata acacagctca ggaattggac tgtataaaaa ttacacagca    420

ggttggtgta gaactcaacc tgtacctaac tgaattgact acagtattcg ggccacaaat    480

aacttcccct gccttaactc agctgactat ccaggcgctt tacaacctag ctggtggtaa    540

tatggattac ttgttgacta agttaggtgt agggaacaac caacaccttg aagaggaccg    600

<210>17

<211>644

<212>DNA

<213>Infectious Laryngotracheitis

<400>17

acgatgactc cgactttcac ctctgatgtt gaccatccgg atcgcgctgg cactgagttg     60

tgtccatctg gcaagttctc ttgatggcag gcctcttgca gctgcaggga tcgtggtaac    120

aggggataaa gcagtcaaca tatacacctc atcccagaca gggtcaatca tagtcaagtt    180

actcccaaat atgcccaagg ataaagaggc gtgtgcaaaa gccccgttgg aggcatacaa    240

caggacactg actactttgc tcacccccct tggtgattct atccgcagga tacaagagtc    300

tgtgactaca tccggaggaa ggagacagaa acgctttata ggtgctatta tcggcagtgt    360

agctcttggg gttgcaacag ctgcacagat aacagcagcc tcggccctga tacaagccaa    420

tcagaatgct gccaacatcc tccggcttaa ggagagcatt actgcaacca atgaagctgt    480

acatgaggtc actgacggat tatcacaact agcagtggca gttgggaaga tgcagcagtt    540

tgttaatgac cagtttaata acacagctca ggaattggac tgtataaaaa ttacacagca    600

ggttggtgta gaactcaacc tgtacctacc acctacctcc aacg                     644

<210>18

<211>238

<212>DNA

<213>Egg Drop Syndrom-1976

<400>18

ttggcgtctt caaggcactg tcacccccct tggtgattct atccgcagga tacaagagtc     60

tgtgactaca tccggaggaa ggagacagaa acgctttata ggtgctatta tcggcagtgt    120

agctcttggg gttgcaacag ctgcacagat aacagcagcc tcggccctga tacaagccaa    180

tcagaatgct gccaacatcc tccggcttaa ggagagcaca gtcagatgca gttgtgtg      238

<210>19

<211>291

<212>DNA

<213>Reticuloendotheliosis

<400>19

catactggag ccaatggttg tcggaaacct aaataatatg cgtgccacct acctggagac     60

cttgtctgta agcacaacca agggatttgc ctcagcactc gtcccaaaag tggtgacaca    120

ggtcggttct gtgatagaag aacttgacac ttcatactgt atagagaccg atttggattt    180

gtattgtaca agaatagtga cattccctat gtctcctggt atttattcct gtttgaacgg    240

caatacatcg gcttgcatgt attcaaagac tgagtacttc gatacaacat t             291

<210>20

<211>140

<212>DNA

<213>Avian Encephalomyelitis

<400>20

gtgagacagc taacttgatg atcccggttg gcgcattcaa ggcgcaagat gggccccaga     60

tcttctacca ggatcccaat acctctgatg ttgaccatcc ggatcgcgct ggcactgagt    120

cgacatcgat acgcgtggtc                                                140

<210>21

<211>675

<212>DNA

<213>Chicken Infectious Anemia

<400>21

gactgtaaga tggcaagacg agctcggcag gcctcttgca gctgcaggga tcgtggtaac     60

aggggataaa gcagtcaaca tatacacctc atcccagaca gggtcaatca tagtcaagtt    120

actcccaaat atgcccaagg ataaagaggc gtgtgcaaaa gccccgttgg aggcatacaa    180

caggacactg actactttgc tcacccccct tggtgattct atccgcagga tacaagagtc    240

tgtgactaca tccggaggaa ggagacagaa acgctttata ggtgctatta tcggcagtgt    300

agctcttggg gttgcaacag ctgcacagat aacagcagcc tcggccctga tacaagccaa    360

tcagaatgct gccaacatcc tccggcttaa ggagagcatt actgcaacca atgaagctgt    420

acatgaggtc actgacggat tatcacaact agcagtggca gttgggaaga tgcagcagtt    480

tgttaatgac cagtttaata acacagctca ggaattggac tgtataaaaa ttacacagca    540

ggttggtgta gaactcaacc tgtacctaac tgaattgact acagtattcg ggccacaaat    600

aacttcccct gccttaactc agctgactat ccaggcgctt atcgcgctgg tacaagaatg    660

agggatcctt cagcc                                                     675

<210>22

<211>730

<212>DNA

<213>Mycoplasma Gallisepticum

<400>22

ggatcccatc cgaccacgaa aaaccccttg gtgattctat ccgcaggata caagagtctg     60

tgactacatc cggaggaagg agacagaaac gctttatagg tgctattatc ggcagtgtag    120

ctcttggggt tgcaacagct gcacagataa cagcagcctc ggccctgata caagccaatc    180

agaatgctgc caacatcctc cggcttaagg agagcattac tgcaaccaat gaagctgtac    240

atgaggtcac tgacggatta tcacaactag cagtggcagt tgggaagatg cagcagtttg    300

ttaatgacca gtttaataac acagctcagg aattggactg tataaaaatt acacagcagg    360

ttggtgtaga actcaacctg tacctaactg aattgactac agtattcggg ccacaaataa    420

cttcccctgc cttaactcag ctgactatcc aggcgcttta caacctagct ggtggtaata    480

tggattactt gttgactaag ttaggtgtag ggaacaacca actcagctca ttaattggta    540

gcggcttgat caccggcaac cctattctgt acgactcaca gactcaactc ttgggtatac    600

aggtaacttt accctcagtc ggaaacctaa ataatatgcg tgccacctac ctggagacct    660

tgtctgtaag cacaaccaag ggatttgcct cagcactcgt cccaatcatc agttactcac    720

tgattgaaag                                                           730

<210>23

<211>206

<212>DNA

<213>Mycoplasma Synoviae

<400>23

gaagcaaata tgatatcaaa cacagctcag gaattggact gtataaaaat tacacagcag     60

gttggtgtag aactcaacct gtacctaact gaattgacta cagtattcgg gccacaaata    120

acttcccctg ccttaactca gctgactatc caggcgcttt acaacctagc tggtggtaat    180

atggattttg ttaacttcga gacgac                                         206

<210>24

<211>558

<212>DNA

<213>Avian Pasteurellosis

<400>24

agagtttgat ctggctcagc caattgcaag atgacaacat gcagatgtgc agaccccccg     60

ggtatcatat cgcaaaatta tggagaagct gtgtctctaa tagataggca ctcatgcaat    120

gtcttatcct tggacgggat aactttgagg ctcagtgggg aatttgatgc aacttatcaa    180

aagaatatct caatactaga ttctcaagta atagtgacag gcaatctcga tatctcaact    240

gagcttggga atgtcaacaa ctcgataagt aatgctttgg ataagttaga ggaaagcaac    300

agcaaactag acaaagtcaa tgtcaaactg accagcacat ctgctctcat tacctatatc    360

gctttaactg ccatatctct tgtttgcggt atacttagtc tggttctagc atgctaccta    420

atgtacaagc aaaaggcgca acaaaagacc ttgttatggc ttgggaataa taccctgggt    480

cagatgagag ccactacaaa aatgtgaatg cagatgagag gcggaggtat ccccaatagc    540

aggctggatc acctcctt                                                  558

<210>25

<211>282

<212>DNA

<213>Salmonelosis

<400>25

gtgaaattac gccacgttcg gcaaacactt catactgtat agagaccgat ttggatttgt     60

attgtacaag aatagtgaca ttccctatgt ctcctggtat ttattcctgt ttgaacggca    120

atacatcggc ttgcatgtat tcaaagactg aaggcgcact tactacgcca tacatgactc    180

tcaaaggctc agttattgcc aattgcaaga tgacaacatg cagatgtgca gaccccccgg    240

gtatcatatc gcaaaattat ggttcctttg acggtgcgat ga                       282

<210>26

<211>324

<212>DNA

<213>Colibacillosis

<400>26

agagtttgat ctggctcagc ccggttggcg cattcaaggc gcaagatggg ccccagatct     60

tctaccagga tcccaatacc tctgatgttg accatccgga tcgcgctggc actgagttgt    120

gtccatctgg caagttctct tgatggcagg cctcttgcag ctgcagggat cgtggtaaca    180

ggggataaag cagtcaacat atacacctca tcccagacag ggtcaatcat agtcaagtta    240

ctcccaaata tgcccaagga taaagaggcg tgtgcaaaag ccccgttgga ggcatacaac    300

aggacactgc tggatcacct cctt                                           324

<210>27

<211>515

<212>DNA

<213>Serpulina hyodysenteriae

<400>27

agagtttgat ctggctcaga cacagctcag gaattggact gtataaaaat tacacagcag     60

gttggtgtag aactcaacct gtacctaact gaattgacta cagtattcgg gccacaaata    120

acttcccctg ccttaactca gctgactatc caggcgcttt acaacctagc tggtggtaat    180

atggattact tgttgactaa gttaggtgta gggaacaacc aactcagctc attaattggt    240

agcggcttga tcaccggcaa ccctattctg tacgactcac agactcaact cttgggtata    300

caggtaactt taccctcagt cggaaaccta aataatatgc gtgccaccta cctggagacc    360

ttgtctgtaa gcacaaccaa gggatttgcc tcagcactcg tcccaaaagt ggtgacacag    420

gtcggttctg tgatagaaga acttgacact tcatactgta tagagaccga tttggatttg    480

tattgtacaa gaatagtgag ctggatcacc tcctt                               515

<210>28

<211>356

<212>DNA

<213>Campylobacter jejuni

<400>28

agagtttgat ctggctcaga gctgactatc caggcgcttt acaacctagc tggtggtaat     60

atggattact tgttgactaa gttaggtgta gggaacaacc aactcagctc attaattggt    120

agcggcttga tcaccggcaa ccctattctg tacgactcac agactcaact cttgggtata    180

caggtaactt taccctcagt cggaaaccta aataatatgc gtgccaccta cctggagacc    240

ttgtctgtaa gcacaaccaa gggatttgcc tcagcactcg tcccaaaagt ggtgacacag    300

gtcggttctg tgatagaaga acttgacact tcatactgtg gctggatcac ctcctt        356

<210>29

<211>796

<212>DNA

<213>Brucella suis

<400>29

agagtttgat ctggctcaga gggatttgcc tcagcactcg tcccaaaagt ggtgacacag     60

gtcggttctg tgatagaaga acttgacact tcatactgta tagagaccga tttggatttg    120

tattgtacaa gaatagtgac attccctatg tctcctggta tttattcctg tttgaacggc    180

aatacatcgg cttgcatgta ttcaaagact gaaggcgcac ttactacgcc atacatgact    240

ctcaaaggct cagttattgc caattgcaag atgacaacat gcagatgtgc agaccccccg    300

ggtatcatat cgcaaaatta tggagaagct gtgtctctaa tagataggca ctcatgcaat    360

gtcttatcct tggacgggat aactttgagg ctcagtgggg aatttgatgc aacttatcaa    420

aagaatatct caatactaga ttctcaagta atagtgacag gcaatctcga tatctcaact    480

gagcttggga atgtcaacaa ctcgataagt aatgctttgg ataagttaga ggaaagcaac    540

agcaaactag acaaagtcaa tgtcaaactg accagcacat ctgctctcat tacctatatc    600

gctttaactg ccatatctct tgtttgcggt atacttagtc tggttctagc atgctaccta    660

atgtacaagc aaaaggcgca acaaaagacc ttgttatggc ttgggaataa taccctgggt    720

cagatgagag ccactacaaa aatgtgaatg cagatgagag gcggaggtat ccccaatagg    780

gctggatcac ctcctt                                                    796

<210>30

<211>626

<212>DNA

<213>Bordetella bronchiseptica

<400>30

agagtttgat ctggctcagc attccctatg tctcctggta tttattcctg tttgaacggc     60

aatacatcgg cttgcatgta ttcaaagact gaaggcgcac ttactacgcc atacatgact    120

ctcaaaggct cagttattgc caattgcaag atgacaacat gcagatgtgc agaccccccg    180

ggtatcatat cgcaaaatta tggagaagct gtgtctctaa tagataggca ctcatgcaat    240

gtcttatcct tggacgggat aactttgagg ctcagtgggg aatttgatgc aacttatcaa    300

aagaatatct caatactaga ttctcaagta atagtgacag gcaatctcga tatctcaact    360

gagcttggga atgtcaacaa ctcgataagt aatgctttgg ataagttaga ggaaagcaac    420

agcaaactag acaaagtcaa tgtcaaactg accagcacat ctgctctcat tacctatatc    480

gctttaactg ccatatctct tgtttgcggt atacttagtc tggttctagc atgctaccta    540

atgtacaagc aaaaggcgca acaaaagacc ttgttatggc ttgggaataa taccctgggt    600

cagatgagag gctggatcac ctcctt                                         626

<210>31

<211>586

<212>DNA

<213>Actinobacillus pleuropneumoniae

<400>31

agagtttgat ctggctcagt cacccccctt ggtgattcta tccgcaggat acaagagtct     60

gtgactacat ccggaggaag gagacagaaa cgctttatag gtgctattat cggcagtgta    120

gctcttgggg ttgcaacagc tgcacagata acagcagcct cggccctgat acaagccaat    180

cagaatgctg ccaacatcct ccggcttaag gagagcatta ctgcaaccaa tgaagctgta    240

catgaggtca ctgacggatt atcacaacta gcagtggcag ttgggaagat gcagcagttt    300

gttaatgacc agtttaataa cacagctcag gaattggact gtataaaaat tacacagcag    360

gttggtgtag aactcaacct gtacctaact gaattgacta cagtattcgg gccacaaata    420

acttcccctg ccttaactca gctgactatc caggcgcttt acaacctagc tggtggtaat    480

atggattact tgttgactaa gttaggtgta gggaacaacc aactcagctc attaattggt    540

agcggcttga tcaccggcaa ccctattctg gctggatcac ctcctt                   586

<210>32

<211>586

<212>DNA

<213>Staphylococcus aureus

<400>32

agagtttgat ctggctcagc tgcacagata acagcagcct cggccctgat acaagccaat     60

cagaatgctg ccaacatcct ccggcttaag gagagcatta ctgcaaccaa tgaagctgta    120

catgaggtca ctgacggatt atcacaacta gcagtggcag ttgggaagat gcagcagttt    180

gttaatgacc agtttaataa cacagctcag gaattggact gtataaaaat tacacagcag    240

gttggtgtag aactcaacct gtacctaact gaattgacta cagtattcgg gccacaaata    300

acttcccctg ccttaactca gctgactatc caggcgcttt acaacctagc tggtggtaat    360

atggattact tgttgactaa gttaggtgta gggaacaacc aactcagctc attaattggt    420

agcggcttga tcaccggcaa ccctattctg tacgactcac agactcaact cttgggtata    480

caggtaactt taccctcagt cggaaaccta aataatatgc gtgccaccta cctggagacc    540

ttgtctgtaa gcacaaccaa gggatttgcg gctggatcac ctcctt                   586

<210>33

<211>796

<212>DNA

<213>Streptococcus suis

<400>33

agagtttgat ctggctcaga gggatttgcc tcagcactcg tcccaaaagt ggtgacacag     60

gtcggttctg tgatagaaga acttgacact tcatactgta tagagaccga tttggatttg    120

tattgtacaa gaatagtgac attccctatg tctcctggta tttattcctg tttgaacggc    180

aatacatcgg cttgcatgta ttcaaagact gaaggcgcac ttactacgcc atacatgact    240

ctcaaaggct cagttattgc caattgcaag atgacaacat gcagatgtgc agaccccccg    300

ggtatcatat cgcaaaatta tggagaagct gtgtctctaa tagataggca ctcatgcaat    360

gtcttatcct tggacgggat aactttgagg ctcagtgggg aatttgatgc aacttatcaa    420

aagaatatct caatactaga ttctcaagta atagtgacag gcaatctcga tatctcaact    480

gagcttggga atgtcaacaa ctcgataagt aatgctttgg ataagttaga ggaaagcaac    540

agcaaactag acaaagtcaa tgtcaaactg accagcacat ctgctctcat tacctatatc    600

gctttaactg ccatatctct tgtttgcggt atacttagtc tggttctagc atgctaccta    660

atgtacaagc aaaaggcgca acaaaagacc ttgttatggc ttgggaataa taccctgggt    720

cagatgagag ccactacaaa aatgtgaatg cagatgagag gcggaggtat ccccaatagg    780

gctggatcac ctcctt                                                    796

<210>34

<211>586

<212>DNA

<213>Bacillus rhusiopathiae suis

<400>34

agagtttgat ctggctcagt cacccccctt ggtgattcta tccgcaggat acaagagtct     60

gtgactacat ccggaggaag gagacagaaa cgctttatag gtgctattat cggcagtgta    120

gctcttgggg ttgcaacagc tgcacagata acagcagcct cggccctgat acaagccaat    180

cagaatgctg ccaacatcct ccggcttaag gagagcatta ctgcaaccaa tgaagctgta    240

catgaggtca ctgacggatt atcacaacta gcagtggcag ttgggaagat gcagcagttt    300

gttaatgacc agtttaataa cacagctcag gaattggact gtataaaaat tacacagcag    360

gttggtgtag aactcaacct gtacctaact gaattgacta cagtattcgg gccacaaata    420

acttcccctg ccttaactca gctgactatc caggcgcttt acaacctagc tggtggtaat    480

atggattact tgttgactaa gttaggtgta gggaacaacc aactcagctc attaattggt    540

agcggcttga tcaccggcaa ccctattctg gctggatcac ctcctt                   586

<210>35

<211>586

<212>DNA

<213>Corynebacterium suis

<400>35

agagtttgat ctggctcagt cacccccctt ggtgattcta tccgcaggat acaagagtct     60

gtgactacat ccggaggaag gagacagaaa cgctttatag gtgctattat cggcagtgta    120

gctcttgggg ttgcaacagc tgcacagata acagcagcct cggccctgat acaagccaat    180

cagaatgctg ccaacatcct ccggcttaag gagagcatta ctgcaaccaa tgaagctgta    240

catgaggtca ctgacggatt atcacaacta gcagtggcag ttgggaagat gcagcagttt    300

gttaatgacc agtttaataa cacagctcag gaattggact gtataaaaat tacacagcag    360

gttggtgtag aactcaacct gtacctaact gaattgacta cagtattcgg gccacaaata    420

acttcccctg ccttaactca gctgactatc caggcgcttt acaacctagc tggtggtaat    480

atggattact tgttgactaa gttaggtgta gggaacaacc aactcagctc attaattggt    540

agcggcttga tcaccggcaa ccctattctg gctggatcac ctcctt                   586