野菱优质工程苗快繁方法

一、技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速繁殖野菱优质工程苗的方法。

二、背景技术

野菱(Trapa incisa)是属于菱科菱属的一年生浮叶水生草本植物。它喜温、喜水和充足的阳光，生长期较长。底部松软肥沃，腐殖质含量高，淤泥沉积厚的河塘、沟渠、湖泊都适宜种养。该物种对水体污染有着较高的耐受性，在水生生态系统修复与重建工程中，可用于净化水质；该物种还含有较多的营养成分，可做果、蔬、粮食用；并且具有较高的药用价值。

野菱已经被列为国家二级重点保护野生植物，对野菱种质资源的保护已日益迫切。一方面，野菱种子在自然条件下的萌发率比较低，另一方面，水体的强度污染，也导致野菱的自然分布日益稀少。当前，市场上对野菱种苗的需求量很大，在试验和生态工程中都有应用，但种源大多来自自然环境，大量打捞容易导致原产地生境的破坏；虽然可用野菱种子种植来弥补，但种植不仅需要合适的水生环境和较长时间，而且还受本身种子萌发率低的限制。另外，自然生境的野菱常带有各种杂藻杂菌，容易造成移植生境的污染和有关生理生态试验的误差。

迄今国内外未见有关野菱无菌苗的人工扩繁培养的研究与报道。本方法是利用野菱的胚芽，采用不同的消毒方法和培养基质，产生无菌苗，并且从无菌苗进行快速扩繁。

三、发明内容

本发明的目的是：利用植物组织培养方法，获得并在室内大规模繁殖野菱优质工程苗，应用于国家重点保护野生植物的种质资源保护工作，并克服该物种野外收集有限且污染严重的弊端，适应我国淡水湖泊植被恢复、生态工程育苗以及野菱生理生态研究的需要。

本发明的技术方案是：

1.野菱无菌幼苗的获得

从野外自然生境中采集野菱的果实，置于2℃-4℃中冷藏一周，打破休眠。随后，取出其中的胚芽，于肥皂水中浸泡2h，用自来水冲洗干净并在流水下浸泡过夜。在超净工作室中，用75％酒精浸泡20s，用无菌水漂洗后再放入AgNO₃中浸泡7-10min，用无菌水彻底漂洗后接种于培养液①，见表1，并置于组织培养室中培养。室内平均光照强度2000lx，每日光照10h，温度为25℃。期间注意观察，随时剔除仍然污染的材料，以免交叉感染。

2.野菱出芽诱导

由上述步骤获得的有明显的根系的无菌幼苗，于超净工作室中，转接到培养基②中。2周以后，植株开始长壮，并在茎节处萌发新芽。待植株长到1cm，将其转入培养基③，刺激植株更多的萌发新芽，重复上述方法，以获得足够多的无菌幼苗。上述扩增培养过程仍在组培室中进行，光照和温度不变。

                        表1.野菱培养液①、②、③配方

^*上述培养液按浓度配好后均用稀HCl或NaOH调整pH到5.8，分装到100mL三角瓶中，用封口膜包扎后于120℃、0.1MPa左右湿热灭菌20min。

3.野菱工程苗的壮苗

将上述培养基中约5cm的野菱无菌苗取出，移栽到底部铺有灭过菌的沙石的培养缸中。保持水深20cm，每周换水并添加10％的Hoagland营养液以促进其生长。当室外白昼气温20℃以上时，将培养缸置于室外，直接利用太阳光照；否则，将培养缸置于温室中，昼夜温度分别保持18℃和25℃，并在白天适当补充人工光照至2500lx。上述培养保持到植株长至20cm以上。

4.野菱工程苗的应用

(1)通过上述步骤2培养后，收获根系发达、植株长于20cm的健康野菱小苗，取出洗净，直接应用于试验，避免杂菌杂藻的影响。

(2)通过上述步骤3培养后，获得的株高30cm以上、根系发达的健康野菱植株；收获时尽量保持其根系的完整，投放到水生植被恢复重建的工程区，并根据实地的退化程度，决定其栽种量和栽种密度，并可采用单一物种移植或者和其他物种混合移植。

本发明的效果在于：

1)获得了野菱的无菌苗。野外采集的野菱原材料本身污染严重，而本方法先用较温和的肥皂水洗涤浸泡，然后在流水下冲洗以初步降低污染，然后通过75％酒精和AgNO₃彻底灭菌，在培养液①中培养。该灭菌方法可以保证无菌率达80％，存活率达60％以上。

2)建立了野菱工程苗快速繁殖途径。经过一段时间的驯化培养，野菱每2w在培养基②和③的培养条件下的芽增殖率达1∶3以上(即每个单株苗经2w的培养，至少可以获得3株苗)。而每个新生的小苗，可以继续进行以上的芽增殖操作。技术简单，操作方便，而且所用的试剂均为常规化工产品，成本低廉，有利于大规模的工厂化生产。而且本方法主要利用的是野菱的营养繁殖，避免了遗传变异的可能性。

3)本项发明可不分季节，随时为湖泊植被恢复和利用野菱进行的生理生态实验，提供足够的优质工程苗，在湖泊水生生态系统恢复和重建工程中发挥重要作用。