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2015-08-05
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):A61K36/815 授权公告日:20090311 终止日期:20140608 申请日:20040608
专利权的终止
2012-03-28
专利权的转移 IPC(主分类):A61K36/815 变更前: 变更后: 登记生效日:20120220 申请日:20040608
专利申请权、专利权的转移
2010-11-24
专利权的转移 IPC(主分类):A61K36/815 变更前: 变更后: 登记生效日:20101019 申请日:20040608
专利申请权、专利权的转移
2010-06-30
专利权的转移 IPC(主分类):A61K36/815 变更前: 变更后: 登记生效日:20100526 申请日:20040608
专利申请权、专利权的转移
2010-03-10
专利申请权、专利权的转移(专利权的转移) 变更前: 变更后: 登记生效日:20100205 申请日:20040608
专利申请权、专利权的转移(专利权的转移)
2009-06-24
专利实施许可合同的备案 合同备案号:2009440000292 让与人:广州和竺生物科技有限公司 受让人:广州诺金制药有限公司 发明名称:一种含多种维生素的护肝制剂的生物学药理学作用及其制备方法 授权公告日:20090311 许可种类:独占许可 备案日期:2009.4.23 合同履行期限:2009.3.16至2017.3.16合同变更 申请日:20040608
专利实施许可合同的备案
2009-03-11
授权
授权
2007-08-08
专利申请权、专利权的转移专利申请权的转移 变更前: 变更后: 登记生效日:20070706 申请日:20040608
专利申请权、专利权的转移专利申请权的转移
2007-04-25
实质审查的生效
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2005-12-14
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技术领域 本发明涉及由肝脏和新鲜护肝中草药提取物、甜菜碱、精氨酸辅以多种维生素(特别是E，A，B1，B2，B6，B12，C，烟酸，叶酸等)、乳清蛋白粉制造的多维护肝生物制剂，能保护肝细胞和肝血窦内皮细胞，抑制肝细胞凋亡和保护肝功能抗肝损害和癌变等领域
背景技术 我国是病毒性肝炎高发区，约有1.7亿人携带乙型肝炎病毒，其中暴发性肝炎发病率每年高达60万人左右，暴发性肝炎发病凶险，病死率高达70-80％，为严重危害我国人民健康的疾病之一。肝炎三部慢性肝炎的最终结局包括康复、肝纤维化与肝硬化、肝癌。肝病引起的肝功能失代偿已成为严重威胁肝病患者并致残致死的主要原因。随着人们的生活水平的不断提高，加之饮食不健康，酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化(alcoholic hepatic scleroses，AHS)和非酒精性肝硬化(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)发病率也逐年递增，最终也能引起肝功能失代偿。此外，还有一些不明原因的肝损害，如长期营养不良，偏食，营养不平衡，维生素缺乏，过度疲劳，长期口服对肝有损害的药物，长期接触有害气体或液体，长期饮用有害井水或河水，长期食用农药污染的食品，均有可能导致肝损害或肝纤维化，甚至肝硬化和肝癌。肝提取物能促进肝细胞生长，保护受损肝细胞已为诸多的研究所证实(参考文献1)，如广州空军医院的促肝细胞生长素已临床应用多年，取得了很好的临床疗效(参考文献2)。
甜菜碱是一种化学渗透剂，化学名为三甲铵乙内酯，分子式为(CH3)3NCH2COOH.Cl/NO3，分子量为118+35.5/62，它在植物、蔬菜、中草药中含量丰富，也可化学合成。它一般作为一种表面活化剂用于化妆品，牙膏或高级的清洗剂。国外也有人如意大利(所在国药典)，美国用于治疗酒精性肝炎和各种原因引起的非特异性肝炎，肝硬化(Barak，et al.Use of betaine as a hepatic generator of S-adenosylmethionine and as aprotective agent against hepatotoxicity，United States Patent，5,428,063)，且属于20世纪90年代的专利，而在国内目前尚未受到重视(中国专利检索和文献检索)。
大量的研究表明，甜菜碱可以通过增强血红素氧化酶的表达，促进肝细胞内内源性的CO产生，低浓度的CO具有保护细胞和抑制细胞凋亡的作用；促进鸟甘酸环化酶的活性，使c-GMP浓度增加，激活丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)，抑制细胞凋亡途径；和促进肝内S-腺甘蛋氨酸的合成，抑制蛋白激酶C(PKC)的活性来保护肝细胞。
在动物体内，甜菜碱是由胆碱在肝内由胆碱氧化酶(人类缺乏此酶)催化合成，它参与了氨基酸的合成和代谢，它是甜菜碱同型高半胱氨酸甲基转移酶的底物，参与同型高半胱氨酸经甲基化成蛋氨酸(替代途径)，它也是体内S-腺苷蛋氨酸的主要来源，S-腺苷蛋氨酸是体内一碳单位(甲基)的主要供体，参与体内包括核酸合成，蛋白质代谢，氨基酸代谢，血红素的合成与代谢，CO的合成，谷胱苷肽的合成与还原，细胞膜磷脂的代谢等等。体内一碳单位(甲基)代谢正常对维持肝干细胞在增殖过程中的DNA稳定性以达到防止各型肝炎癌变具有十分重要的意义。
最近的研究表明，在胆汁酸诱导的肝损害动物模型中，甜菜碱可通过稳定线粒体膜，抑制细胞色素C从线粒体中释放入细胞浆，从而抑制Caspase-9的活化，最终抑制细胞凋亡和保护肝细胞。在酒精性损伤的小鼠肝损害模型中，甜菜碱可通过保护由乙醛致损害的肝细胞内质网膜，抑制内质网膜应激蛋白的释放，从而抑制Caspase-12的活化来保护肝细胞；此外还可以促进内质网膜合成磷脂酰胆碱而促进脂蛋白(VLDL)合成和促进脂肪从肝细胞内释放，从而促进肝内脂肪向肝外转移，达到治疗脂肪肝的作用。
肝干细胞具有干细胞增殖和分化的能力，又有肝细胞的基本功能。正常成年肝脏是一个相对静止的器官，肝细胞对于生长信号的反应因损伤程度的大小而异。当成熟肝细胞连续丢失或/和生长反应被抑制时，肝干细胞被激活、扩增；但如果肝脏大部分被毁损或由于某些原因使肝细胞增生受到抑制，肝脏干细胞则被激活、增生，产生卵圆细胞，并进一步分化为肝细胞和胆管细胞。有研究提示，在丙烯基乙醇合并四氯化碳中毒性肝损伤的大鼠模型中，在大鼠中毒24小时后肝腺泡内未坏死的肝细胞开始增生；当中毒持续到48小时后，门脉区域边缘的细胞开始增生，而后进入肝腺泡并分化为肝细胞，此过程即可能为肝脏干细胞的增生(Werlich等，1999)。现有的研究表明，急性重型肝炎、慢性肝炎反复发作，慢性酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化，其炎症所致的肝细胞损失很大一部分依赖肝干细胞扩增补充，因此，保护肝细胞和肝干细胞对维护正常肝功能具有十分重要的意义。同时，肝干细胞是肝细胞癌和胆管细胞癌的主要前体细胞，慢性肝炎所致的肝干细胞反复扩增，在增殖的过程中由于各种氧自由基或核苷酸甲基化受损而导致DNA突变引发细胞癌变的机率增加，因此，保护肝干细胞在增殖的过程中DNA不突变已成为防治慢性肝炎癌变的重要分子生物学的理论基础。
致病因子反复作用引发肝实质细胞、肝内皮细胞的大量损伤或死亡，损伤的肝细胞又分泌大量的炎性因子诱导肝星状细胞(即Ito细胞)的激活、增殖、迁移和细胞基质分泌的增加，上述因子共同作用是导致肝纤维化的直接诱因。因此保护肝细胞和肝血窦内皮细胞对防止肝病的发生发展具有十分重要的意义。目前的国内外许多研究重点主要集中于损害的肝实质细胞、kupffer细胞和Ito细胞，而对肝血窦内皮细胞(hepatic sinusoidal endothelial cells，HSEC)的结构和功能紊乱未引起足够的重视。其实，HSEC是最早接触炎细胞、致病因子和炎性分子的部位，其结构功能紊乱直接影响肝细胞、kupffer细胞和Ito细胞的物质代谢，信号传导以及功能紊乱。近年来，随着HSEC分离培养技术的成熟和研究的深入，其在肝功能活动及肝病的发生发展中显示了越来越重要的作用。HSEC同连续的肝毛细血管内皮细胞(hepatic capilliary endothelialcells，HCEC)在结构，功能上均显示有明显的差异。肝病时，HSEC被HCEC取代也是肝纤维化和门脉高压的发生机理之一，此外，HSEC的结构功能紊乱和其分泌一系列炎性因子和粘附分子又进一步地促进肝炎、肝损害的发生发展。因此，寻找特异保护HSEC功能的药物，维持其正常生理功能及纠正其异常的病理改变，将为肝脏疾病提供新的防治措施。
HSEC是肝非肝实质细胞中数量最大的一种细胞，约占肝实质细胞总数的50％，HSEC在肝功能活动中发挥重要的作用，HSEC的损伤可直接影响到肝细胞的营养及物质交换。研究表明：内皮细胞源性NO是一种血管舒张因子。它是在一氧化氮合成酶(NOS)的作用下，由L-精氨酸的氮和氧分子结合生成的。HSEC能生成NO和内皮素-1(ET-1)，两者通过旁分泌作用于邻近细胞，调节和稳定肝循环的血流。在肝硬化时，倘若能有效控制肝内ET-1和NO的合成及其作用，则可能有利于改善门脉高压。
HSEC窗孔是狄斯间隙内外进行物质交换的重要通道，是维持肝细胞微循环稳定的重要结构。窗孔的变化与细胞骨架有关，其调节受细胞内钙离子浓度的影响，同时肌动蛋白的分布和状态对窗孔的变化也起重要调节作用。若致病因素使HSEC窗孔变小或消失，富含胆固醇的乳糜微粒降解物不能经狄斯间隙被肝细胞摄取，以至肝细胞合成胆固醇的负调节作用减弱，内源性胆固醇合成增多，血液中的LDL、胆固醇和甘油三酯增多，易致动脉粥样硬化。另外，窗孔变化也影响肝细胞外源性脂质蛋白、维生素和碳水化合物的摄取，贮脂细胞内的维生素A减少易转化为成纤维细胞，基膜和胶原生成增多，有可能导致肝脂肪变和肝纤维化。肝病时维生素在肝脏的储存、利用、代谢均受到影响，同时维生素代谢障碍更会加重肝病的发生发展。
肝脏是三大代谢(糖、脂肪、蛋白质)的中枢，又是重要的内分泌器官，是体内生化解毒的唯一脏器。因此，肝功能失常可引发一系列疾病，糖代谢异常可引起非胰岛素依赖性的肝源性糖尿病；脂肪代谢异常可引起高脂血症，血液中的LDL、胆固醇和甘油三酯增多，易致动脉粥样硬化；蛋白质和核酸代谢异常可引起尿酸增多引发痛风和假神经递质增多引发神经质、肝昏迷；内分泌功能异常可引起体内雌激素增多产生血管扩张和蜘蛛痣；解毒功能异常更加重了肝脏的损害。因此肝脏保护的研究十分重要，保护肝功能即保护了人的生命之源。
发明内容 本发明提供了多维护肝生物制剂的制备方法和用途，它能保护肝干细胞，肝细胞，促进肝细胞生长，保护肝血窦内皮细胞，抑制由化学药物(包括酒类)引起的肝细胞和肝干细胞凋亡，从而保护受损的肝脏和肝功能。防止由肝炎(病毒性)和酒精(化学性)引起的肝损害，阻止肝损害的继续发展以及肝纤维化、肝硬化和肝癌的产生，特别是在防止慢性肝炎癌变方面具有重要的意义，临床上和实践中可用于治疗各型肝炎、肝纤维化和肝硬化，急慢性酒精中毒，脂肪肝等；也可作为保健食品或食品添加剂用于正常人的肝脏保护。
一、配方组成原理：保护肝细胞膜，促进肝细胞生长，抑制肝细胞凋亡；保护肝血窦内皮细胞，改善肝脏肝血窦的微循环，经过提供甲基，降低血中和肝中同型半胱氨酸水平，保护肝干细胞并且维持肝细胞增殖时DNA的完整性而抑制细胞癌变。动物实验证明：多维护肝生物制剂能保护由化学性药物引起的肝损害，能降低血中肝酶(ALT)的活性。大样本人体实验证实：多维护肝生物制剂临床应用安全有效。
二、配方组成和各成分的作用
1、甜菜碱：甜菜碱可以稳定线粒体膜和内质网膜，抑制细胞色素C从线粒体中释放入细胞浆，从而抑制Caspase-9的活化，抑制内质网膜依赖性的Caspase-12的活化，最终抑制细胞凋亡和保护肝细胞。
甜菜碱在人体内不能合成，故属于维生素类的一种物质，因其具有多种生理、生化和广谱抗损害抗凋亡抗细胞癌变的功能，因此，它还可用于肝病患者的防癌变、保健和防衰老。
国外文献和专利均只注重甜菜碱的对酒精性肝炎和脂肪肝的治疗作用，而对其的正常保健作用则未提及，且其治疗作用的剂量高达500-2000mg/kg体重(小鼠)。许多植物和中草药(如枸杞、当归、甜菜叶等)具有明显的保健作用是因为其中含有丰富的甜菜碱，维生素等。我们发现(专利申请号200410026632.1，甜菜碱的新用途-保护肝干细胞、抑制凋亡和保护肝功能)甜菜碱在低浓度时能维持肝细胞和肝干细胞的生长和抑制凋亡，因此，本发明的另一目的是多维护肝生物制剂可用于正常人、老年人、工作生活紧张、长期服用有害药物和体弱多病者的正常生理保健。
2、精氨酸：正常条件下机体对Arg的需求可通过内源性途径满足，而在应激时则不能满足机体所需。对幼年、创伤或疾病恢复期的动物来说，膳食Arg对其生长和恢复是必需的，可将其归入条件性必需氨基酸或半必需氨基酸。
肝中合成的Arg仅作为尿素循环的一过性中间产物，不能输送至血中循环被肝外组织利用(如合成NO)。Arg可增强健康及应激条件下淋巴细胞对促分裂原的反应性，对内分泌调节作用，体外肿瘤细胞毒作用以及分泌NO体内抗肿瘤作用等。血管内皮细胞生成的NO进入邻近的血管平滑肌细胞后，引起cGMP升高，进而促使血管平滑肌舒张(内皮舒张功能)。此外，NO还可促使K通道开放，而同时抑制L型Ca2通道开放，这些作用也可引起血管舒张。
血管内皮细胞还能合成内皮素(ET-1)，ET-1能引起血管平滑肌收缩。在生理条件下，NO与ET-1保持动态平衡，共同调节血管紧张度，这是维持血压与血流正常的重要物质基础。在肝硬化时，倘若能有效控制肝内ET-1和NO的合成及其作用，则可能有利于改善门脉高压。此外，精氨酸还直接参与了腐胺-亚精胺-精胺的代谢，在体内能促进细胞增殖和细胞保护。
治疗剂量的精氨酸为200-4000mg/kg(小鼠)，本发明采用其生理所需剂量，人为0.5-50mg/kg，用于慢性肝病患者的治疗和保健，以及正常人和亚健康人的保健。
3、维生素E：又称生育酚，能调理内分泌，对生殖功能和脂质代谢均有影响，可以抗氧自由基和软化血管的功效。
4、维生素A，具有促进生长，维持上皮细胞的正常功能的作用，参与体内许多氧化过程，尤其是不饱和脂肪酸的氧化，抑制癌的形成，增强免疫力。
5、维生素C，抗坏血病，在生物氧化及还原中，和细胞呼吸中起重要作用。
6、维生素B1，在体内与焦磷酸结合成辅羧酶，参与丙酮酸的氧化脱羧反应。
7、维生素B2，为黄素酶类辅基的组成部分，参与生物氧化。
8、维生素B6，为氨基转移酶、脱羧酶的辅酶，参与许多代谢过程。
9、维生素B12，与甜菜碱，四氢叶酸，S-腺苷蛋氨酸一起参与的一碳单位(甲基)途径。
10、烟酸，为辅酶I，II的组成成分，在生物氧化中起到加氧脱氢的作用。
11、生物素，参与三大代谢。
12、叶酸，参与甜菜碱，四氢叶酸，S-腺苷蛋氨酸的一碳单位(甲基)途径，可防止细胞增殖时基因突变和不正常的DNA和RNA形成。
13、金属离子如锌，硒等，做为如甜菜碱同型半胱氨酸甲基转移酶的辅酶或多聚体酶聚合时的辅助因子。
14、乳清蛋白：补充蛋白及氨基酸。
15、中草药提取物，如枸杞，当归，西洋参，黄芪，甘草等，含各种植物多糖，免疫调节剂等。
16：肝提取物，采用常规生化方法提取，真空或真空喷雾干燥。
本发明结果显示，多维护肝生物制剂可保护由CCl4诱发的大鼠急性暴发性肝损害，明显降低其死亡率，降低血清中GOT，AST等肝酶的活力，改善肝组织坏死的形态学变化。多维护肝生物制剂长期应用可保护由四氯化碳诱发的大、小鼠慢性肝损害，明显降低血清中r-GT，碱性磷酸酶，透明质酸酶等酶的活力，减轻慢性肝坏死，肝纤维化和肝脂肪化的形态学改变。
根据其药理作用，多维护肝生物制剂可用于人(酒精性、病毒和非特异性)肝炎、肝硬化、肝功能失代偿和脂肪肝的预防和治疗，特别是各型癌前期病变的治疗和防止向恶性转化。
多维护肝生物制剂具有多种生理、生化和广谱抗损害抗凋亡的功能，因此，它还可用于正常人或亚健康人的保健，用于防治由肝脏疾病造成的如血脂升高和同型半胱氨酸血症引起的血管粥样硬化，核苷酸代谢异常引起的痛风，肝源性的糖尿病和早老性痴呆等。
根据多维护肝生物制剂的上述用途，它可与其它制剂或药物配伍使用，也可作为混合制剂使用。可以单一或与其它药物混合制成胶囊剂、口服液、颗粒剂，片剂或注射剂，可以口服或静脉注射。
具体实施方式 下面结合实施例对本发明做进一步的说明
实施例一、多维护肝生物制剂的配方组成。
肝提取物，0-200mg，优选20mg；植物提取物，0-200mg，优选20mg；甜菜碱，10-5000mg，优选250mg；精氨酸10-500mg，优选50mg；维生素E 0-50mg，优选5mg；维生素A 0-1mg，优选0.3mg；维生素B1 0-2mg，优选0.3mg；维生素B2 0-2mg，优选0.4mg；维生素B6 0-4mg，优选0.5mg；维生素B12 0-20μg，优选3μg；维生素C 0-200mg，优选30mg；叶酸0-2mg，优选0.2mg；生物素，0-200μg，优选20μg；泛酸，0-20mg，优选2mg；烟酸，0-200mg，优选10mg；各种微量元素，乳清蛋白粉，赋型剂等，总量为0.5-2g。
实施例二、肝提取物的制备，选取健康幼年动物肝，如猪肝(成猪＜50kg)，按常规生化方法提取，真空喷雾干燥。具体方法如下：
取肝称重，按肝重∶水＝1∶2加蒸馏水，匀浆；
加热95℃，离心/过滤，取上清；
真空冷冻或真空喷雾干燥即得。
实施例三、植物提取物的制备，选取中草药植物的种子或根(最好是新鲜的如枸杞、当归、西洋参、人参、甘草或黄芪等)，采取水浸泡和文火煮，提取水剂，过滤，浓缩，真空干燥或喷雾干燥即得。
实施例四、肝提取物对肝再生的影响。
实验方法参照文献1方法，步骤简述如下：
雄性SD大鼠(购自第一军医大学实验动物中心)，体重180-220克，40只，自由饮食。行34-40％肝部分切除后的大白鼠随机分为5组。术后4小时分别腹腔注射0，2，5，10，20mg肝提取物。如术后30小时杀鼠取肝，切片，HE染色，行形态学观察和有丝分裂计数。
结果：
1、肝提取物对大鼠肝部分切除后肝再生组织形态学的影响
对照组术后30小时肝组织形态没有明显的改变，可见部分肝细胞肥大，细胞核深染，肝血窦变窄，肝细胞有丝分裂像常见于肝小叶的中外带；而实验组肝组织形态同对照组相似，但肝细胞肥大更明显，细胞核的变化更大，肝细胞有丝分裂相明显增加，多位于肝小叶的中外带，偶可见于小叶中央。
2、肝提取物对大鼠肝部分切除后肝再生的影响(表1)
表1肝提取物对大鼠肝部分切除后肝细胞有丝分裂的影响(x±s，n＝8)
*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group
结论：肝提取物能明显促进34％肝部分切除后大鼠肝细胞的有丝分裂，并呈剂量依赖性。
实施例五、甜菜碱对CCl4损伤的大鼠急性肝损伤的影响
CCl4进入体内后，经肝脏细胞色素P450激活，生成三氯甲基自由基(CCl3·)，通过氢的吸附而攻击内质网膜上的磷脂分子，引起膜的脂质过氧化，CCl3·继而与膜脂质和蛋白质大分子进行共价结合，引起膜结构和功能完整性的破坏，CCl3·还可抑制细胞膜和微粒体膜上钙离子泵的活性，使Ca2+离子内流增加，从而引起细胞中毒死亡。本实施例利用CCl4制作肝损伤小鼠模型，观察甜菜碱对小鼠肝损害的保护作用。
1、材料与方法：
1.1健康雄性HIH小鼠32只，由我中山大学医学院实验动物中心提供，体重18～20g，分笼饲养，标准饮食，自由饮水，在本实验室饲养一周后用于实验。
1.2随机分4组，空白对照组、四氯化碳(2.0ml/kg)模型组及高、低剂量甜菜碱组，每组8只。高、低两个剂量的甜菜碱组给药剂量分别600mg/kg和300mg/kg，灌胃给药，连续10天，CCl4染毒24h后，摘取眼球，取血，分离血清。将小鼠断头处死，立即取肝，用生理盐水洗残血，然后固定于pH7.4 PBS配成的10％甲醛溶液中，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色。于光镜下观察。
1.3血清中丙氨酸转氨酶(alaninetransaminase，ALT)和天门冬氨酸转氨酶(aspartatetransaminase，AST)，用赖氏法测定，单位为U/100ml血清。
2、结果及讨论
2.1形态学观察结果表明，CCl4组，小鼠肝细胞条索排列紊乱，肝细胞广泛水样变性，出观细胞核固缩，细胞坏死，并有炎性细胞浸润和肝门V充血。而给甜菜碱组，肝损伤则明显减轻，肝小叶结构清楚，可见肝细胞索围绕中央静脉仍呈放射状分布。仅有少量水样变性，但无明显肝细胞坏死，也无炎性细胞浸润和门V充血。光镜检查表明，甜菜碱明显减轻CCl4对肝组织的损伤。
2.2血清酶学结果显示，甜菜碱能降低CCl4造成的急性肝损伤小鼠的ALT，AST活性并呈剂量相关(表2)。
表2甜菜碱对CCl4肝损伤小鼠血清转氨酶的影响(x±s，n＝8)
*P＜0.05，**P＜0.01 compared with CCl4group
2.3结果显示：甜菜碱对急性化学性肝损害具有保护作用。
实施例六、甜菜碱对CCl4慢性肝损伤小鼠肝动物模型的影响
1、目的：观察甜菜碱对小鼠CCl4慢性损伤肝炎的治疗作用。
2、材料和方法：
2.1材料A、动物：18-22g雌性BALB/C小鼠，30只，由中山医科大学实验动物中心提供。B、试剂：1)CCl4广州化学试剂公司产品。2)甜菜碱，Sigma公司产品(St.Louis，MO，USA)。3)戍巴比妥钠，广州化学试剂公司产品。
2.2方法 小鼠慢性肝炎模型 雌性BALB/C小鼠，随机分组。禁食12h后，按0.5ml/kg体重腹腔注射CCl4(10％石蜡油溶液)，每周二次，共八次。
实验分为三组，甜菜碱组按600mg/kg体重每日灌胃，正常对照组及损伤对照组给予相应的生理盐水。最后一次给药第三天杀鼠，取血测定ALT和血清白蛋白(A，g/L)。同时取肝大叶相同部位的一小块肝组织，用10％福尔马林固定后，做病理切片检查。实验还统计动物的总存活率。
3、结果
3.1CCl4中毒组，肝小叶周围炎性细胞浸润明显，可见纤维组织增生，小叶中心大部肝细胞坏死明显，部分肝细胞脂肪变，空泡样变明显；甜菜碱治疗组的肝组织学改变与CCl4中毒组有明显不同，多数视野未见肝纤维组织增生和明显肝细胞坏死，炎性细胞浸润及脂肪样变性较轻。
3.2血清酶学及血清白蛋白检查结果见表3。
表3甜菜碱对CCl4慢性肝损伤小鼠血清转氨酶和血清白蛋白的影响(x±s，n＝10)
**P＜0.01 compared with CCl4 group
4、结果显示，甜菜碱可以改善慢性肝损害肝组织空泡样变性、肝脂肪化和纤维化的形态学改变，明显降低血清中肝转氨酶和提升血清中白蛋白的含量，保护肝功能。
实施例七、利用甜菜碱和精氨酸为主料，配以肝提取物(或肝浸膏)、多种维生素、植物提取物和蛋白粉及辅料可以制成口服液，胶囊剂，或口服片或咀嚼片(保健食品)。
最优配方：甜菜碱500份：精氨酸50份：肝提取物20份：VB110份：VB220份：VB650份：VB122份：VE 100份：VA 5份：VC50份：烟酸50份：生物素0.3份：叶酸2份：中草药(如枸杞)提取物100份：乳清蛋白粉200份；微量元素。
选择配方可以甜菜碱为主料任选上述二-十六种组合而成，组合的量可随要求而变，如甜菜碱可为10-500份，精氨酸1-100份，肝提取物可为0-100份，VB1可为0-50份，VE可为0-200份等等。
实施例八、最优配方(多维护肝片)对小鼠CCl4慢性肝损伤模型的影响
1、实验方法参照实施例五，利用甜菜碱500g：精氨酸50g：肝提取物20g：VB110g：VB220g：VB120.2g：VE100g：VA 5g：VC50g：烟酸50g：生物素0.3g：叶酸2g：枸杞提取物100g：乳清蛋白粉200g；加以小鼠饲料9公斤配成多维护肝小鼠饲料。以甜菜碱500g加小鼠饲料9.5kg配成甜菜碱小鼠饲料，以普通小鼠饲料为对照，观察最优配方和甜菜碱对小鼠CCl4慢性肝损伤的保护作用。上述动物在第9周断头处死，取血清按常规方法测定谷丙转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)。取肝右叶，常规HE和VG染色。用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统测量VG染色胶原纤维的总面积和面积百分数。
2、结果
2.1病理学检测：CCl4对照组：正常的肝小叶结构被破坏，由广泛增生的纤维组织将肝小叶分割，包绕成大小不等的肝细胞团，形成假小叶，假小叶内部肝细胞肿胀变圆，胞浆呈网状(水变性)，部分肝细胞脂肪变性，其胞浆内可见肝细胞的点状坏死。而多维护肝组的肝细胞的脂肪变性和水变性明显减轻，纤维结缔组织明显减少，未见明显的假小叶形成。甜菜碱组与CCl4对照组相比较，胶原纤维增生明显减轻，围绕假小叶周围。部分肝细胞有脂肪变性，但未见到明显的水泡样变性。
2.2甜菜碱和多维护肝饲料对实验大鼠ALT和ALP活性影响(表4)
表4甜菜碱和多维护肝饲料对CCl4慢性肝损伤小鼠转氨酶和碱性磷酸酶(x±s，n＝10)的影响
**P＜0.01 compared with CCl4 group
2.3甜菜碱和多维护肝片对肝组织中胶原的影响(表5)
CCl4对照组胶原面积和总面积比百分数明显增加，而甜菜碱和多维护肝组与CCl4对照组相比明显下降，有显著性差异(P＜001)见表5。
表5甜菜碱和多维护肝饲料对总面积和胶原面积百分数(x±s，n＝10)的影响
**P＜0.01 compared with CCl4 group
3、结果显示：最优配方和甜菜碱均能保护由CCl4引起的小鼠慢性肝损伤和抵抗肝纤维化。
实施例九、根据多维生物护肝制剂的生物学特性和药理作用，多维生物护肝制剂的动物抑癌试验和防致突、致癌试验正在设计实验中。
实施例十、根据多维生物护肝制剂的生物学特性和药理作用，以及甜菜碱能保护肝细胞膜，促进肝细胞生长，抑制肝细胞凋亡；保护肝血窦内皮细胞，改善肝脏血窦的微循环。动物实验证明：多维生物护肝制剂能保护由化学性药物引起的肝损害，能降低血中肝酶(ALT)的活性。因国家药品管理法和保健食品卫生管理法的限制，多维生物护肝制剂目前无法进行大样本人体实验，因而在临床上无法知其确切疗效。但可以预测：多维生物护肝制剂应用安全有效，能够保护肝细胞，促进肝细胞生长，抑制肝细胞凋亡和保护肝血窦内皮细胞的药品或保健食品，以达到保护肝细胞，防止由肝炎(病毒性)和酒精(化学性)引起的肝损害，阻止肝损害的继续发展以及肝纤维化、肝硬化和肝癌的产生，维护人们的身体健康。
参考文献
1、邹清雁，邹炯光.大鼠再生肝提取物对肝再生中肝细胞增殖的影响，解剖学杂志 1991；(4)：354-356
2、张宜俊，孔祥平，郑国池，等.促肝细胞生长素治疗慢性病毒性肝炎1668例疗效观察。临床肝胆病杂志 1995；11(3)：137-140
机译： 含黑莓醋的护肝饮料及其制备方法
机译： 铂（IV）-二胺络合物，该化合物的制备方法，具有至少一种含铂化合物的抗肿瘤活性的制剂，含有抗肿瘤活性的制剂
机译： 一种用于患者的肠内和肠胃外营养的含半乳糖的制剂的制备方法
