地锦体细胞胚发生途径的植株再生方法以及用于该方法的培养基

                                技术领域

本发明属于植物组织和细胞培养技术领域，与园林植物快速繁殖有关，具体地说涉及以地锦叶柄、茎段为外植体，通过体细胞发生途径再生地锦植株的方法以及用于该方法的培养基。

                                背景技术

地锦(Parthenocissus tricuspidata Planch)，又称爬墙虎，属于葡萄科地锦属。该植物生长迅速、攀援力强、夏叶浓绿、秋叶紫红、适应性广且具有良好的固沙能力，是城市垂直绿化的优良材料，也是荒漠、石质山地、公路及铁路护坡防止水土流失的覆盖植被。

现有技术中，地锦体细胞发生途径植株再生方法通常是这样的，将幼胚或子叶叶片、叶柄接种在诱导培养基上诱导愈伤组织，对诱导出的愈伤组织进行继代培养，再将能稳定继代的愈伤组织转入分化培养中诱导体细胞胚发生。李正红等(2003)发表的研究简报中详细报道了利用地锦幼果中的幼胚再生出完整的地锦植株的方法，所采用的愈伤组织诱导和愈伤组织继代培养基均以改良的B5培养基为基本培养基，附加6-BA和2、4-D，但是在愈伤组织继代培养基中的2、4-D的用量较愈伤组织诱导培养基减少了一半；其分化培养基有三种，其成分为(1)以改良的B5培养基为基本培养基(不附加其他成分)，(2)以改良的B5培养基为基本培养基附加6-BA、NAA和水解乳蛋白；(3)以改良的B5培养基为基本培养基附加6-BA、NAA、水解乳蛋白和活性炭。据报道(尚无对比试验数据)通过该方法离体培养中从地锦幼胚愈伤组织诱导出的胚状体的分化率为13％-33％。(李正红等，地锦的组织培养及植株再生，植物生理学通讯，2003，39卷，5期，482-482)；李正红等(2005)对此组织培养方法进行了改良，该改良方法仍以地锦幼胚为外植体，以改良B5基本培养基+6-BA 2mg/L+2，4-D 2mg/L为愈伤组织诱导培养基，改良B5基本培养基+6-BA 2mg/L+2，4-D lmg/L为愈伤组织继代培养基，但体胚分化及萌发培养基改为改良B5基本培养基，通过该方法胚状体诱发率可以达到33％，成苗率53％。上述成果采用的外植体(幼胚)受季节限制，不能周年生产，从而影响地锦植物离体培养和植株再生对材料的需求。从另一个方面来说，从地锦幼果中剥取幼胚比较麻烦，工作量大。冯大领等(冯大领等，爬山虎体细胞胚的发生及组织学研究，北京林业大学学报，2004，26(4)：97-99)报道了以地锦子叶叶片和叶柄为外植体进行体细胞诱导时，体细胞胚发生率低0-16.7％，而且正常发育成完整植株的体细胞胚仅占3％。以上述离体条件下的地锦组织或细胞培养所产生的愈伤组织很难长期继代并保持分化能力，因而很难作为遗传转化的受体。同时现有技术报道地锦组织培养，繁殖效率低，难以实现工厂化生产。

                                发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种大量获得地锦组织培养试管苗的新方法，提高地锦外植体愈伤组织诱导、继代和分化效率，利用叶柄和茎段等不受季节影响，通过愈伤组织诱导、继代、分化进而大量再生地锦植株。同时本发明方法所获得的脆性胚性愈伤组织能够长期继代并保持其分化能力，可作为地锦植物遗传转化的材料。本发明的另一个目的是研制一种能够使地锦脆性胚性愈伤组织长期继代地并保持分化的培养基。

本发明是这样实现的：

一种将地锦植物再生为完整植株的方法，它包括下列步骤：

a)在含有诱导剂的培养基上培养地锦外植体，该外植体为地锦的叶柄，从该外植体中诱导出愈伤组织；

b)挑选步骤a)得到的发育状态良好的愈伤组织接种到增殖培养基上使其增殖；

c)挑选步骤b)得到的发育状态良好的愈伤组织接种到体胚诱导培养基上诱导体胚分化；

d)将步骤c)中的未成熟体胚接种到体胚增殖培养基上增殖并促进其进一步分化，得到成熟体胚；

e)将步骤d)得到的成熟体胚接种到体胚成苗培养基上使其再生出完整植株。

在本发明中，其中上述步骤c)的方法包括将其中的黄色脆性胚性愈伤组织接种到胚性愈伤组织继代培养基上，使其长期继代并保持分化能力。

本发明中，所述诱导剂选自萘乙酸、吲哚乙酸，2，4-二氯苯氧乙酸或其组合。

所述诱导剂是2，4-二氯苯氧乙酸，其浓度为1.0mg/L。

上述体胚诱导所采用的植物激素是6-苄基腺嘌呤1.5mg/L、萘乙酸0.05mg/L。

在本发明中，上述体胚成苗采用的是成熟胚，将该成熟胚中的正常体胚一次性诱导成苗，将其中的畸形体胚先诱导芽，再诱导生根。

一种用于将地锦胚性愈伤组织长期继代并保持分化的培养基，该培养基含有MS基本培养基，附加6-苄基腺嘌呤、萘乙酸、水解乳蛋白。

在本发明中，所述的6-苄基腺嘌呤为0.1mg/L，萘乙酸为0.3mg/L，水解乳蛋白为500mg/L。

为了便于对本发明的理解，申请人对上述各个步骤中所用的培养基、培养基中所用到的诱导剂、植物激素和其他附加成分做了如下定义；培养基包括：愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基、体胚诱导培养基、体胚增殖培养基及体胚成苗和生根培养基。包含大量成分即无机盐的培养基称为基本培养基。本发明所使用基本培养基来源如下：MS基本培养基(参见Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant，1962，15：473-497)；B5基本培养基(参见：Gamborg，O.L.，Miller，R.A.，and Ojima，K.Exp.Cell Res，1968，50：151-158)。

在本发明中，所述的诱导剂和植物激素定义及简称如下：诱导剂(又称生长素)包括萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IBA)，2，4-二氯苯氧乙酸(2、4-D)、植物激素中的细胞分裂素包括6-苄基腺嘌呤(6-BA)，其他附加成分是水解乳蛋白(CH)和活性碳(AC)。

本发明通过间接的体胚发生途径获得地锦再生植株，从愈伤组织的增殖到体胚诱导，每次都要对愈伤组织进行精心挑选，必须选择色泽新鲜，质地紧密的愈伤进行。

本发明的方法适用于所有基因型的地锦植株再生，虽然在本申请中申请人仅以六种基因型的地锦植物的叶柄为例进行实施，但本领域的技术人员在理解了本申请的实质性内容后很容易对本发明的方法作各种改进，并实施于其他基因型的地锦植物。

本发明可从叶柄高频诱导愈伤组织，愈伤组织继代后可诱导体胚发生，并能保持体胚不断增殖和成苗的特性。此外，在诱导的体胚发生过程中能产生脆性的胚性愈伤组织，并可将其长期继代保存并保持分化能力。这些脆性胚性愈伤组织为农杆菌介导的地锦的遗传转化提供了良好的受体；同时，该再生体系也是地锦遗传转化的理想受体并为制备转基因地锦新品种的人工种子奠定了一定的技术基础。

本发明的积极效果是：

(1)本发明所采用的外植体来源不受季节限制，可以周年进行地锦植物的组织和细胞培养。

(2)离体培养下的地锦体胚可通过次生胚不断增殖；具有良好的增殖效果。

(3)离体培养下的地锦胚性愈伤组织可以长期继代保存并能保持其进一步分化为小植株的能力。

(4)与现有技术相比，本发明的方法在愈伤组织诱导率和体胚分化率显著提高。

                                附图说明

图1是本发明的一个实施例从地锦叶柄中诱导出的愈伤组织

图2是本发明的一个实施例体胚发生过程中产生的脆性愈伤组织

图3是本发明的一个实施例不同发育阶段的胚状体

图4是本发明的一个实施例从愈伤组织表面产生的体胚

图5是本发明的一个实施例常体胚

图6是本发明的一个实施例畸形体胚

图7是本发明的一个实施例体胚的快速增殖

图8是本发明的一个实施例由正常体胚诱导分化的植株

图9是本发明的一个实施例由正畸形胚诱导分化的植株

图10是本发明的一个实施例移栽成活20天的地锦植株(田间状态)

                              具体实施方式

实施例1：

试验材料选择、培养基设计与接种培养

1、试验材料来源及其处理：

本发明的试验材料选自地锦带芽茎段，采自湖北省武汉市华中农业大学花卉试验基地，每株地锦为一种基因型，为了比较不同基因型地锦植株在离体培养下的分化率差异，申请人将采集到的六株地锦植物，分别编号为PTC、PT1，PT2，PT3，PT4，PT5。田间采集的地锦茎段按常规方法消毒(参见：李明浚编译，植物组织培养，中国农业出版社，1992年版)，将消毒后的地锦茎段接种在MS基本培养基+6-BA1.0mg/L的培养基上诱导腋芽萌发而获得无菌苗，地锦无菌苗获得后将其接种在MS基本培养基+6-BA1.5mg/L+IAA0.01mg/L的培养基上增殖培养，取上述经40天离体培养的六种基因型地锦无菌苗的叶柄作为本发明的外植体。

2、培养基设计：

表1，列出了本发明的各种培养的成分及其用量。

            表1  地锦茎段的离体培养基设计

说明：MS基本培养基和B5基本培养基的配制参见：李明浚编译，植物组织培养，中国农业出版社，1992年版

表1中的胚性愈伤组织继代培养基，既作为一般继代培养基，也是本发明所指的愈伤组织长期继代培养基。

培养基种各组分的代号如下：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)、α-萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、水解乳蛋白(CH)、活性碳(AC)均可以从商业上购买。

3、培养条件

培养室培养温度24±2℃，光照强度1000-1500lx，每天光照14h；暗培养条件：温度24±2℃的暗培养箱中，24h；弱光培养：温度24±2℃，每天弱光照14h，光照强度100-500lx。

4、接种与培养：

在超净工作台或无菌接种箱条件下将地锦试管苗的叶柄切成1-1.5cm长的小段，接种于愈伤组织诱导培养基(培养基如表1所示)上，每一培养皿中接种10-12个叶柄，25℃暗培养。暗培养约1周后，可见叶柄切口处开始有少量白色愈伤产生，一个月后大多数外植体长出白色半透明，有光泽且紧实的愈伤组织，同时有少量的不定根产生(如图1所示)，有的外植体则变褐死亡，未能诱导出愈伤组织。

将愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基(见表1所示)上，在暗培养条件下经过2个月培养后，选取大小一致，色泽新鲜，白色半透明或淡黄色，质地紧密，表面具不同皱褶或呈颗粒状的愈伤转移到体胚诱导培养基(见表1所示)上。每一培养皿约培养10-12块愈伤组织，2周后，少量愈伤组织转变成脆性胚性愈伤组织(见图2)，部分愈伤组织表面出现不同状态的体胚(见图3)，这些体胚可在体胚诱导培养基上快速成熟并萌发(见图4)。在体胚诱导中，还发现了一些畸形胚，如子叶联合或单子叶(见图6)或无子叶体胚和缺乏顶端生长组织和胚轴的体胚等。如果愈伤组织状态不好，则很难诱导体胚的发生。将胚性愈伤组织接种到胚性愈伤继代培养(见表1所示)上，可长期保存，在体胚诱导培养基上可不断分化。

体胚增殖一般选未萌发或刚萌发的幼胚进行增殖，同时要将所增殖的二次胚隔离，否则增殖的体胚发育成熟就会转换成苗。所增殖的二次胚主要发生在初代胚的根轴基部或子叶上，它们也可像初代体胚一样不断通过二次体胚增殖或成苗(见图7)。

30天后将正常的体胚接种到MS培养基(见表1所示)上进行体胚成苗诱导，正常的体胚由于具有根芽双极性结构(见图5)可在MS培养基上直接成苗，同时基部有5-6个次生胚发生(见图8所示)。

畸形胚需先转移到畸形胚成苗培养基(见表1)上进行芽的诱导，畸形胚在添加了少量激素的培养基(见表1)上可形成无根的小苗，基部也有次生胚的发生(见图9)。当小苗长到2-3cm高时，将无根苗转到生根培养基(见表1的配方)进行根的诱导。

2个月后，将根系发育良好的再生植株移到有散射光的自然条件下，炼苗一周，取出生根小植株，洗净根部琼脂并剪去部分叶片，然后移栽到装有腐殖土∶珍珠岩∶河沙(体积比2∶1∶1)的盆中(最好在4、5月份移栽)，弱光下放3-4天，使其长出新根，再在强光下生长，使其健康生长(见图10)。

实施例2

不同浓度的2，4-D对地锦叶柄愈伤组织诱导的影响

在植物组织培养中，2，4-D是一种应用得比较广泛的生长素类生长调节剂，它被公认是一种最有效的启动细胞脱分化，形成愈伤组织或器官发生的生长素。

地锦叶柄培养约1周后可见膨大的切口处有少量白色愈伤组织产生，1个月左右，可观察到两种类型的愈伤组织，一种是白色半透明，较紧实，表面有光泽且有少量的不定根(见图1A)，这种愈伤组织在随后的继代中大多可以产生体胚。另一种是白色、松散生长旺盛或水渍状或褐化，这种愈伤组织的状态很难调整，在分化中未能产生体胚。在本发明方法中，供试的六种基因型的叶柄均能在的四种不同浓度的2，4-D的培养基上产生愈伤组织，且在同一浓度的2，4-D培养基上愈伤组织的诱导率大致相似，表2仅列出了基因型PTC地锦的叶柄在不同浓度的2，4-D培养基上的愈伤组织诱导率。从表2可看出，四种浓度的2，4-D均能诱导愈伤组织，但以1.0mg/L2，4-D的愈伤组织诱导率最高且愈伤组织的状态最好。浓度超过1.0mg/L时，愈伤组织诱导率下降且含水量增加，不利于后期的增殖和体胚诱导。因此，1.0mg/L2，4-D是愈伤组织诱导的最佳激素浓度。

        表2不同浓度的2，4-D对地锦叶柄愈伤组织诱导的影响(基因型编号为PTC)

注：实验采用B5基本培养(参见：李明浚编译，植物组织培养，中国农业出版社，1992年版)，另添加CH500mg/L和AC 0.02％，蔗糖、琼脂、水和pH如表1所示。

实施例3

不同浓度的BA与NAA对地锦叶柄愈伤组织体胚诱导的影响

植物激素对体胚分化和成苗具有重要意义，通过改变外加生长素的水平或者生长素/细胞分裂素的比例，能刺激体细胞形成胚胎。为探讨BA和NAA对体胚诱导的影响，将来源于基因型编号为PTC的愈伤组织(继代增殖2次后)接种到不同的体胚诱导培养基上(参见表3)。

不同浓度的6-BA和NAA及其交互作用对体胚诱导的影响显著。LSD分析表明，BA1.5mg/L与BA1.0mg/L、BA2.0mg/L间存在显著差异，BA1.0mg/L与BA2.0mg/L间却没有显著差异。当NAA浓度在一定范围内(0.01-0.05mg/L)，随BA浓度的升高，体胚分化率升高，在BA1.5mg/L时达最高值，说明BA浓度过高，愈伤组织分裂旺盛，反而使体胚的发育受阻。当NAA浓度处于0.05-0.1mg/L，随BA浓度的升高，体胚分化率升高，在BA2.0mg/L时达最高值，高达16.1％。LSD分析显示：NAA浓度在0.05mg/L水平时，体胚分化率最高，NAA浓度过高，抑制体胚的分化。合理的BA/NAA比率可提高体胚的分化率，过低或过高比率对体胚分化不利，比率过高会导致愈伤组织旺盛生长，过低，体胚分化受到抑制，且体胚生根较多。

表3不同浓度6-BA与NAA对地锦叶柄愈伤组织体胚诱导的影响(基因型编号为PTC)

注：实验采用MS基本培养基((参见：李明浚编译，植物组织培养，中国农业出版社，1992年版))，另添加CH 500mg/L，蔗糖、琼脂、水和pH如表1所示。

实施例4

不同基因型的地锦叶柄愈伤体胚分化能力差异

地锦基因型是影响其体胚发生的一个最重要的因素，为比较其它五种不同地锦基因型的愈伤组织的体胚分化的能力差异，将上述五种基因型的愈伤组织接种到MS+1.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+500mg/LCH培养基上进行体胚诱导。从表4可看出，虽然各种基因型的叶柄愈伤组织诱导率差异不大，但其体胚的发生能力却有很大不同，体胚的诱导率从2.5％(PT5)到14.2％(PT3)变化不等。

   表4不同基因型的地锦叶柄愈伤体胚分化能力差异

注：实验所用培养基MS基本培养基+6-6-BA1.5mg/L+NAA0.05mg/L，另添加CH 500mg/L，蔗糖、琼脂、水和pH如表1所示。

所有上述参考文献以及参考文献中所引用的文献均纳入本文作参考。本领域技术人员显然能根据本发明的内容在不脱离本发明的精神和范围内对上述方法作各种变动和改动，因此这些变化和改动也被认为包括在本发明所附权利要求的保护范围之内。