环磷腺苷葡胺大输液制剂中环磷腺苷葡胺含量测定方法

技术领域

本发明涉及一种环磷腺苷葡胺大输液制剂及该大输液制剂中环磷腺苷葡胺含量测定方法。

背景技术

环磷腺苷葡胺(化学名，环磷腺苷葡甲胺；英文名，Meglumine AdenosineCyclophosphate；简称MCA；曾用名，心先安和美乐心)注射液，为一种非强心苷类的强心药物，主要用于治疗心力衰竭、心肌炎、病窦综合征、冠心病、心肌病，以及心律失常的辅助治疗。近年来因其疗效确切，作用独到，安全性能好，在临床上被广泛应用。

目前临床上应用的环磷腺苷葡胺注射液为小水针，规格2ml:30mg；常用量60～180mg/日。因主药作用强烈，且渗透压过低，不能直接用来静脉滴注，需要用5％葡萄糖或生理盐水注射液稀释后，方可静脉注射，不仅给临床使用带来不便，也可能造成药液感染和污染。

根据历年收集的资料及中文生物医学期刊数据库(CMCC)检索到的文献(1984～2002年6月30日)共224篇。其中有关该品临床应文献统计表明，98％以上均采用以5％葡萄糖稀释后静脉滴注。而制备MCA葡萄糖大输液的技术瓶颈在于：(1)葡萄糖溶液的稳定pH在3.2～5.5。pH在5.5以上极不稳定，易造成颜色、5-羟甲基糠醛及澄明度不合格；而环磷腺苷葡胺MCA水针稳定的pH范围在5.5～7.0。pH小于5.5易分解形成一磷酸腺苷及腺苷，因此两者的稳定所需的pH范围不同，将两者简单的混合不能得到稳定的具有一定保质期的MCA葡萄糖大输液产品。(2)注射用葡萄糖本身就含有某些紫外吸收杂质，并且其溶液存储中产生新的紫外吸收杂质和酸性物质。而现行的MCA水针环磷腺苷葡胺含量的法定测定方法无法将这些紫外杂质与环磷腺苷特征紫外吸收分离开来，这样用现行方法无法准确测定MCA葡萄糖大输液中环磷腺苷葡胺含量，使药品的质量在生产中无法得到有效的保证和控制，需要一种新的适于MCA葡萄糖大输液生产相适应的准确测定MCA葡萄糖大输液中环磷腺苷葡胺含量，控制产品生产质量的有效检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是要提供一种环磷腺苷葡胺大输液制剂及该大输液制剂中环磷腺苷葡胺含量测定方法，能直接用于静脉滴注的环磷腺苷葡胺的等渗大输液制剂，在临床上使用本品时毋需稀释配兑，避免了由小针抽取药液注入葡萄糖或氯化钠大输液的中间环节，以及药液转移过程中的交叉感染和污染，使用药更为方便、安全。尤其在抢救危重病人、争分夺秒时，更显示本品使用的方便、安全之优点。本制剂可根据用量要求，制成多种规格，供医护人员酌情选用。

解决本发明技术问题是通过以下技术方案来实现的。

本发明(1)采用合适的配方和生产工艺；(2)经考察，影响制剂稳定性的关键因素是其保存期的pH值，本发明确定了使制剂稳定的pH范围及其最佳稳定pH值，为生产长期稳定的制剂，提供了可靠的依据；(3)主药环磷腺苷葡胺含量的现行测定方法是根据环磷腺苷的特征紫外吸收。经试验，本发明分离了干扰环磷腺苷测定的一切杂质，从而建立了适于环磷腺苷葡胺-葡萄糖注射液的含量测定方法。方法的回收率为100.44±1.166，RSD1.16％。以下分别介绍：

1.环磷腺苷葡胺大输液制剂配方和生产方法

本发明环磷腺苷葡胺等渗输液大输液制剂分为：环磷腺苷葡胺葡萄糖注射液制剂和环磷腺苷葡胺氯化钠注射液制剂。

a.配方：

环磷腺苷葡胺葡萄糖注射液制剂，其特点是每100毫升制剂中含等渗介质葡萄糖4.5-5.5克，环磷腺苷葡胺54-66毫克，加柠檬酸42毫克(或不加)，其余为注射用水。其制剂稳定的pH范围为3.5～5.5，最佳稳定pH值为4.75±0.25。本发明产品性能相当稳定，通过室温存放稳定性考察，存放一年各项指标合格，预计有效期至少两年。

环磷腺苷葡胺氯化钠注射液制剂，其特点是每100毫升制剂中含等渗介质氯化钠0.85-0.95克，环磷腺苷葡胺54-66毫克，其余为注射用水。其制剂稳定的pH范围为5.5～7.0，其最佳稳定pH值为6.1±0.2。本发明产品性能相当稳定，通过室温存放稳定性考察，存放一年各项指标合格，预计有效期至少两年。

b.生产环磷腺苷葡胺大输液制剂的方法：取注射用水适量，加热煮沸，不断搅拌，分次加入葡萄糖，配成50~70％浓溶液(或分次加入氯化钠，配成20~25％的浓液)。用1％盐酸或1％氢氧化钠溶液调pH3.8~4.0，加入适量的0.1~1.0％的注射用活性炭。在搅拌下煮沸30分钟，放冷至45℃~50℃滤除活性炭，按大输液制剂全量加入环磷腺苷葡胺，用1％氢氧化钠溶液调整pH6.0～6.5(或加入1mol/L的柠檬酸溶液0.1～0.3ml，再用1％氢氧化钠调pH至5.0)。再加注射用水至所需量。精滤至澄清，灌封，于115℃热压灭菌30分钟。

实验考察了灭菌工序对环磷腺苷葡胺葡萄糖注射液的质量(pH值、颜色、澄清度、5-羟甲基糠醛和主药含量)的影响，结果见表1。

由表1.可见，选择调整pH的试剂不同，差别明显。用1％NaOH或HCl，无缓冲能力，平均降低pH1.25单位，碳酸氢钠降低1.50～1.70单位，随着pH下降，CO₂释放增加，加温灭菌冲塞率达20％，故不采用。而添加柠檬酸最佳，其浓度为1mmol/L，pH基本稳定，加至3mmol/L可使pH稳定。本试验还揭示一个重要特征，即本大输液中主药环磷腺苷葡胺，比其等渗介质葡萄糖，更为稳定。

实施例1  环磷腺苷葡胺葡萄糖注射液

配方   环磷腺苷葡胺      60mg

       葡萄糖            5g

       注射用水加至      100ml

按处方将葡萄糖投入注射用水中，使成50~60％的浓液，按上述工艺搅拌、煮沸，加入浓溶液0.3％(克/100毫升)的活性炭，经煮沸，脱炭后加入主药60mg，加入注射用水至全量的80％，用1％氢氧化钠调整pH至6.2，再加注射用水至全量，精滤至澄清，灌封于50ml或100ml等法定容器中，封口，115℃，热压灭菌30分钟。最后，按后面所述的环磷腺苷葡胺葡萄糖注射液中环磷腺苷葡胺的定量测定方法检测注射液中环磷腺苷葡胺的含量，含量合格即可出厂。

实施例2  环磷腺苷葡胺葡萄糖注射液

配方    环磷腺苷葡胺          60mg

        葡萄糖                5g

        柠檬酸1mol/L溶液      0.2ml

        1％氢氧化钠(或盐酸)   适量(用于调整pH)

        注射用水加至          100ml

按处方将葡萄糖投入注射用水中，使成50~60％的浓液。按工艺搅拌、煮沸，加入0.3克/100毫升活性炭，经煮沸，脱炭后加入主药60mg、柠檬酸1mol/L溶液0.2ml，用1％氢氧化钠调整pH至5.0，再加注射用水至全量，精滤至澄清，灌封于50ml或100ml等法定容器中，封口，115℃，热压灭菌30分钟。最后，按后面所述的环磷腺苷葡胺葡萄糖注射液中环磷腺苷葡胺的定量测定方法检测注射液中环磷腺苷葡胺的含量，含量合格即可出厂。

实施例3  环磷腺苷葡胺氯化钠注射液(适于不宜使用葡萄糖的合并糖尿病患者使用)

配方  环磷腺苷葡胺      60mg

      氯化钠            0.9g

      注射用水加至      100ml

按处方将氯化钠投入注射用水中，制成20~25％的浓溶液，按工艺，搅拌、煮沸，加入浓浓液0.3％的活性炭，经煮沸脱炭后加主药60mg，再加入注射用水至全量的80％，用1％氢氧化钠(或盐酸)，调整pH至6.1，加注射用水至全量，精滤至澄清，灌封于50ml或100ml等法定容器中，封口，115℃，热压灭菌30分钟。

2.大输液中等渗介质对主药稳定性的影响

A.等渗介质0.90％氯化钠溶液对环磷腺苷葡胺稳定性的影响

为了考察0.9％NaCl对主药MCA稳定性的影响，实验按实施例3的配方和工艺制成不同pH的大输液各10瓶，每瓶150ml。调pH的溶液为1％HCl和1％NaOH，热压灭菌后大输液的pH值分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5六档。观测指标为MCA含量及纸色谱显示的分解产物。MCA含量测定的方法：将后面所述的大输液精密量取125ml，60℃减压灭菌浓缩至约3ml，转移至10ml量瓶中，并用少量注射用水洗蒸馏瓶3次，最后加水至刻度。准确取样10μl，按后面所述的MCA的纸谱定量测定的方法测定MCA含量。测定前先检查纸谱上的紫外荧光斑点位置，并确定其分解产物。每个样品做三个测定，小于0.5％的含量变化属测定误差。所得数据列于表2。

分析表2中数据可见，0.90％NaCl对MCA的稳定性几乎无影响，与水溶液即以前我们在小水针中观察到的结果基本一致。MCA的等当点为pH6.20。MCA在酸性条件下易于解离成cAMP(Rf 0.45～0.50)，cAMP进而水解成AMP(一磷腺苷，Rf0.18～0.20)，AMP即分解成腺苷(Rf 0.60～0.66)。在碱性条件下，MCA也易于游离成cAMP，进而水解成AMP，不易形成AR。故MCA在0.90％NaCl溶液中的稳定pH范围在5.5～7.0，与小水针完全一致。由此证明，0.9％的NaCl是一种隋性等渗介质，对大输液中的MCA既无保护作用，也不起破坏作用。又根据我们长期考察，MCA小水针42批(1993-2001年)，发现室温保存五年，未见水针的MCA分解，即MCA含量无可测变化，亦不见有AMP和AR的紫外斑点(可检出0.5μg的MCA)，其pH值均在5.9～6.3之间，故MCA水针的最佳稳定pH值为6.1±0.2，室温存放五年期间，小水针的pH值仅下降0.1单位，故水针的溶液极为稳定。同理，MCA氯化钠大输液的最佳稳定pH值应为6.1±0.2，在最佳pH值范围内，预计MCA氯化钠大输液有效期可长达五年。

B.等渗介质5％葡萄糖对环磷腺苷葡胺稳定性的影响

为了考察5％葡萄糖对主药MCA稳定性的影响，实验按实施例1的配方和工艺制成不同pH组的大输液各15瓶，每瓶150ml。灭菌后的pH值分别为6.0、5.5、5.0、4.5、4.0和3.5，各种pH制剂各3瓶作对照，其余均放入80℃恒温箱中保温于第3、6、8、10、18天不同pH组各取二瓶，依后面所述的环磷腺苷葡胺葡萄糖注射液中环磷腺苷葡胺含量测定方法，作环磷腺苷葡胺含量测定，测定前先检查纸谱上的荧光斑点位置以确定其分解产物，所得结果列入表3。

本试验表明，(1)在研究的pH范围(pH6～3.5)环磷腺苷葡胺(MCA)在5％葡萄糖溶液中的化学稳定性能良好：80℃pH6.0时8天纸层析图谱未见分解，即无AMP(一磷酸腺苷斑点)，只有到10天才看到明显的AMP紫外斑点，MCA分解约20％；pH5.5，4.0时MCA在80℃18天才观察到明显分解，分别分解16.7％和5.8％；(2)MCA水溶液的最佳稳定pH为6.1±0.2，已如前述。本实验发现，5％葡萄糖溶液使MCA最佳稳定pH值下降，最稳定范围是pH4.5～5.0，即pH4.75±0.25。葡萄糖使MCA最佳稳定pH值下移，具有重要实际意义，使制备MCA葡萄糖大输液的技术瓶颈得以突破，即MCA和葡萄糖二者均较为稳定的pH范围是3.5~5.5。

3.环磷腺苷葡胺葡萄糖注射液中环磷腺苷葡胺的定量测定方法

(1)方法特征

鉴于本品含有5％葡萄糖，而MCA60mg，只占葡萄糖总量的1.2％(百分之一点二)，其分子麾尔比为251∶1，如此悬殊的化学量差，使MCA稳定pH值下移，产生了有益的效果，已如前述。但对其含量测定则极其不利。又根据两家公司生产的市售5％葡萄糖大输液中的紫外吸收扫描发现同样含有284nm、228nm和217nm三个特征吸收峰，而这些紫外吸收杂质和葡萄糖又不能用现行分离方法拆分开来，这就成为研制此大输液首先要解决的技术瓶颈。我们通过实验建立了适于本大输液中环磷腺苷葡胺含量测定的方法，其特征包括以下要点：

a.利用碱性pH(8.0～9.0)，使环磷腺苷葡胺解离成环磷腺苷(带负电荷)和葡甲胺(不带电荷)。

b.用强碱性阴离子交换树脂吸附环磷腺苷及可能分解形成的一磷腺苷。

c.上柱流出液和水洗流出液，可除去注射液中的葡萄糖、葡甲胺及其他一切紫外吸收杂质。

d.再用纸色谱法在95％乙醇-4％乙酸铵(5∶2)展开剂中分离环磷腺苷及一磷腺苷，并用环磷腺苷的特征紫外吸收测定其含量，据此计算出环磷腺苷葡胺的含量。

(2)具体操作步骤

精密量取本品125ml，用1mole/L氢氧化钠溶液调节pH至8-9，上已处理好的强碱性阴离子交换树脂(Dowex 1(美国)或国产717等)，100-200目，Cl型柱(柱径约12mm，树脂床4ml)，上柱流速3～4ml/min，样品流至柱面时，改用蒸馏水80ml洗柱，流速同前，弃去流出液，然后用0.075mole/L盐酸溶液-0.2mole/L氯化钠溶液洗脱，流速0.7ml/min。收集洗脱液约80ml，用碳酸氢铵颗粒调节pH值至6.5。然后在60℃以下减压浓缩至约3ml，转移至10ml量瓶中，用注射用水洗涤蒸馏瓶数次，一并加入量瓶中，并加注射用水稀释至刻度，作为供试品溶液。另取环磷腺苷对照品适量，加60℃的水制成每1ml中含10mg的溶液，作为对照品溶液，照纸色谱法(中国药典2000年版二部附录V A)试验，分别精密吸取上述溶液10μl，点于长约30cm的层析滤纸上，以95％乙醇-4％乙酸铵(5∶2)为展开剂，展开约15小时后，干燥，置紫外光灯(254nm)下检视，在对照品的斑点位置相同处，划出供试品紫色斑点。将此斑点剪下，并剪成细条状，放入试管中，精密加0.01mole/L盐酸溶液5ml，振摇，放置1小时后，取上清液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)，在257nm的波长处测定吸收度。同时，以5％葡萄糖溶液代替供试品溶液，同法操作，作为空白校正，按环磷酸腺苷的吸收系数为447乘以0.6278(0.6278为环磷腺苷与环磷酸腺苷葡甲胺的分子量比值)计算，即得环磷腺苷葡胺含量。

(3)方法的回收率试验

依实施例1，将葡萄糖浓配、加针用炭、煮沸搅拌、冷却后，脱炭，加注射用水稀释至全量的80％，再加入MCA结晶粉制成的15mg/ml的溶液(用国家药品标准规定的方法标定)。按全量加入540mg MCA/L，用1％的盐酸或1％氢氧化钠调整pH至6.1。再按全量加水至90％。取出180ml，加水至200ml(1号样)，分别再取出此液三份，每份各180ml，分别加入MCA 12mg，24mg，36mg，最后分别加水至200ml(相应为2号样、3号样、4号样)，分别通过0.22μ微孔滤膜，热压灭菌115℃30分钟，取样100ml作MCA含量测定，其余作其它检查及测定用。详细数据收于表4。回收试验，共二批(分甲、乙二组)，共计8次测定。总的回收率为100.44±1.166，在纸层析测定误差范围内。并且，线性关系良好，线性方程：Y(MCA mg％)＝a+b*△A₂₅₇，式中：甲组：a＝-0.0658，b＝142.546；乙组：a＝0.00236，b＝142.483。甲乙二组b的均值142.516，两组均值与计算值142.538前四位数相同。相关系数为0.99999。表4所列计算式的计算常数(142.538)与线性方程实测的142.516，前四位数相同，为分光光度法本身所能达到的最佳水平。

4.本发明产品的性能指标：见表5。

本发明确定了环磷腺苷葡胺大输液制剂稳定的关键条件及其制备方法、并解决了环磷腺苷葡胺含量测定方法，有利于对环磷腺苷葡胺大输液制剂生产质量的控制，从而制定合适的生产工艺，使环磷腺苷葡胺大输液制剂得以工业化大批量生产成为可能。使用本制剂，可避免从小针抽取药液注入葡萄糖或氯化钠大输液的中间环节，杜绝了用药过程中的交叉感染和污染，使用药更为安全、方便。本发明可制成多种规格，一般可制成为50ml、100ml、250ml、500ml等规格的大制剂，供医护人员酌情选用。

表1.灭菌工序对环磷腺苷葡胺葡萄糖注射液的质量影响

大输液按本剂型的配方和工艺，于115℃热压灭菌30分钟，放冷至约50～60℃用自来水降至室温，测定各质量指标，观察指标有pH值、颜色、澄清度、A₂₈₄为5-羟甲基糠醛检查和主药含量。调pH用溶液均属生理物质，按表中所示浓度配制。每种制剂作三个平行检测。

表2.环磷腺苷葡胺氯化钠大输液的高温稳定性考查

^*cAMP为环磷腺苷，AMP为一磷腺，AR为腺苷

表3.葡萄糖溶液pH对环磷腺苷葡胺稳定性的影响

制作方法按实施例1，溶液置80℃恒温箱中保温，于0、3、5、8、10、18天取样，取样作MCA含量测定。含量无明显变化者(＜3％)未列出。

表4.MCA葡萄糖注射液的MCA回收试验

依上法，分别作纸谱法测定二次，定为甲乙二组，每组平行测定样品三个

*

0.6278＝cAMP分子量/MCA分子量

*统计学处理：甲乙二组合并后，MCA的回收率均值＝100.44；RSD＝1.166％；

甲组回收率均值＝100.67；RSD＝1.356％；乙组回收率均值＝100.23；RSD＝1.098％

表5