包括小分子热休克蛋白(sHSPs)用于防止蛋白质降解的组合物以及利用sHSPs的二维凝胶电泳方法

技术领域

本发明涉及一种用于防止蛋白质降解的组合物，其中含有小分子热休克蛋白(sHSPs)，以及一种用于二维凝胶电泳的组合物。此外，本发明还涉及一种改进的二维凝胶电泳方法，其特征在于使用了sHSPs。

背景技术

随着人类基因组碱基序列的揭示以及大量微生物、低等动植物基因组信息的日益增加，蛋白质组学变成了下一代研究的焦点。

蛋白质组学是一个系统研究蛋白质组的科学领域，其与基因组学有所不同。蛋白质组学表示的是基因组在特定条件下所表达蛋白质的种类和数量的完整信息。因而，蛋白质组学同时分析和鉴定了生物学现象中所涉及细胞或组织中的各种蛋白质。由于这种蛋白质组分析提供了在基因组计划或DNA研究中所不能发现的结果，因此人们进行研究以利用这种分析开发出用于成人疾病的诊断试剂和治疗试剂，这些疾病例如，癌症、糖尿病、痴呆、和心脏和循环系统疾病，以及精神疾病，也进行了研究以将其应用于诸如器官移植之类的领域。

蛋白质组学研究中最普遍使用的核心技术是二维凝胶电泳技术。二维凝胶电泳技术是能够分离和定量细胞或组织中总蛋白质的最佳方法。

二维凝胶电泳技术是这样一种方法，首先根据各种蛋白质的等电点(pI)将蛋白质混合物分离，再根据其分子量将各分离的样品在垂直方向上进一步地分离，使得分离的蛋白质在平面上呈二维分布。也就是说，分别使用了等电聚焦法(IEF)和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)。

近来，开发出了利用IEF的二维凝胶，并且商业化的系统一个接一个地出现，大大提高了再现性，这曾是先前二维凝胶技术(US6,554,991；US2002/157954；US2002/133300；US6,416,644；US6,398,932；WO02/25259；US2001/032786；US2001/023826；US2001/015320；US6,245,206；US6,136,173；US6,123,821；US5,993,627；WO98/59092；和WO02/90996)中的一个难题。而且，二维凝胶中染色蛋白质和用蛋白酶切割蛋白质的步骤是利用自动化系统和计算机来执行的，这样就可以以方便而简单的方式处理样品。

然而，还没有实现第一个步骤，即二维凝胶电泳的自动化。而且，由于在整个二维凝胶电泳过程中有蛋白质的损失，所以不可能完全分析出细胞或组织中的复杂蛋白质组。如果第一步中裂解了细胞，则随着蛋白酶从细胞中释放，会出现蛋白质的降解从而减少了蛋白质的总数量。

因此，设计了以下的多种方法来抑制蛋白质分离过程中的蛋白酶攻击：(1)向样品中直接添加强变性剂；(2)在低温或碱性条件下(pH9以上)制备样品；以及(3)使用蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的实例包括苯甲基磺酰氟(PMSF)、氨乙基苯磺酰氟或Pefabloc^TM SC(AEBSF)、乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲脒、甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基化酮(TLCK)、以及甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮(TPCK)。然而，在这些方法中，不能够完全抑制蛋白质水解，并且样品的种类和来源十分不同，使得要根据经验来确定制备样品的最佳过程。

同时，通过压力，如热激或过量产生某些蛋白质可引发sHSPs，即具有15-30kDa低分子量的热休克蛋白(HSPs)，并起到防止蛋白质降解的作用。一种或多种sHSPs存在于各种从真核细胞到原核细胞的所有微生物中，到现在为止已知的sHSPs在下表1中给出：

表1.已知的sHSPs

这些sHSPs在进化过程中具有保守的区域，因而执行基本上类似的功能。然而，还不知道这些sHSPs能防止蛋白质的降解。

因此，本发明者们进行了深入的研究，从而开发出一种防止蛋白质在二维凝胶电泳中降解的方法，并因而首次发现了sHSPs具有防止蛋白质降解的功效，而且如果利用这种sHSPs来进行二维凝胶电泳的话，可获得具有大大增加数目的蛋白质斑点的凝胶，从而实现本发明。

发明公开内容

因此，本发明的一个主要目的是提供一种防止蛋白质降解的组合物。

本发明的另一个目的是提供一种用在二维凝胶电泳中的组合物，通过它可以防止蛋白质降解并获得具有增多斑点的凝胶。

本发明还有一个目的是提供一种二维凝胶电泳的方法，其中可防止蛋白质降解并获得具有更多斑点的凝胶。

为达到上述目的，在一个实施例中，本发明提供了一种防止蛋白质降解的组合物，其中含有有效量的小分子热休克蛋白(sHSPs)。

在另一个实施例中，本发明提供了一种用在二维凝胶电泳中的组合物，其中含有有效量的sHSPs。

还有另一个实施例中，本发明提供了一种用于蛋白质混合物的二维凝胶电泳的方法，其包括步骤：向该蛋白质混合物中加入sHSPs，以防止蛋白质降解并获得具有更多斑点数目的凝胶；将含有sHSPs的所述蛋白质混合物进行二维凝胶电泳。

在另一个进一步的实施例中，本发明提供了一种通过二维凝胶电泳进行蛋白质组分析的方法，其特征在于使用了本发明的组合物。

在本发明中，sHSPs优选一种或多种选自表1中所列出的蛋白质，更优选一种或多种选自以下物质构成的组：包涵体相关蛋白A(IbpA)、IbpB、IbpAB和HSP26。

在本发明中，用在二维凝胶电泳方法中的蛋白质混合物优选是某些细胞中的总蛋白质。所述某些细胞优选是原核或真核细胞。原核细胞优选是E.coli或假单胞菌种的微生物，真核细胞优选来自于人类的细胞。

在本发明中，用以防止蛋白质降解所加入的sHSPs的量优选范围是，相对于100份重量的电泳样品总蛋白质来说，其占0.1到50份的重量，更优选在0.5到20份的重量。如果sHSPs以小于0.1份重量的量加入的话，则绝对不足以防止蛋白质降解，而如果其以大于20份重量的量加入的话，则过量的sHSPs要么会干扰一些被分离细胞的蛋白质分离，要么会对sHSPs的纯化成本造成不利的影响。

附图简要说明

图1是质粒pTac99IbpAH的基因图谱。

图2是质粒pTac99IbpBH的基因图谱。

图3是质粒pTac99_PPIbpAH的基因图谱。

图4是质粒pTac99HSP26H的基因图谱。

图5是表示由重组质粒pTac99IbpAH、pTac99IbpBH、pTac99_PPIbpAH或pTac99HSP26H转化的重组E.coli XL1-Blue所表达的蛋白质IbpA、IbpB、或HSP26的纯化结果。在(A)中，泳道M表示分子质量标准，泳道1和2表示纯化的IbpA，泳道3和4表示纯化的IbpB，泳道5和6表示纯化的_PPIbpA。在(B)中，泳道M表示分子质量标准，泳道1到3表示纯化的HSP26。

图6表示转化的E.coli WIB101的二维凝胶电泳图，其中IbpA和/或IbpB在体内过表达。(A)表示E.coli WIB101(p184ΔCm)，(B)表示E.coli WIB101(pACTacIbpA)，(C)表示E.coli WIB101(pACTacIbpB)以及(D)表示E.coliWIB101(pACTacIbpAB)。

图7表示纯化的IbpA和IbpB蛋白的二维凝胶电泳图。(A)和(B)分别表示IbpB和IbpA。

图8表示在体外加入IbpA、IbpB、或HSP26的E.coli W3110的二维凝胶电泳图。(A)表示作为对照的E.coli W3110，(B)是向E.coli W3110加入10μg IbpB蛋白的情况，(C)是向E.coli W3110加入10μg IbpA蛋白的情况，(D)是向E.coli W3110加入10μg来自假单胞菌的IbpA蛋白的情况，以及(E)是向E.coli W3110加入10μg来自酿酒酵母的HSP26蛋白的情况。

图9表示在体外加入IbpA的恶臭假单胞菌KT2440的二维凝胶电泳图。(A)表示作为对照的恶臭假单胞菌KT2440，以及(B)表示向恶臭假单胞菌KT2440加入10μg IbpA蛋白的情况。

图10表示在体外加入IbpA的人血清的二维凝胶电泳图。(A)表示作为对照的人血清，以及(B)表示向人血清加入10μg IbpA蛋白的情况。

发明详细说明

在下文中将通过实施例进一步详细地说明本发明。然而对于本领域技术人员来说显然本发明并不仅限于这些实施例。

特别地，这里的实施例意在说明来自E.coli的IbpA或IbpB，来自假单胞菌的IbpA，以及来自酿酒酵母的HSP26的sHSPs，然而其应当记住的是表1中的sHSPs都可以无限制地用于本发明。

实施例1：制备含有ibpA、ibpB或HSP26基因的重组质粒

根据Sambrook等人的方法(Molecular Cloning，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY，1989)分离并纯化E.coli W3110(ATCC 39936)、恶臭假单胞菌KT2440(ATCC 47054)和酿酒酵母的染色体DNA。

在500mL LB(Luria-Bertani)介质中分别培养E.coli W3110、恶臭假单胞菌KT2440和酿酒酵母24小时。离心收集早期对数期的菌株，然后悬浮于50ml含有10mg/ml溶菌酶(Sigma Co.USA)的TE溶液中(10mM Tris，1mMEDTA，pH7.6)。将该菌株悬浮液在室温下缓慢震荡培养24小时。

为了破碎菌株并去除蛋白质，向培养液中加入16ml 10％的SDS(十二烷基磺酸钠)溶液和570μl 20mg/ml的蛋白酶K(Sigma Co.USA)，然后在37℃下反应一小时。

接着，加入溶解于0.7M NaCl溶液中的14ml 5M的NaCl溶液和10.66ml10％的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，Sigma Co.USA)，然后在65℃下反应10分钟。之后，将与反应溶液相同体积的氯仿-异戊乙醇(24∶1)加入到反应溶液中，并在室温下小心混合2小时。将混合溶液在6000rpm下离心10分钟，将上清液转移到破碎仪中，向其中缓缓加入比上清液体积多两倍的冷却乙醇以沉淀染色体DNA。将沉淀的DNA缠绕在玻棒上。将该玻棒吹干以去除乙醇，并将染色体DNA溶解于1ml的TE溶液中。

向DNA溶液加入RNase(Sigma Co.USA)至终浓度50μg/ml，然后在37℃下反应一小时。反应之后，将与反应溶液相同体积的氯仿-异戊乙醇(24∶1)加入到反应溶液中，并在室温下小心混合2小时。

将混合溶液在6000rpm下离心10分钟，将上清液转移到破碎仪中，向其中缓缓加入比上清液体积多两倍的冷却乙醇以沉淀染色体DNA。将沉淀的DNA缠绕在玻棒上。将该玻棒吹干以去除乙醇，最后，将纯化的E.coli W3110、恶臭假单胞菌KT2440和酿酒酵母的染色体DNA分别溶解于1ml的TE溶液中。

为了简易表达和纯化IbpA、IbpB、或HSP26蛋白，重组质粒pTac99IbpAH、pTac99IbpBH、pTac99_PPIbpAH和pTac99HSP26H构建如下。

用E.coli W3110的染色体DNA作为模板，用SEQ ID NOs：1和2的引物和SEQ ID NOs：3和4的引物进行PCR，从而分别获得来自E.coli的ibpA-6his和ibpB-6his基因。

此外，用恶臭假单胞菌KT2440的染色体DNA作为模板，用SEQ ID NOs：5和6的引物进行PCR，从而获得来自假单胞菌的PPibpA-6his基因。在恶臭假单胞菌KT2440的基因组中，ibpB基因还未知。

用酿酒酵母的染色体DNA作为模板，用SEQ ID NOs：7和8的引物进行PCR，从而分别获得来自酿酒酵母的HSP26-6his基因。

所有的PCR以下列条件进行：在95℃下初始变性5分钟；95℃下变性50秒、55℃退火一分钟、和72℃下延伸一分30秒，循环30次；最后在72℃下延伸5分钟。

每个所获得的ibpA-6his、ibpB-6his、PPibpA-6his和HSP26-6his基因被插入到用EcoRI和HindIII切割的重组质粒pTac99A中，从而分别构建出质粒pTac99IbpAH、pTac99IbpBH、pTac99_PPIbpAH和pTac99HSP26H(图1、图2、图3&和图4)。

重组质粒pTac99A获得如下：将pTrc99A(Pharmacia Biotech.，Uppsala，Sweden)的trc启动子转化到pKK223-3(Pharmacia Biotech.，Uppsala，Sweden)的tac启动子中。用限制酶PvuII和EcoRI切割pKK223-3的tac启动子，然后将tac启动子的基因片段插入用相同限制酶切割的pTrc99A中。

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实施例2：IbpA、IbpB、或HSP26蛋白的纯化

将实施例1中制备的含有基因编码IbpA、IbpB、或HSP26的重组质粒pTac99IbpAH、pTac99IbpBH、pTac99_PPIbpAH或pTac99HSP26H转化的重组E.coli XL1-Blue(Stratagene，USA)分别在含有50mg/L amplicillin的LB介质(酵母提取物5g/L，色氨酸10g/L，NaCl 10g/L)中培养。

在600nm处的光密度(OD)为0.7的条件下加入1mM IPTG(异丙基-β-硫代半乳糖苷)来诱导IbpA、IbpB、或HSP26蛋白的表达。诱导4小时后，取各培养溶液1ml并在4℃和6000rpm下离心5分钟，用0.5ml TE溶液洗涤所获得的沉淀物一遍并在4℃和6000rpm下离心5分钟以获得沉淀物。将沉淀物悬浮于0.2ml的平衡溶液(尿素8M，NaH₂PO₄ 100mM，Tris 10mM，pH8.0)中，并进行超声波均质和分级。

将上述上清液在4℃和10000rpm下离心10分钟，收集上清液并通过用平衡溶液预先平衡过的Ni-NTA旋柱(Qiagen，USA)。然后，将该溶液在2000rpm下离心2分钟。将600μl洗涤溶液(尿素8M，NaH₂PO₄ 100mM，Tris 10mM，pH6.3)通过柱两遍。将200μl洗脱液(尿素8M，NaH₂PO₄ 100mM，Tris 10mM，pH4.5)注入柱中以纯化IbpA、IbpB、和HSP26蛋白。

各取含有纯化的IbpA、IbpB、或HSP26蛋白的溶液200μl，与50μlSDS-PAGE样品溶液(25％甘油、2％SDS、14.4mM 2-巯基乙醇、0.1％溴酚蓝、60mM Tris-HCl)混合。加热混合溶液10分钟并在12％的分离胶中进行SDS-PAGE凝胶电泳。接着，将凝胶浸泡在染色液(40％甲醇、10％醋酸，0.25g/L考马斯亮蓝R)中2小时以染色，并在脱色液(40％甲醇、7％醋酸)中浸泡两次，每次2小时以上，以进行脱色(图5)。

图5是表示由重组质粒pTac99IbpAH、pTac99IbpBH、pTac99_PPIbpAH或pTac99HSP26H转化的重组E.coli XL1-Blue所表达的蛋白质IbpA、IbpB、或HSP26的纯化结果。在图5(A)中，泳道M表示分子质量标准，泳道1和2表示纯化的IbpA，泳道3和4表示纯化的IbpB，泳道5和6表示纯化的_PPIbpA。在图5(B)中，泳道M表示分子质量标准，泳道1到3表示纯化的HSP26。如图5所示，纯化的IbpA、IbpB、和HSP26蛋白的纯度几乎为100％。

实施例3：IbpA和/或IbpB对用于蛋白质组研究的二维凝胶电泳的效果

将已知的IbpA和/或IbpB表达质粒pACTacIbpA、pACTacIbpB或pACTacIbpAB和作为对照的质粒p184ΔCm分别引入到ibpAB基因缺失的突变体E.coli WIB101(PCT/KR03/01371)中，然后根据实施例2中描述的方法进行细胞培养。在600nm处的光密度(OD)为0.7的条件下加入1mM IPTG(异丙基-β-硫代半乳糖苷)来诱导IbpA和/或IbpB蛋白的表达。诱导4小时后，取各培养溶液1ml并在4℃和6000rpm下离心5分钟，将获得的沉淀物保存在-20℃下。

用于各转化的E.coli的二维凝胶电泳实施如下。二维凝胶电泳是利用蛋白质的特性，即分子量和电荷差异来扩散细胞中的全部蛋白质的方法(Hochstrasser等，Anal.Biochm.，173：424-35，1988；Han等，J.Bacteriol.，183：301-8，2001)。

这里的实施例是利用PROTEAN IEF细胞和PROTEAN II xi细胞(Bio-RadLaboratories Inc.，Herculules CA)进行的二维凝胶电泳。

用于二维凝胶电泳的样品经以下方法的处理来制备。将培养液在4℃和6000rpm下离心5分钟，倒出上清液。然后将沉淀物的剩余介质用500μl的低钠缓冲液(KCl 3mM，KH₂PO₄ 1.5mM，NaCl 68mM，NaH₂PO₄ 9mM)洗涤。将沉淀物悬浮在100μl的细胞裂解缓冲液(尿素8M，CHAPS 4％(w/v)，DTT65mM，Tris 40mM)中，在4℃和12000rpm下离心10分钟，从而获得全部蛋白质。

用Bradford方法(Bradford MM，Anal.Biochem.，72：248-54，1976)将蛋白质称重。将200μg蛋白质溶解在340μl IEF变性溶液中(尿素8M，CHAPS0.5％(w/v)，DTT 10mM，Bio-lyte pH3-10 0.2％(w/v)，溴酚蓝0.001％(w/v))并插入17cm的ReadyStrip^TM IPG试纸条pH3-10(Bio-Rad Laboratories Inc.，Herculules CA)在20℃下水解12小时，然后进行等电聚焦。

将试纸条在平衡缓冲液I(尿素6M，SDS 2％(w/v)，Tris-HCl(pH8.8)0.375M，甘油20％(v/v)，DTT 130mM)中摇晃大约15分钟，并再次在平衡缓冲液II(尿素6M，SDS 2％(w/v)，Tris-HCl(pH8.8)0.375M，甘油20％(v/v)，碘乙酰胺135mM，溴酚蓝3.5M)中摇晃15分钟。然后，根据分子量将该试纸条在聚丙烯酰胺凝胶上分离。

通过银染试剂盒(Amersham Biosciences Uppsala，Sweden)染色蛋白质，并通过GS710 Calibrated Imaging Densitometer(Bio-Rad Laboratories Inc.，Herculules CA)扫描二维凝胶。用Melanie软件(Bio-Rad Laboratories Inc.，Herculules CA)测定凝胶上蛋白质或斑点的数目(图6)。

图6是转化的E.coliWIB101的二维凝胶电泳图，其中IbpA和/或IbpB在体内过表达。在图6中，(A)表示E.coli WIB101(p184ΔCm)，(B)表示E.coli WIB101(pACTacIbpA)，(C)表示E.coli WIB101(pACTacIbpB)以及(D)表示E.coli WIB101(pACTacIbpAB)。二维凝胶上的圆圈表示IbpA和/或IbpB蛋白。

如图6所示，与从作为对照的E.coli WIB101(p184ΔCm)获得的凝胶相比，从转化的E.coliWIB101(pACTacIbpA)、WIB101(pACTacIbpB)或WIB101(pACTacIbpAB)获得了具有许多蛋白质斑点的二维凝胶。

实施例4：IbpA、IbpB和HSP26对E.coli W3110二维凝胶电泳的效果

根据实施例3中描述的方法进行E.coli W3110的二维凝胶电泳。首先，进行二维凝胶电泳以观察10μg纯化IbpA或IbpB蛋白的纯度(图7)。

图7表示了纯化的IbpA或IbpB蛋白的二维凝胶电泳图。在图7中，(A)和(B)分别表示IbpB和IbpA。如图7所示，二维凝胶电泳的结果是，除了IbpA和IbpB蛋白之外没有其它的蛋白质存在。因此，说明IbpA和IbpB的纯度几乎为100％。

向200μg定量的E.coli W3110蛋白加入IbpA、IbpB和HSP26蛋白各10μg，来进行二维凝胶电泳以观察sHSPs的效果(图8)。用200μg定量的E.coli W3110作为对照。

图8表示了E.coli W3110的二维凝胶电泳图。在图8中，(A)表示作为对照的E.coli W3110，(B)是向E.coli W3110加入10μg IbpB蛋白的情况，(C)是向E.coli W3110加入10μg IbpA蛋白的情况，(D)是向E.coli W3110加入10μg来自假单胞菌的IbpA蛋白的情况，以及(E)是向E.coli W3110加入10μg来自酿酒酵母的HSP26蛋白的情况。如图8所示，观察到加了IbpA、IbpB和HSP26蛋白的二维凝胶电泳与已知的方法相比具有许多蛋白质斑点。

实施例5：IbpA对假单胞菌的二维凝胶电泳的效果

根据实施例3中所述的方法对恶臭假单胞菌KT2440进行二维凝胶电泳。通过向200μg定量的恶臭假单胞菌KT2440蛋白加入10μg IbpA蛋白来进行二维凝胶电泳以观察IbpA的效果(图9)。用200μg定量的恶臭假单胞菌KT2440蛋白作为对照。

图9表示了恶臭假单胞菌KT2440的二维凝胶电泳图。在图9中，(A)表示作为对照的恶臭假单胞菌KT2440，以及(B)表示向恶臭假单胞菌KT2440加入10μg IbpA蛋白的情况。如图9所示，观察到加入IbpA蛋白的二位凝胶电泳具有许多蛋白质斑点。

实施例6：IbpA对人血清的二维凝胶电泳的效果

根据实施例3中所述的方法对人血清进行二维凝胶电泳。通过向200μg定量的人血清蛋白加入10μg IbpA蛋白来进行二维凝胶电泳以观察IbpA的效果(图10)。用200μg定量的人血清蛋白作为对照。

图10表示了人血清的二维凝胶电泳图。在图10中，(A)表示作为对照的人血清，以及(B)表示向人血清加入10μg IbpA蛋白的情况。如图10所示，观察到加入IbpA蛋白的二位凝胶电泳具有许多蛋白质斑点。

工业实用性

如上所述，本发明具有提供一种含有sHSPs、可用于防止蛋白质降解的创造性组合物以及一种用于二维凝胶电泳的组合物的效果。而且，利用sHSPs如IbpA、IbpB、IbpAB、HSP26等，可防止二维凝胶电泳中蛋白质斑点的减少，从而获得具有大量蛋白质斑点的二维凝胶。因此，预计本发明可改进有关细胞中的蛋白质组的研究。

                                    序列表

                    SEQUENCE LISTING

<110>韩国科学技术院(KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND

     TECHNOLOGY)

<120>包括小分子热休克蛋白(sHSPs)用于防止蛋白质降解的组合物以及利用sH

     SPs的二维凝胶电泳方法

<130>FP06KR096

<140>PCT/KR2003/002539

<141>2003-11-24

<150>KR10-2003-0062756

<151>2003-09-08

<160>8

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primet

<400>1

ggaattcatg cgtaactttg atttatcccc g                                        31

<210>2

<211>51

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>2

cccaagcttt taatggtgat gatggtgatg gttgatttcg atacggcgcg g               51

<210>3

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>3

ggaattcatg cgtaacttcg atttatcccc actg                                     34

<210>4

<211>53

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>4

ccaagctttt aatggtgatg atggtgatgg ctatttaacg cgggacgttc gct             53

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>5

ggaattcatg accatgacta ctgctttc                                         28

<210>6

<211>47

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>6

cccaagcttt taatggtgat gatggtgatg gttcagcgct ggttttt                    47

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>7

ggaattcatg tcatttaaca gtccatttt                                        29

<210>8

<211>51

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>8

cccaagcttt taatggtgat gatggtgatg gttaccccac gattcttgag a               51