elF－5A同工型:衰老－诱导elF－5A；损伤－诱导elF－5A；生长elF－5A和DHS

相关申请

本申请是申请09/725,019(申请于2000年11月29日)的部分继续申请，而申请09/725,019是申请09/597,771(申请于2000年6月19日，现在是美国专利6,538,182)的部分继续申请，而申请09/597,771是申请09/348,675(申请于1999年7月6日，现已放弃)的部分继续申请。本申请通过引用美国临时申请60/479,698、60/479,969(均申请于2003年6月20日)和美国临时申请60/(编号待定)摘要号10799/120、60/(编号待定)摘要号10799/120(均申请于2004年5月14日)结合至文中并要求对它们的优先权。

发明领域

本发明涉及以下内容：真核起始因子5A(“eIF-5A”)的独特的同工型、编码eIF-5A的多核苷酸、脱氧羟丁赖氨酸(hypusine)合酶(“DHS”)、编码DHS的多核苷酸，以及eIF-5A同工型和DHS的的表达调节方法。

现有技术描述

衰老是一个植物体生命过程中的末期。它预示死亡并且发生于生物体组织的各个水平上，包括整个植物、器官、花、果实、组织和单个细胞。

多种体内体外因子都可诱导衰老起始。衰老是植物体生命中或植物组织(如果实、花、叶)的一个复杂、高度受控的发育阶段。衰老导致细胞膜和生物大分子的协同崩溃和随之发生的代谢物向植物体其它部分的移动。

除了在正常的植物体发育过程中发生的程序性衰老，细胞和组织的死亡及随之发生的代谢物重定位也可以是由于外部，环境因子诱发的协同性反应。衰老也被称为坏死或细胞程序性死亡，诱导衰老过早起始的外部因子包括环境应激(environmental stress)如温度、干旱、光照或营养缺乏，也包括病原体攻击。受到环境应激作用的植物组织也产生乙烯，通常称作应激乙烯(Buchanan-Wollaston，V.，1997，J.Exp.Botany，48：181-189；Wright，M.，1974，Plant，120：63-69)，已知在某些植物体中乙烯会引起衰老。

衰老并不是一个被动过程，更准确的说是一个主动的受控过程，涉及特定基因的协同表达。在衰老过程中，总RNA量下降，许多基因的表达被关闭(Bate等1991，J.Exper.Botany，42，801-11；Hensel等1993，The Plant Cell，5，553-64)。但是，越来越多的证据表明衰老过程依赖于核基因的从头转录。例如，除胞核作用、mRNA和蛋白合成的抑制剂可阻碍衰老。在对来自衰老叶和绿叶的mRNA体外翻译的分子研究中发现，衰老叶的蛋白产物模式发生了变化(Thomas等1992，J.Plant Physiol.，139，403-12)。使用差示筛选和扣除杂交技术，已从不同植物体中鉴别出许多代表衰老-诱导基因的cDNA克隆，包括单子叶植物和双子叶植物，如拟南芥(Arabidopsis)、玉米、黄瓜、芦笋、番茄、稻和马铃薯。鉴别出衰老过程中特异表达的基因有力证明了衰老的进行需要从头转录。

在坏死和死亡发生以前，衰老过程中发生的事件显示出高度的协调以允许最大限度的使用细胞成分。一定存在复杂的相互作用来调节这个过程，包括对特异信号的感知和基因级联表达的诱导。编码衰老相关蛋白的基因表达很可能通过普通激活蛋白所调节，而激活蛋白依次直接或间接被激素信号活化。对这个过程的起始信号和随后的协同作用的机制了解甚少。

基因的协同表达需要转录和翻译因子包括起始因子。不同生物包括植物的翻译起始因子已被分离和鉴定。翻译起始因子可控制mRNA移出细胞核的速率，控制mRNA结合到核糖体的速率，并且在某种程度上可影响特定mRNAs的稳定性(Zuk，et al.，EMBOJ.17：2914-2925(1998))。这样一个并不是整体翻译活性都需要的翻译起始因子被确信为从胞核到胞质穿梭运输特定mRNA亚群以利翻译。Jao，等J.Cell Biochem.86：590-600，(2002)；Wang等J Biol Chem276：17541-17549(2001)；Rosorius et al.J.Cell Sci.，112，2369-2380(1999)。这种翻译因子称为真核起始因子5A(eIF-5A)，它是已知的唯一一种含氨基酸羟丁赖氨酸的蛋白。Park，等J Biol Chem263：15264-15269(1988)。真核起始因子5A(eIF-5A)是一种基本蛋白因子，大小约为17kDa，参与真核细胞蛋白合成的起始作用。羟丁赖氨酸其特征在于存在羟丁赖氨酸，羟丁赖氨酸[N-(4-氨基-2-羟基丁基)赖氨酸]是一种独特的修饰氨基酸，已知只存在于eIF-5A中。羟丁赖氨酸通过使多胺即亚精胺上的丁氨基基团转移至eIF-5A中特定赖氨酸残基的侧链氨基上并进行羟化，从而翻译后修饰形成羟丁赖氨酸。eIF-5A的激活包括使亚精胺上的丁氨基转移至eIF-5A赖氨酸残基上、形成羟丁赖氨酸并活化eIF-5A。在真核生物中，脱氧羟丁赖氨酸(DHS)合酶介导eIF-5A中羟丁赖氨酸的翻译后形成。体外使用甲硫氨酰-嘌呤霉素实验表明羟丁赖氨酸修饰对eIF-5A的活性是必需的。

通过脱氧羟丁赖氨酸合酶(DHS：EC1.1.1.249)和脱氧羟丁赖氨酸羟化酶(DHH：EC1.14.99.29)对保守的赖氨酸残基的转化作用，羟丁赖氨酸翻译后在eIF-5A上形成羟丁赖氨酸。DHS已从几种植物中分离出，包括番茄(GenBank Accession Number AF296077)、拟南芥Arabidopsis thaliana)(AT-DHS；GenBank Accession NumberAF296078)、烟草(Ober和Hartmann，1999)、康乃馨(GenBank AccessionNumber AF296079)和香蕉(GenBank Accession Number AF296080)，然而DHH基因仍未被识别。

DHS将亚精胺的丁氨基转移至eIF-5A的一个保守性赖氨酸残基上4，将其转化为脱氧羟丁赖氨酸。这个中间体形式的eIF-5A再被DHH羟化为羟丁赖氨酸。Park等Biol.Siganals 6，115-123(1997)。体外eIF-5A脱氧羟丁赖氨酸型和羟丁赖氨酸型均可与mRNA结合。Liu Park等Biol Signals 6：166-174(1997)。尽管eIF-5A的功能并未被完全认识，但有证据表明它可调节细胞分裂(Park等Biol.Chem.276(20)：17541-17549(2001)；Tome等Biol Signals 6：150-156，(1997))和衰老(Wang等JBiol Chem 276(20)：17541-17549(2001))。也可见美国专利6,538,182和美国申请09/725,019，两者的全部内容通过引用被结合至本文中。一些生物含有一种以上的eIF-5A同工型，这些同工型须满足以下前提，即每种同工型都是特定组的mRNA的特异穿梭载体，而这些mRNA涉及诸如细胞分裂和衰老之类的过程。

Wang等人证明番茄果实变软及自然和应激诱导的叶衰老与DHSmRNA水平上升有关(Wang等J Biol Chem 276(20)：17541-17549(2001))。此外，在转基因番茄中引入一个组成性启动子控制下的DHS cDNA反义片段来抑制DHS表达时，果实变软和酸败的推迟证明了这些转基因番茄的果实表现出明显的衰老推迟。参见美国专利6,538,182和申请于2003年11月29日的美国申请09/725,019，其全部内容通过引用结合至本文中。既然已知DHS活化eIF-5A，这些数据显示羟丁赖氨酸-修饰的eIF-5A(活性eIF-5A)可通过选择性翻译衰老所需mRNA来调节衰老。这一点通过在拟南芥(“AT”)中表达一个组成性启动子控制下的全长或3’UTR cDNA的反义序列以减量调节DHS得到进一步证明。通过减量调节拟南芥DHS(“AT-DHS”)表达并减少其对eIF-5A活化的可用性，衰老被推迟了约2周(见美国专利6,538,182)。在这样的转基因植物里，不仅观察到衰老被推迟，而且观察到种子产量上升、对应激的耐受力上升和生物量产出上升，而且这里每种表型的程度由DHS表达减量调节的程度所决定。Southern blot(Wang等2001)和BLAST分析表明番茄和拟南芥基因组中仅含有一个拷贝的DHS基因，因而为了寻靶负责衰老转录物运出胞核的特异eIF-5A同工型，必须通过衰老-诱导eIF-5A的反义构建体(具3’UTR)或利用植物对一个过表达基因进行减量调节的天然能力(即通过利用正义(sense)多核苷酸来得到过量表达)来鉴定和特异减量调节衰老特异eIF-5A同工型。

植物没有免疫系统，因而具有一种独特方法来应对病毒——这种方法称为共抑制，这种方法可导致病毒RNA的序列特异性降解。当转基因处于一个强组成型启动子(如花椰菜镶嵌病毒双35S启动子)控制下时，其对植物体来说表现为病毒的转录物，并发生序列特异性降解，但不仅仅是转入的基因，相应内源基因也被降解。(见综述，Fagard and Vaucheret，Annual Review.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，June；51：167-194(2000))一些证据表明，对内源基因表达的减量调节来说共抑制作用的有效性，如不是更有效则与通过反义技术抑制表达的有效性相当。

发明概述

本发明提供真核起始因子5A(“eIF-5A”)同工型：衰老-诱导eIF-5A，损伤-诱导eIF-5A和生长eIF-5A以及编码这三种因子的多核苷酸。本发明提供这三种eIF-5A的反义多核苷酸，也提供包含这三种eIF-5A同工型的正义和反义多核苷酸的表达载体。本发明也涉及这些因子的表达调节(提高/增量-调节或抑制)的方法。

本发明也涉及脱氧羟丁赖氨酸合酶(“DHS”)和其编码多核苷酸。本发明提供DHS的反义多核苷酸，也提供包含DHS的正义和反义多核苷酸的表达载体。本发明也涉及DHS的表达调节(提高/增量-调节或抑制)的方法。

附图简述

图1为拟南芥的三种eIF-5A同工型序列对比。行1为衰老-诱导eIF-5A(美国6;538;182和未决申请(pengding application)09/725,019已有描述）；行2为损伤-诱导eIF-5A；行3为生长eIF-5A。

图2为拟南芥的三种eIF-5A同工型编码区域序列对比。行1为衰老-诱导eIF-5A；行2为损伤-诱导eIF-5A；行3为生长eIF-5A。

图3为拟南芥的衰老-诱导eIF-5A的基因组基因序列。

图4为拟南芥的损伤-诱导eIF-5A的基因组基因序列。

图5为拟南芥的生长eIF-5A的基因组基因序列。

图6为双载体pKYLX71-35S²图谱。

图7为双载体pGEM-T EasyVector图谱。

图8为哥伦比亚生态型(Columbia ecotype)的拟南芥野生型植株不同组织中全部三种eIF-5A同工型的蛋白印迹杂交分析结果。

图9为哥伦比亚生态型(Columbia ecotype)的拟南芥野生型植株叶子感染72h后衰老-诱导eIF-5A和损伤-诱导eIF-5A的蛋白印迹杂交分析结果。

图10为哥伦比亚生态型(Columbia ecotype)的拟南芥野生型植株叶发生损伤72h后三种eIF-5A同工型的RNA印迹杂交分析结果。

图11描述了衰老-诱导AteIF-5A、损伤-诱导AteIF-5A、生长AteIF-5A的基因组DNA的PCR产物，分别为1、2、3号泳道。

图12为pGEM中的衰老-诱导AteIF-5A、损伤-诱导AteIF-5A、生长AteIF-5A基因组序列的琼脂糖凝胶电泳结果。

图13为pKYLX71中的衰老-诱导AteIF-5A、损伤-诱导AteIF-5A、生长AteIF-5A基因组序列的琼脂糖凝胶电泳结果。

图14是用含有正义损伤-诱导AteIF-5A的结构转化的植株的T1平板照片。

图15为用正义损伤-诱导AteIF-5A转化的T1植株在4周龄时的照片。

图16为用正义损伤-诱导AteIF-5A转化的T1植株在5.5周龄时的照片。

图17为用正义损伤-诱导AteIF-5A转化的T2植株在播种后10天的照片。

图18为用正义生长AteIF-5A转化的T1植株在播种后10天的照片。

图19为用正义生长AteIF-5A转化的T1植株在4周龄时的照片。

图20为用正义生长AteIF-5A转化的T2植株品系的蛋白杂交印迹分析。

图21为用正义生长AteIF-5A转化的T2植株(品系1A-1D)4周龄(上方)、5周龄(左下方)和6周龄(右下方)时的照片。

图22为用正义生长AteIF-5A转化的T2植株(品系2A-1D)4周龄(上方)、5周龄(左下方)和6周龄(右下方)时的照片。

图23为用正义生长AteIF-5A转化的T2植株(品系4A-D)4周龄(上方)、5周龄(左下方)和6周龄(右下方)时的照片。

图24为用正义生长AteIF-5A转化的T2植株(品系15A-D)4周龄(上方)、5周龄(左下方)和6周龄(右下方)时的照片。

图25为用正义生长AteIF-5A转化的T2植株(品系8A-D)4周龄(上方)、5周龄(左下方)和6周龄(右下方)时的照片。

图26为用正义生长AteIF-5A转化的T2植株(品系9E-H)4周龄(上方)、5周龄(左下方)和6周龄(右下方)时的照片。

图27为用正义生长AteIF-5A转化的T2植株(品系11A-D)4周龄(上方)、5周龄(左下方)和6周龄(右下方)时的照片。

图28为用正义生长AteIF-5A转化的T2植株(品系16A-D)4周龄(上方)、5周龄(左下方)和6周龄(右下方)时的照片。

图29为拟南芥不同植株品系种子的照片，包括野生型对照和被正义生长AteIF-5A转化的品系。

图30为用正义生长AteIF-5A转化的亚品系种子的平均大小柱状图。

图31为用正义生长AteIF-5A转化的亚品系单个种子大小柱状图

图32是显示单个种子重量与单个种子体积间的比例关系的曲线图。

图33为用正义生长AteIF-5A转化的每个亚品系植株种子产量柱状图。

图34为正义生长AteIF-5A植株的表型概括。

图35为转基因拟南芥植株(用反义全长衰老-诱导eIF-5A转化)与野生型株对比。转基因株表现出衰老推迟。

图36-38为用反义生长eIF-5A转化的植株的照片。

图39为构建用以产生反义拟南芥3’DHS的载体时所用引物。

图40为载体构建体。

图41为分离自拟南芥的损伤因子eIF-5A序列，及其反义构建体的定位。

图42为载体构建体。

图43为与假单胞杆菌温育的叶片盘(discs)的平板计数。

图44为反义转基因植株对野生型株的CFU图。

图45为得自番茄叶cDNA文库的番茄叶DHS cDNA序列(SEQ IDNO：1)和其相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图46为通过将番茄DHS基因序列与拟南芥基因库中未鉴定序列(SEQ ID NO：5)对比得到的拟南芥DHS基因核苷酸序列。氨基酸间的间隙推测为内含子。图46B为相应的拟南芥DHS氨基酸序列(SEQIDNO：6)。图46C为通过PCR得到的拟南芥DHS cDNA的一个600碱基对的多核苷酸序列。图46D为DHS cDNA片段的相应氨基酸序列。

图47为相应的番茄叶DHS全长氨基酸序列(SEQ ID NO：2)、相应的拟南芥衰老-诱导DHS全长氨基酸序列，以及人、酵母、真菌、古生菌(Archaeobacteria)的DHS氨基酸序列对比。三或四个序列间的相同氨基酸用方框标出。

图48为番茄DHS cDNA限制性酶切图谱。

图49是以³²P-dCTP标记的全长番茄DHS cDNA为探针的，分离自番茄叶的基因组DNA的DNA杂交印迹分析结果。

图50为不同阶段下分离自番茄花的RNA做RNA杂交印迹分析结果。顶部为总RNA的溴化乙锭染色凝胶电泳结果。每条带含10μgRNA。底部是以³²P-dCTP标记的全长番茄DHS cDNA为探针的RNA杂交印迹的放射自显影图。

图51为不同成熟阶段的番茄果实RNA的RNA杂交印迹分析结果，用³²P-dCTP标记的全长番茄DHS cDNA为探针。每条带含10μgRNA。

图52为分离自2M山梨醇处理干旱应激下的番茄叶6h的RNA杂交印迹分析结果，每个带含10μgRNA。印迹用³²P-dCTP标记的全长番茄DHS cDNA探测。

图53是分离自低温处理的番茄叶的RNA杂交印迹分析结果。图53A为总RNA的溴化乙锭染色凝胶电泳结果，每条带含10μgRNA。图53B是以³²P-dCTP标记的全长番茄DHS cDNA为探针的RNA杂交印迹放射自显影图。图53C为通过叶渗出液电导率测量的相应分析渗漏数据。

图54为康乃馨DHS全长(1384bp)cDNA克隆核苷酸序列(SEQ IDNO：9)，不包括polyA尾和5’末端非编码区域。核苷酸下方为相应氨基酸序列(373氨基酸残基，SEQ ID NO：10)

图55是衰老中拟南芥叶的总RNA杂交印迹分析结果，³²P-dCTP标记的全长拟南芥DHS cDNA为探针。顶部为放射自显影图，底部为溴化乙锭染色凝胶图。

图56是不同阶段康乃馨花瓣总RNA杂交印迹分析结果，³²P-dCTP标记的全长康乃馨DHS cDNA为探针。顶部为放射自显影图，底部为溴化乙锭染色凝胶图。

图57上方为番茄果实衰老-诱导eIF-5A基因序列(SEQ ID NO：11)，下方为相应氨基酸序列(SEQIDNO：12)。

图58上方为康乃馨衰老-诱导eIF-5A基因序列(SEQIDNO：13)，下方为相应氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。

图59上方为拟南芥衰老-诱导eIF-5A基因序列(SEQ ID NO：15)，下方为相应氨基酸序列(SEQ ID NO：16)。

图60是拟南芥不同阶段叶的总RNA杂交印迹分析结果，³²P-dCTP标记的全长拟南芥DHS cDNA和³²P-dCTP标记的全长衰老-诱导eIF-5A基因为探针。顶部为放射自显影图，底部为溴化乙锭染色凝胶图。

图61是分离自番茄果实的果实花端着色(breaker BK)，红-硬(red-firm RF)和红-软(red-soft，RS)阶段的总RNA杂交印迹分析结果，³²P-dCTP标记的全长番茄DHS cDNA和³²P-dCTP标记的全长衰老-诱导eIF-5A基因为探针。伴随果实成熟，DHS和eIF-5A含量在红-硬阶段平行上调。顶部为放射自显影图，底部为溴化乙锭染色凝胶图。

图62为经山梨醇处理干旱应激的番茄叶总RNA杂交印迹分析结果。C为对照，S为经山梨醇处理的样品。以³²P-dCTP标记的全长番茄DHS cDNA和³²P-dCTP标记的全长衰老-诱导eIF-5A基因为探针作印迹。eIF-5A和DHS对干旱应激的反应是含量提高。顶部为放射自显影图，底部为溴化乙锭染色凝胶图。

图63为番茄花蕾和开放并衰老中的花的总RNA杂交印迹分析结果，以³²P-dCTP标记的全长番茄DHS cDNA和³²P-dCTP标记的全长衰老-诱导eIF-5A基因为探针作印迹。eIF-5A和DHS的含量在开放/衰老花中含量提高。顶部为放射自显影图，底部为溴化乙锭染色凝胶图。

图64为寒害的番茄叶总RNA杂交印迹分析结果。以³²P-dCTP标记的全长番茄DHS cDNA和³²P-dCTP标记的全长衰老-诱导eIF-5A基因为探针作印迹。eIF-5A和DHS在复温期间随寒害的发展而含量提高。顶部为放射自显影图，底部为溴化乙锭染色凝胶图。

图65为3.1周龄的野生型拟南芥(左方)和反义方向表达DHS 3’末端基因(序列见图80)的转基因株的照片，显示转基因株的叶比野生型大。

图66为4.6周龄的野生型拟南芥(左方)和反义方向表达DHS 3’末端基因(序列见图80)的转基因株的照片，显示转基因株的叶比野生型大。

图67为5.6周龄的野生型拟南芥(左方)和反义方向表达DHS 3’末端基因(序列见图80)的转基因株的照片，显示转基因株的叶比野生型大。

图68为6.1周龄的野生型拟南芥(左方)和反义方向表达DHS 3’末端基因(序列见图80)的转基因株的照片，显示转基因株的外形比野生型大。

图69是反义方向表达DHS基因的三个转基因拟南芥T₁品系植株的种子产量增加的图。以种子的体积来计量种子的产量。野生型株的SEn＝30。

图70为反义方向表达DHS 3’末端基因(序列见图80)的转基因番茄植株(左方)和野生型株(右方)的照片，显示转基因株的叶和植株体都大于野生型株。照片摄于将植株幼苗移植至土中18天后。

图71为反义方向表达DHS 3’末端基因(序列见图36)的转基因番茄植株(左方)和野生型株(右方)的照片，显示转基因株的叶和植株体都大于野生型株。照片摄于将植株幼苗移植至土中32天后。

图72-79为野生型番茄果实(顶部组)和反义方向表达全长DHS基因的转基因番茄果实(底部组)的照片。果实在果实花端着色阶段采集，在生长室里成熟。自采集起的时间(以天为单位)显示于每组的左上角。

图80为拟南芥衰老-诱导DHS基因的3’末端核苷酸序列(SEQ IDNO：30，上方)和相应氨基酸序列(下方)，这个DNA片段被用来以反义方向转化植株。

图81为番茄DHS基因的3’末端核苷酸序列(SEQ ID NO：31，上方)和相应氨基酸序列(下方)，这个DNA片段被用来以反义方向转化植株。

图82为600bp拟南芥DHS探针的核苷酸序列(SEQ ID NO：26，上方)和相应氨基酸序列(下方)，该探针被用来分离全长拟南芥基因。

图83为483bp康乃馨DHS探针的核苷酸序列(SEQ ID NO：27，上方)和相应氨基酸序列(下方)，该探针被用来分离全长康乃馨基因。

图84(a)和(b)为以反义方向表达DHS 3’末端基因(序列见图81)的转基因番茄果实(右方)和野生型果实(左方)的照片。野生型果实表现出花蒂腐(blossom end rot)，而转基因果实则无。

图85为几种植物的不同eIF-5A同工型序列对比，也显示羟丁赖氨酸保守区域的对比。

图86为番茄衰老-诱导eIF-5A多核苷酸和氨基酸序列。

图87为拟南芥衰老-诱导eIF-5A和pKYLX71-正义衰老-诱导eIF-5A的结构。

图88为番茄衰老-诱导eIF-5A和pKYLX71-正义衰老-诱导eIF-5A的结构。

图89为拟南芥对照株和包含正义多核苷酸衰老-诱导eIF-5A的转基因株的对比照片。转基因株比对照株有更粗的开花茎。

图90和图91为包含正义多核苷酸衰老-诱导eIF-5A的转基因植株，(图90为拟南芥，图91为番茄)，转基因株更发达的木质部表明转基因株木质部产生作用增强。

图92为拟南芥对照植株和包含正义多核苷酸衰老-诱导eIF-5A的拟南芥转基因株的对比，在拟南芥中使用一个番茄正义多核苷酸衰老-诱导eIF-5A。转基因株有比对照株有更粗的开花茎。

图93和94两个柱状图显示包含正义多核苷酸衰老-诱导eIF-5A的转基因植株有更高的木质部产生作用。图94涉及番茄的正义多核苷酸衰老-诱导eIF-5A。

图95为油菜(canola)的生长eIF-5A氨基酸序列和多核苷酸序列。

图96为油菜的生长eIF-5A和pKYLX71-正义生长eIF-5A结构。

图97为油菜DHS氨基酸序列和多核苷酸序列。

图98为油菜DHS和pKYLX71-正义DHS结构。

图99的柱状图显示在油菜里DHS的表达抑制提高了种子产量。

图100的柱状图，从左到右依次显示拟南芥、油菜、番茄的生长同工型eIF-5A增量调节和番茄DHS的增量调节。

图101为番茄生长eIF-5A氨基酸和多核苷酸序列。

图102为番茄生长eIF-5A和pKYLX71-正义生长eIF-5A结构。

图103为番茄损伤-诱导eIF-5A氨基酸序列和多核苷酸序列。

图104a和b为番茄损伤-诱导eIF-5A和pKYLX71-正义番茄损伤-诱导eIF-5A结构。

图105为莴苣DHS多核苷酸的部分序列。

图106为pTA7001-3’UTR反义莴苣DHS构建体。

图107A和B为苜蓿DHS氨基酸和多核苷酸序列。

图108 A和B为香蕉DHS氨基酸和多核苷酸序列。

图109 A和B为三角叶杨(cottonwood)DHS氨基酸和多核苷酸序列。

图110为香蕉黑条叶斑病球腔菌(mycosphaerella fijiensis)部分DHS氨基酸和多核苷酸序列。

发明详述

在这里，术语“植物”指完整植株、植株的一部分、植物细胞，或指植物细胞群。可适用本发明方法的植物类型不限定，包括如乙烯敏感型和乙烯不敏感型植物；产果型植物如杏树、苹果树、橘树、香蕉、葡萄、梨树、番茄、草莓、鳄梨等；蔬菜如胡萝卜、豌豆、莴苣、卷心菜、芜菁、马铃薯、椰菜、芦笋等；花卉类如康乃馨、玫瑰、菊花等；农作物如玉米、稻谷、大豆、苜蓿等；和林木类如落叶树、针叶树、常绿树等；一般而言，任何可接受并表达本发明的DNA分子的植物都适用于本发明。也可包括不同倍体水平的植物，包括单倍体、双倍体、四倍体和多倍体。所用的植物可以是单子叶或双子叶植物。

这里转基因植物定义为经某种方法进行遗传修饰的植株，包括但不限于将异源或同源衰老-诱导eIF-5A、损伤-诱导eIF-5A、生长eIF-5A或DHS的基因整合进基因组的植株。被改变的遗传物质可编码蛋白，也可含有一段调节或控制序列，或者其本身是或包含一段反义序列或正义序列，或编码一段反义RNA或正义RNA且这些RNA是该植株的衰老-诱导eIF-5A、损伤-诱导eIF-5A、生长eIF-5A或DHSDNA或mRNA序列或是其部分片段的正义或反义序列。“转基因”和“转基因序列”定义为被整合到转基因植物的外源基因或部分基因序列。

这里用的术语“杂交”意指在合适的严格条件下进行的核酸杂交，其条件可由本领域技术人员根据探针序列和靶序列特性来方便的确定。杂交和洗脱条件为本领域熟知的，而且也可方便的根据所需严格性通过改变温育时间，温度和/或溶液离子强度来调节条件。例如可参见Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^nd edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York，1989。条件选择要依据待杂交序列长度，特别是探针序列长度、核酸的相对G-C含量、允许的错配量来进行。当需要两条互补性较低的链进行部分杂交时，优选低严格性条件。当需要完全互补或近似完全互补时，优选高严格性条件。此处所说的高严格性所指如下：杂交液含6×SSC、0.01M EDTA、1×Denhardt溶液和0.5％SDS。杂交在约68℃进行，当进行DNA克隆片段杂交时杂交时间约3-4h，当进行真核总DNA杂交时杂交时间约12-l6h。对较低严格性可降低杂交温度至约42℃，低于双链解链温度(T_M)。已知T_M是G-C含量、双链长度和溶液离子强度的函数。

这里所用的术语“基本序列同一性”(sustantial sequence identity)或“基本同源性”(substantial homology)是指一段多核苷酸序列或氨基酸序列与另一段多核苷酸序列或氨基酸序列的结构和/或功能基本上等同。具有基本序列同一性或基本同源性的序列间的任何结构或功能差异都是微小的，也就是说这些差异不会影响这些序列在所需应用中发挥期望作用的能力。例如，差异可能是由于不同种类生物在密码子使用上的固有差别引起的。如果两个或更多不同序列间有显著量的序列重叠或相似性，或者即使有长度或结构不同但不同序列间表现出相似的物理特性，那么结构上的差异就被认为是微小的。这种物理特性包括如在限定条件下杂交的能力，或者对蛋白是免疫交叉反应能力或相似的酶活性等。这些特性中的每一种都可由本领域技术人员用本领域已知技术方便地确定。

此外，如两条多核苷酸序列至少有约70％，优选约80％，最优选约90％的相似性，则它们“基本互补”(substantial complementary)。如果两条氨基酸序列在其多核苷酸的活性部分间至少有70％的相似性，则两条氨基酸序列基本同源(substantial homologous)。

这里所用的短语“与(DNA或RNA分子的)相应部分杂交”意为参与杂交的一方分子如寡核苷酸、多核苷酸或任何核苷酸序列(正义或反义方向)识别并杂交到另一方核酸分子的一段序列上，而后者核酸分子具有约和前者相同的大小并且有足够的相似性以影响合适条件下的杂交。例如，一段100核苷酸长的番茄损伤-诱导eIF-5A基因3’编码或非编码区域的反义序列，会识别并杂交到3’编码或非编码区域内一段约100核苷酸核酸部分上，后者可以是AT损伤-诱导eIF-5A基因或其它任何植物的损伤-诱导eIF-5A基因，只要两条核酸分子有约70％或更高的相似性。要理解的是，“相应区域”可允许杂交发生一些错配，因而“相应区域”可小于或大于杂交到其上的分子，如大于或小于20％-30％，优选大小差异不超过约12-15％。

这里所用的术语，一个核酸(或多核苷酸)的“功能性衍生物”是指编码衰老-诱导eIF-5A、损伤-诱导eIF-5A、生长eIF-5A或DHS的核苷酸序列或基因的一个片段、变异体、同源物或类似物。一个功能性衍生物至少保留了衰老-诱导eIF-5A、损伤-诱导eIF-5A、生长eIF-5或DHS的编码DNA的部分功能，使其使用与本发明一致。这种功能可包括在高度严格条件下与分离的天然衰老-诱导eIF-5A、损伤-诱导eIF-5A、生长eIF-5或DHS基因进行杂交，或是与来自其它植物的基本同源DNA或其mRNA转录物进行杂交的能力，而这些衰老-诱导eIF-5A、损伤-诱导eIF-5A、生长eIF-5或DHS基因的反义序列抑制衰老-诱导eIF-5A、损伤-诱导eIF-5A、生长eIF-5或DHS的表达。

基因或DNA序列的“片段”指这个核酸分子的任一亚组，如较短的多核苷酸或寡核苷酸。“变异体”指与整个基因或基因的一个片段基本相似的分子，如含有一个或多个取代核苷酸的核苷酸取代变异体，但仍保持了与特定基因杂交的能力或者编码能够与天然DNA杂交的mRNA转录物的能力。“同源物”指来自异属或异种植物的片段或变异体序列。“类似物”指一个非天然的分子，它与整个分子、变异体或其片段具有基本相似或功能相关。

“调节表达”指表达被抑制或增量调节。“抑制表达”指靶基因相应蛋白和/或mRNA缺失或含量水平可探测性下降，如抑制衰老-诱导eIF-5A、损伤-诱导eIF-5A、生长eIF-5或DHS。“增量调节”或”过度表达”指靶基因相应蛋白和/或mRNA含量水平可探测性上升，如衰老-诱导eIF-5A、损伤-诱导eIF-5A、生长eIF-5或DHS。

本发明中的分离的多核苷酸包括那些从天然来源分离出的，重组产生的或人工合成的多核苷酸。

本发明中的分离的肽包括那些从天然来源分离出的，重组产生的或人工合成的肽。本发明的分离蛋白包括以融合蛋白形式表达的衰老-诱导eIF-5A、损伤-诱导eIF-5A、生长eIF-5A或DHS，优选包含eIF-5A或DHS与麦芽糖结合蛋白融和的蛋白。

本发明的衰老-诱导eIF-5A、损伤-诱导eIF-5A、生长eIF-5A或DHS肽的“功能性衍生物”包括衰老-诱导eIF-5A、损伤-诱导eIF-5A、生长eIF-5A或DHS的片段、变异体、类似物或化学衍生物，它们至少保持部分活性或者保持与eIF-5A同工型或DHS的特异抗体进行免疫交叉反应的能力。eIF-5A或DHS肽的片段指蛋白分子的任一亚组。变异体肽可通过直接化学合成得到，例如使用该领域的已知方法。eIF-5A或DHS肽的类似物是指与整个蛋白或其片段具有基本相似性的非天然蛋白。eIF-5A或DHS的化学衍生物含有附加的肽或肽片段非正常部分的化学组成部分。通过使用能与选定的侧链或末端残基进行反应的有机衍生剂将修饰引入到肽或其片段上的靶氨基酸残基上。

依照本发明，eIF-5A或DHS肽可通过培养由本发明的多核苷酸(以正义方向)转化的细胞进行，根据克隆方案使细胞以游离或融合蛋白形式合成蛋白，再从细胞提取物或培养基中分离蛋白。或者，可在一个无细胞系统中生产蛋白。Ranu，等Meth.Enzymol.，60：459-484，(1979)。

质粒DNA的制备、限制性内切酶消化、DNA琼脂糖凝胶电泳、蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳、PCR、RT-PCR、DNA杂交印迹、RNA杂交印迹、DNA连接和细菌转化这些操作按本领域已知的常规方法进行。参见如Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2^nd edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NewYork，1989。Sambrook公开了核酸的杂交技术。

与本发明一致的构建重组核酸分子的程序参见，Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^nd edition，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，New York，1989.，和Maniatis，T.et al，Molecular mechanism in the Control of Gene expression，eds.，Nierlich，etal，eds.，Acad.Press，N.Y.(1976)。后两者通过引用完全结合到本文。

与本发明一致的转基因植物可通过任何本领域内已知的植物转化方法进行DNA转化来制备。植物转化方法包括直接与根癌土壤菌(Agrobacterium tumefaciens)共培养植株、组织或细胞，或直接感染(Miki，等Meth.in Plant Mol.Biol.and Biotechnology，(1993))；直接将基因转移入原生质体或原生质摄取(Paszkowski，et al.，EMBOJ.，12：2717(1984))；电穿孔(Fromm，等Nature，319：719(1986))；微粒轰击(Klein等BioTechnology，6：559-563(1988))；注射进苗或植物的分生组织(De LaPena，等Nature，325：274-276(1987))；注射进培养细胞或组织的原生质体(Reich，等BioTechnology，4：1001-1004(1986))。

通常从转化过程得到一个完整植物。植物从原生质、愈伤组织、部分组织或移植体等中再生。从eIF-5A同工型或DHS表达被改变的再生转基因植物得到的植物部分，如叶、花、果实、种子等都包含在这里所用的“植物”定义内。再生植物的后裔、变异体、突变体也包含在“植物”的定义内。

eIF-5A总述

本发明涉及三种不同亚型的eIF-5A：衰老-诱导eIF-5A、损伤-诱导eIF-5A、生长eIF-5A。本发明提供分离自不同种植物的eIF-5A不同亚型及其分离方法。本发明也提供了编码这些不同亚型的多核苷酸。本发明还提供了eIF-5A同工型的反义多核苷酸，以及包含这些多核苷酸和反义多核苷酸的表达载体。在一些实施方案中，提供通过使用包含eIF-5A同工型反义多核苷酸的表达载体转化植物以抑制内源eIF-5As表达的方法。在一些实施方案中，提供通过使用eIF-5A同工型正义多核苷酸来增量调节内源eIF-5A的方法。

自然状态下，不同eIF-5A同工型根据植物生命阶段或外部条件进行增量或减量调节。如在衰老组织中，衰老-诱导eIF-5A受到增量调节。衰老-诱导eIF-5A被认为通过将特定种类的mRNAs(涉及衰老途径)穿梭运出胞核到胞质内进行翻译从而参与植株或植物组织的进一步衰老。当减量调节或抑制衰老-诱导eIF-5A表达时，植株和/或组织的衰老被推迟。转化/转基因植物具有更大生物量产出、延长的果实贮藏时间、延长的花贮藏时间、种子变大、种子产量提高，证明了它们的衰老推迟。

当植株和/或植物组织被暴露于损伤事件如低温、脱水或机械损伤时，损伤-诱导eIF-5A受到增量调节。通过减量调节损伤-诱导eIF-5A，与未转化株或野生型株相比，转基因株有更强的对病原体入侵引起的致命损害的抵御能力。

当植株处于生长期，生长eIF-5A受到增量调节。通过增量调节生长eIF-5A，使得转基因株有更大的种子、更高的生物量产出及种子产量。

图1显示了分离自拟南芥(“AT”)的三种eIF-5A同工型的对比。图2显示了这些同工型编码区域的对比。图3-5提供了这些同工型的基因组序列。

蛋白质杂交印迹(见图8)显示这三种同工型在植物体生命不同阶段的表达。图8揭示当叶龄增长，衰老-诱导eIF-5A含量增加。而其在未开放花蕾、长角果或茎芽中观察不到，但在吸涨(imbibed)种子中可观察到。在吸涨种子中，有子叶组织和发育中的胚胎。因此衰老-诱导eIF-5A在吸涨种子里存在是由于当胚胎发育时子叶正在衰老。生长eIF-5A存在于吸涨种子的原因在于胚胎在活跃生长。损伤-诱导eIF-5A存在于长角果、种子、茎中的原因是采集这些部位时引起了损伤。

尽管不同同工型间和来自不同种植物的同工型间有高度同源性(约85％)，但不同同工型的3’UTR区域不同。同工型间和不同种植物同工型间的一个高度保守区域确信为羟丁赖氨酸位点。羟丁赖氨酸位点确信为以下氨基酸：5’-CKVVEVSTSKTGKHGHAKCHFV-3’(SEQ ID NO：＿)。图85显示不同eIF-5A同工型和几种植物的对比。

衰老-诱导eIF-5A

衰老-诱导eIF-5A在衰老组织中表达。本发明涉及到在拟南芥、番茄和康乃馨中发现衰老-诱导eIF-5A。衰老-诱导eIF-5A在衰老组织中受增量调节，并且在植物和植物组织中涉及与形态变化相关的衰老诱导。抑制衰老-诱导eIF-5A在植株中的表达可改变衰老和衰老相关过程。可通过使用反义构建体或使用正义构建体以引起共抑制来进行减量调节。在转基因植物中抑制衰老-诱导eIF-5A引起不同形态学变化，包括生物量提高、果实变软或坏死推迟、花切片或植物组织如莴苣叶切段的褐变推迟、种子变大和种子产量提高。

因此，本发明的一个实施方案是从拟南芥分离的衰老-诱导eIF-5A。氨基酸序列见图59，(SEQ ID NO：＿)。其编码该氨基酸的核苷酸序列见图59，(SEQ ID NO：＿)。

另一实施方案是从番茄分离的衰老-诱导eIF-5A。氨基酸序列见图57和86，(SEQ ID NO：＿)。其编码该氨基酸的核苷酸序列见图57和86，(SEQ ID NO：＿)。

还有一实施方案是从康乃馨分离的衰老-诱导eIF-5A。氨基酸序列见图58，(SEQ ID NO：＿)。其编码该氨基酸的核苷酸序列见图58，(SEQ ID NO：＿)。

本发明也提供分离的衰老-诱导eIF-5A多核苷酸，其与上述列举的衰老-诱导eIF-5A编码多核苷酸有90％同源性，并可在严格条件下与这些多核苷酸的互补序列或与其它编码衰老-诱导eIF-5A的多核苷酸进行杂交。

本发明也提供衰老-诱导eIF-5A的反义多核苷酸。这种反义多核苷酸可以为任何长度，只要它能够抑制表达。在一些实施方案中，所用的反义多核苷酸包括全长编码区，在另一些尤其优选的实施方案里，反义多核苷酸定位在3’UTR，因为不同的eIF-5A同工型在3’UTR有高度的差异。在一些实施方案里，反义多核苷酸会定位至5’非编码区。已知与5’非编码区基本互补的反义多核苷酸是转录因子编码基因表达的有效抑制剂。Branch，M.A.，Molec.Cell Biol.，13：4284-4290(1993)。

这里及权利要求书所用的术语“衰老-诱导eIF-5A反义多核苷酸”不仅包括与上文所列举多核苷酸的互补序列有100％同源性的反义多核苷酸，也包括那些反义多核苷酸功能变异体。功能变异体，不管来自天然或人工制备，与衰老-诱导eIF-5A相应部分至少有80％的同源性并且可在高度严格条件下与相应部分发生杂交。此外，变异体必须具有本发明需要的功能，也就是说，当将它们引入一个表达载体并且此载体被整合到至少一个植物细胞的基因组时，变异体能够调节内源衰老-诱导eIF-5A的表达。本领域技术人员可利用这一特点，即在反义多核苷酸中进行非实质改变不会对反义多核苷酸结合至转录物并减少或抑制基因表达的能力产生有害的影响。因此，术语“反义多核苷酸”包括那些与转录物基本互补的序列和那些仍可特异结合转录物并抑制或减少基因表达的能力的反义序列。反义多核苷酸综述见，Alberts，et al.，Molecular Biology of the Cell，2nd ed，Garland PubIishing，Inc.New York，1989(尤其是195-196页，通过引用结合至本文)。

本发明的一个实施方案提供包含衰老-诱导eIF-5A多核苷酸(本发明中如上述)或衰老-诱导eIF-5A反义多核苷酸(本发明中如上述)的表达载体。载体可以是质粒(优选)，或是病毒，或者是本领域内已知的用以在植物细胞或细菌细胞中复制并表达其上编码基因的其它载体。载体被整合至染色体上，使得它可以被转录出所需的衰老-诱导eIF-5ARNA的反义多核苷酸。可用本领域的标准方法，重组DNA技术来构建这样的质粒或病毒载体。例如，载体可以是含有可在原核宿主中发挥功能的复制系统和本发明的反义多核苷酸的质粒。或者，载体可以是含有可在土壤杆菌(Agrobacterium)中发挥功能的复制系统和本发明中的反义多核苷酸的质粒。可在土壤杆菌中复制的质粒在本领域内已得到充分认识。参见Miki，et al.，Procedures forIntroducing Foreign DNA Into Plants，Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology，Eds.B.R.Glick and J.E.Thompson.CRCPress(1993)，PP.67-63。

此外载体包含有效连于所述多核苷酸的调节序列，以允许多核苷酸的表达。调节序列可包括在转基因植物细胞中作用的启动子。启动子可以是诱导型、组成型或组织特异型。本领域技术人员了解这些启动子。

可有效与本发明的不同eIF-5A同工型和DHS组合并产生该基因的正义或反义转录物的启动子调节元件总体上包括任何植物启动子，更详细的讲，包括组成性启动子如无花果瘤镶嵌病毒35S启动子、花椰菜镶嵌病毒35S启动子、CaMV35S启动子、MAS启动子，或组织特异性的或衰老-诱导启动子，如康乃馨花瓣GST1启动子或拟南芥SAG12启动子(参见如J.C.Palaqui等Plant Physiol.，112：1447-1456(1996)；Morton等Molecular Breeding.1：123-132(1995)；Fobert等Plant Journal，6：567-577(1994)；Gan等Plant Physiol.，113：313(1997)，均通过引用结合到本文)。优选在本发明使用组成型启动子。当使用衰老-诱导eIF-5A反义多核苷酸时优选使用SAG12启动子，见实施例23。

本发明中的有效启动子的表达水平可使用常规表达系统来测量，例如通过测量报告基因的产物量，如测量导入了启动子/报告基因的转基因植物的花、叶、果实和其它组织细胞提取物中相应蛋白或mRNA的含量。典型报告基因例如GUS。

调节序列可任意包含5’非翻译前导序列或多聚腺嘌呤信号或增强子。此外本发明也考虑了为本领域技术人员所知的其它调节序列。

本发明也提供经包含衰老-诱导eIF-5A正义或反义多核苷酸的载体或组合载体转化的转基因植物细胞、产生自这种细胞的转基因苗或成熟的转基因植株或转基因植物的部分如花、果实、叶、种子等。

本发明还提供抑制内源衰老-诱导eIF-5A表达的方法。包括将本发明中包含衰老-诱导eIF-5A反义多核苷酸的表达载体整合进植株的至少一个细胞的基因组内。该反义多核苷酸被转录并抑制内源衰老-诱导eIF-5A的表达。

在另一种抑制内源衰老-诱导eIF-5A表达的方法里，包含本发明中衰老-诱导eIF-5A正义多核苷酸的表达载体被整合进植株的至少一个细胞的基因组内。该正义多核苷酸被转录并引起外源衰老-诱导eIF-5A共表达，从而减量调节或抑制内源衰老-诱导eIF-5A的表达。

损伤-诱导eIF-5A

损伤-诱导eIF-5A在损伤组织里表达。本发明涉及在拟南芥和番茄中对损伤-诱导eIF-5A的发现。本发明发现这种同工型在植物受损伤时受增量调节。增量调节发生在转录水平。此外，发生致病感染后，它只在蛋白水平受到增量调节，引起细胞死亡，因而推论损伤-诱导eIF-5A在病原体入侵事件中驱动细胞死亡。图9显示衰老-诱导eIF-5A在对照植株、模拟处理(mock treatment)株、Avr处理株和Vir处理株内的含量保持恒定(在植株4周龄时检测得到)。而损伤-诱导eIF-5A在Vir处理株里受到增量调节。

图10显示一个用止血钳损伤叶子的实验结果。分别在损伤后立即、1h、9h测量衰老-诱导eIF-5A、损伤-诱导eIF-5A、生长eIF-5A的含量水平。RNA杂交印迹分析显示衰老-诱导eIF-5A含量不变，但损伤-诱导eIF-5A含量显著上升。生长eIF-5A的含量水平在损伤事件里开始下降。

本发明证实当损伤-诱导eIF-5A受到增量调节同时植株遭损伤时(如移植幼苗)这个损伤会引起对生长eIF-5A表达的非常强的抑制。见图14-17。结果植株生长受到强烈阻碍。但是当用卡那霉素浸泡种子并直接播种于土壤(无需移植因而无移植损伤)，种子会长成正常大小的植株。

均有正义损伤-诱导eIF-5A构建体整合入的不同试验株间的差异(图15)是由于损伤-诱导eIF-5A表达水平不同引起的。当引入一个基因(正义或反义)时可得到不同程度的增量调节或减量调节，本领域技术人员可利用这一特性。差异的程度取决于基因的整合位置与整合拷贝数。通过表达水平差异可将不同表型与基因表达关联起来。一旦所需表型产生，即可选出该植株并用来产生所需后代。因而在图15中，对损伤-诱导eIF-5A实施强增量调节的植株在受损伤后几乎不生长(标签10-株)，而生长稍好的植株(但也不如野生型株)(标签4-株)的增量调节强度逊于前者。

本发明的一个实施方案是从拟南芥分离的损伤-诱导eIF-5A。氨基酸序列见图41(SEQ ID NO：＿)，编码该氨基酸的核苷酸序列见图41(SEQ ID NO：＿)。

本发明的另一实施方案是从番茄分离的损伤-诱导eIF-5A。氨基酸序列见图103(SEQ ID NO：＿)，编码该氨基酸的核苷酸序列见图103(SEQ ID NO：＿)。

本发明也提供分离的损伤-诱导eIF-5A多核苷酸，具有与上述列举多核苷酸序列90％的同源性，可在严格条件下与所列举多核苷酸的互补序列或其它编码损伤-诱导eIF-5A的序列进行杂交。

本发明还提供损伤-诱导eIF-5A的反义多核苷酸。这种反义多核苷酸可以为任何长度，只要它能够抑制表达。在一些实施方案中，所用的反义多核苷酸包括全长编码区，在另一些更优选的实施方案里，定位至3’UTR，因为不同的eIF-5A同工型在3’UTR有更高程度的差异。在一些实施方案里，反义多核苷酸定位至5’非编码区。已知与5’非编码区基本互补的反义多核苷酸是转录因子编码基因表达的有效抑制剂。Branch，M.A.，Molec.Cell Biol.，13：4284-4290(1993).

这里及权利要求书所用的术语“损伤-诱导eIF-5A反义多核苷酸”不仅包括与上文所列举多核苷酸的互补序列有100％同源性的反义多核苷酸，也包括那些反义多核苷酸功能变异体。功能变异体如上文描述。变异体发挥本发明预期的功能，也就是当其被导入一个表达载体并且此载体被整合到至少一个植物细胞的基因组内时，变异体可调节内源损伤-诱导eIF-5A的表达。

本发明的一个实施方案提供了一个表达载体，包含本发明中如上描述的损伤-诱导eIF-5A多核苷酸或本发明中如上描述的损伤-诱导eIF-5A反义多核苷酸。载体同上文描述。

本发明也提供经包含损伤-诱导eIF-5A正义或反义多核苷酸的载体或组合载体转化的转基因植物细胞、产生自这种细胞的转基因苗或成熟的转基因植株或转基因植物的部分如花、果实、叶、种子等。

本发明还提供抑制内源损伤-诱导eIF-5A表达的方法。包括将本发明的包含损伤-诱导eIF-5A反义多核苷酸的表达载体整合进植株的至少一个细胞的基因组内。该反义多核苷酸被转录并抑制内源损伤-诱导eIF-5A的表达。

在另一种抑制内源损伤-诱导eIF-5A表达方法里，含本发明的损伤-诱导eIF-5A正义多核苷酸的表达载体被整合进植株的至少一个细胞的基因组内。该正义多核苷酸被转录并引起外源损伤-诱导eIF-5A基因的表达，从而导致减量调节或抑制内源损伤-诱导eIF-5A的表达。

通过抑制内源损伤-诱导eIF-5A的表达，使所得的转基因植株具有更强的抵御病原体引起的致命损害的能力。见实施例16和图43，44。

生长eIF-5A

本发明也涉及生长eIF-5A。生长eIF-5A在生长组织中表达。当用生长eIF-5A正义多核苷酸增量调节生长eIF-5A时，注意到三种表型改变：种子变大、产量提高、生物量提高。

本发明的一个实施方案是从拟南芥分离生长eIF-5A。氨基酸序列见图1(SEQ ID NO：＿)，编码该氨基酸的核苷酸见图2(SEQ IDNO：＿)。

本发明的另一个实施方案是从番茄分离的生长eIF-5A。氨基酸序列见图101(SEQIDNO：＿)，编码该氨基酸的核苷酸见图101(SEQID NO：＿)。

本发明的再一个实施方案是从油菜分离的生长eIF-5A。氨基酸序列见图95(SEQ ID NO：＿)，编码该氨基酸的核苷酸见图95(SEQ IDNO：＿)。

本发明也提供分离的生长eIF-5A多核苷酸，具有与上述列举多核苷酸序列90％的同源性，可在严格条件下与所列举多核苷酸的互补序列或其它编码生长eIF-5A的序列进行杂交。

本发明也提供生长eIF-5A的反义多核苷酸。这种反义多核苷酸可以为任何长度，只要它能够抑制表达。在一些实施方案中，所用的反义多核苷酸包括全长编码区，在另一些更优选的实施方案里，反义多核苷酸定位至3’UTR，因为不同的eIF-5A同工型在3’UTR有更高程度的差异。在一些实施方案里，反义多核苷酸会定位至5’非编码区。已知与5’非编码区基本互补的反义多核苷酸是转录因子编码基因表达的有效抑制剂。Branch，M.A.，Molec.Cell Biol.，13：4284-4290(1993).

这里及权利要求书所用的“生长eIF-5A反义多核苷酸”不仅包括与上文所列举多核苷酸的互补序列有100％同源性的反义多核苷酸，也包括那些反义多核苷酸功能变异体。功能变异体如上文描述。变异体发挥本发明预期的功能，也就是当其被导入一个表达载体并且此载体被整合到至少一个植物细胞的基因组内时，变异体可调节内源生长eIF-5A的表达。

本发明的一个实施方案提供了一个表达载体，包含本发明的生长eIF-5A多核苷酸或本发明的如上描述的生长eIF-5A反义多核苷酸。载体同上文描述。

本发明也提供经包含生长eIF-5A正义或反义多核苷酸的载体或组合载体转化的转基因植物细胞、产生自这种细胞的转基因苗或成熟的转基因植株或转基因植物的部分如花、果实、叶、种子等。

本发明还提供抑制内源生长eIF-5A表达的方法。包括将本发明的包含损伤-诱导eIF-5A反义多核苷酸的表达载体整合进植株的至少一个细胞的基因组内。该反义多核苷酸被转录并抑制内源生长eIF-5A的表达。

在另一种抑制内源生长eIF-5A表达方法里，含本发明的生长eIF-5A正义多核苷酸的表达载体被整合进植株的至少一个细胞的基因组内。该正义多核苷酸被转录并引起外源生长eIF-5A基因的表达，从而导致减量调节或抑制内源生长eIF-5A的表达。

本发明的另一实施方案提供了增量调节生长eIF-5A的方法。包含本发明的生长eIF-5A正义多核苷酸的表达载体整合进植株的至少一个细胞的基因组内。该正义多核苷酸被转录并引起外源生长eIF-5A基因的共表达，从而使细胞表达比非转基因细胞更多的生长eIF-5A。

图19显示生长eIF-5A受增量调节的植物比对照植株有更高的生物量。生长eIF-5A按正义方向被插入拟南芥植株以增量调节生长eIF-5A表达。测定了16个母品系(1-16)以确定生长eIF-5A表达的一般水平。每个母品系产生8个子品系(A-H)。测量每个母品系的生长eIF-5A表达水平，结果见图20。注意到由始至终母品系的表达水平差异。例如，品系2和10有很高的表达水平而品系11和16则很低或不表达。

图21和22显示来自品系1和2的植株。这些植株大于对照株。因为生长eIF-5A是一个细胞分裂同工型而且因为它是组成型表达，细胞分裂作用增强。衰老减弱的出现是因为植物被固定于生长模式并且不能转换到衰老途径。

图23和24为来自生长eIF-5A表达水平中等的品系植株。它们显示有更大的叶和衰老推迟。

图25和26为来自低水平增量调节的品系。它们有大的叶子和大的莲座。

图27和28为来自无增量调节(可能由于基因共抑制)的品系植株。因为植株有卡那霉素抗性，所以抗性基因肯定存在以使植株在培养基上生长。衰老-诱导eIF-5A也被共抑制，因此引起植株变大。

除了生物量增加，增量调节生长eIF-5A的植株种子变大。所有品系的种子大小均被测量。可观察到生长eIF-5A表达水平最高的品系种子变大了3倍以上。这是因为生长eIF-5A受到增量调节，增强细胞分裂作用，因而使种子变大。

在以上例子中生长eIF-5A(来自拟南芥)被组成型表达，也就是通过使用一个通用启动子使它在植株的所有部位均表达。相反，通过使用一个组织特异启动子，可使增量调节在特定组织里进行。例如，通过使用种子特异启动子，生长eIF-5A仅在种子中受增量调节，这样允许叶子正常生长而种子产量提高。因此，使用一个特异启动子，生长eIF-5A可在所需植株部位受增量调节，以得到一个所需表型。

通过增量调节生长eIF-5A所得的三种表型——生物量提高、种子变大和产量提高，不会同时出现(或表现在同一植株内)。例如，如果一个植株表现出种子变大，那么就会出现较小的植株。生长eIF-5A表达水平最高的品系产生最大的种子，但植株较小，因为遍及整个植株的大量细胞分裂是在损害细胞变大的情况下(需要更大的叶)进行的。在较低的生长eIF-5A表达水平，可观察到影响叶(变大)但不影响种子。因此可使用组织特异表达并选取所需表型。例如，可将生长eIF-5A基因置于木质部特异启动子控制下以获得更高的木质部产量。这样，可用任何所需启动子来获得所需组织特异型的增量调节。

DHS

激活eIF-5A必须有DHS参与，DHS在衰老组织中表达。因而本发明提供了分离自拟南芥、番茄、康乃馨、油菜、莴苣、苜蓿、香蕉、三角叶杨和球腔菌(mycosphaerella)的DHS。

因此本发明的一个实施方案为分离自拟南芥的DHS。氨基酸序列见图46(SEQ ID NO：＿)，编码该氨基酸的核苷酸序列见图46(SEQID NO：＿)。

另一个实施方案为分离自番茄的DHS。氨基酸序列见图45A和B(SEQ ID NO：＿），编码该氨基酸的核苷酸序列见图45A和B(SEQ IDNO：＿)。

另一个实施方案为分离自康乃馨的DHS。氨基酸序列见图54(SEQ ID NO：＿)，编码该氨基酸的核苷酸序列见图54(SEQ IDNO：＿)。

另一个实施方案为分离自油菜的DHS。氨基酸序列见图97(SEQID NO：＿)，编码该氨基酸的核苷酸序列见图97(SEQ ID NO：＿)。

另一个实施方案为分离自莴苣的DHS。图105为莴苣DHS编码多核苷酸的部分序列。

另一个实施方案为分离自苜蓿的DHS。氨基酸序列见图107A和B(SEQ ID NO：＿)，编码该氨基酸的核苷酸序列见图107A和B(SEQID NO：＿)。

另一个实施方案为分离自香蕉的DHS。氨基酸序列见图108A和B(SEQ ID NO：＿），编码该氨基酸的核苷酸序列见图108A和B(SEQID NO：＿)。

另一个实施方案为分离自三角叶杨的DHS。氨基酸序列见图109A和B(SEQ ID NO：＿)，编码该氨基酸的核苷酸序列见图109A和B(SEQ ID NO：＿)。

另一个实施方案为分离自球腔菌的DHS。图110为球腔菌DHS编码多核苷酸的部分序列。

本发明也提供了分离的DHS多核苷酸，其与上文列举的多核苷酸有90％同源性，并能在高度严格条件下与所列举多核苷酸的互补序列或与其它编码DHS的多核苷酸进行杂交。

本发明还提供了DHS的反义多核苷酸。该反义多核苷酸可为任意长度，只要能够抑制基因表达。在一些实施方案中，反义多核苷酸包含全长编码序列，可定位到3’UTR或5’非编码序列。已知与5’非编码序列基本互补的反义多核苷酸是转录因子编码基因的有效表达抑制剂。Branch，M.A.，Molec.Cell Biol.，13：4284-4290(1993).

这里及权利要求书所用的术语“DHS反义多核苷酸”不仅包括与上文所列举多核苷酸的互补序列有100％同源性的反义多核苷酸，也包括那些反义多核苷酸功能变异体。功能变异体如上文描述。变异体发挥本发明预期的功能，也就是当其被导入一个表达载体并且此载体被整合到至少一个植物细胞的基因组内时，变异体可调节内源DHS的表达。

本发明的一个实施方案提供了一个表达载体，包含DHS多核苷酸(本发明中如上描述的)或DHS反义多核苷酸(本发明中如上描述的)。载体同上文描述。

本发明还提供经包含DHS正义或反义多核苷酸的载体或组合载体转化的转基因植物细胞、产生自这种细胞的转基因苗或成熟的转基因植株或转基因植物的部分如花、果实、叶、种子等。

本发明也提供抑制内源DHS表达的方法。包括将本发明包含DHS反义多核苷酸的表达载体整合进植株的至少一个细胞的基因组内。该反义多核苷酸被转录并抑制内源DHS的表达。

在另一种抑制内源DHS表达方法里，含本发明的DHS正义多核苷酸的表达载体被整合进植株的至少一个细胞的基因组内。该正义多核苷酸被转录并引起外源DHS基因的共表达，从而导致减量调节或抑制内源DHS的表达。

通过抑制内源DHS的表达，所得转基因植株将缺失或显著减少用以活化eIF-5A的DHS。如前文讨论，eIF-5A必须经活化方具有生物活性。因而，通过反义多核苷酸，或正义多核苷酸的共抑制来抑制或减少DHS的表达，所得转基因株将缺失活性eIF-5A或只有减活的eIF-5A。这些转基因株将表现出生物量的提高、种子变大和/或产量提高。包含DHS反义多核苷酸的转基因株表现出更强的光合作用和更高的淀粉含量。见实施例24和25。

使用DHS特异抑制剂处理康乃馨的实验是进一步的证据，支持了DHS和eIF-5A调节衰老的论点。亚精胺和eIF-5A是DHS的底物(Park等1993；Park等1997)。一些结构特征与亚精胺相似的单胺、二胺或多胺在体外抑制DHS的活性(Jakus等1993)。一些多胺，如亚精胺、腐胺、精胺，已被广泛用来延长康乃馨的花瓶保鲜时间(vaselife)(Wang和Baker，1980)。通过使用不同浓度的不同多胺，Wang等(unpublished b)成功的将康乃馨的花瓶保鲜时间延长了两倍。使用瞬时感染系统来减量调节DHS的进一步研究正在进行。初步的数据显示，用真空渗入瞬时感染可表达反义DHS的系统处理后，康乃馨花在切下后第8天的存活率高于未处理花4倍(Wang等unpublishedb)。

农业上农作物损失除了由于生长过程中压力造成以外，另一主要损失来自收割后的环境压力诱导的衰老(McCabe等2001)。这一点在部分收割植物上表现得尤为明显，如收割后的莴苣。提示收割莴苣的信号之一为褐变，这是由酚类产物引起的(Matile等1999)。具有莴苣eIF-5A(LeIF-5A)反义多核苷酸或DHS全长反义多核苷酸的转基因莴苣的田间实验表明，转基因莴苣收割后的抗褐变能力明显强于对照组。实验表明即使由于收割引起的压力诱导的衰老有不同的作用途径(Page等2001)，褐变的翻译上游控制和其它可能的衰老信号，至少在部分上被DHS和eIF-5A所调节。衰老的下游调节由执行基因进行，这些基因能够影响衰老并引起代谢变化，产生衰老信号。当eIF-5A和DHS受到减量调节，能负作用于衰老引起的所有信号。

本发明也涉及识别这三种eIF-5A同工型的抗体，即衰老-诱导因子eIF-5A、损伤-诱导因子eIF-5A和生长因子eIF-5A。

本发明也提供了在其它植物和真菌内鉴别衰老-诱导eIF-5A、损伤-诱导eIF-5A、生长eIF-5A或DHS的方法。通过使用这里的方法和提供的序列，来设计用以分离/鉴别所需同工型或DHS的探针。因为eIF-5A同工型(衰老-诱导eIF-5A、损伤-诱导eIF-5A和生长eIF-5A)通常在编码区有高度同源性(见图2)，为确保鉴定甚至改变所需同工型的扩增，优选自5’UTR的开始序列和3’UTR末端序列(见图3，4和5)设计探针或引物。优选的一组用以扩增损伤-诱导eIF-5A基因或鉴别损伤-诱导eIF-5A的探针的引物序列如下。下游引物5’GAGCTCAAGAATAACATCTCATAAGAAAC3’(SEQ IDNO：＿)，上游引物5’CTCGAGTGCTCACTTCTCTCTCTTAGG3’(SEQ ID NO：＿)。

在从植株或植株某部分分离损伤-诱导eIF-5A前，最好对其进行损伤处理以使该植株开始表达损伤-诱导eIF-5A。任何损伤事件均可接受，这种典型的损伤事件包括将叶片沿中央叶脉压碎。类似的在分离衰老-诱导eIF-5A以前，最好对其实施压力以诱导衰老。

至此已对本发明进行了广泛的描述，通过参考以下实施例将能更易于理解本发明，举出下列实施例的目的是为了说明本发明而不是对本发明进行限定。

                       实施例

实施例1

信使RNA(mRNA)的分离

从番茄处于不同发育阶段的花和果实中分离出总RNA，也从叶中(未处理或低温处理或山梨醇处理)分离总RNA。取5g组织在液氮中快速磨碎。然后将研磨粉末与30ml胍缓冲液(4M异硫氰酸胍，2.5mM NaOAc，PH8.5，0.8％□-巯基乙醇)混合。用四层干酪包布(cheesecloth)过滤混合物后于4℃，10,000×g离心30min。取上清液进行氯化铯密度梯度离心，26,000×g离心20h。用75％乙醇清洗RNA沉淀后用600μlDEPC处理过的水重悬浮，然后加入0.75ml 95％乙醇和30μl 3M NaOAc，于-70℃沉淀RNA。取10μgRNA在1.2％甲醛变性琼脂糖凝胶上电泳，然后转移到尼龙膜上。用通过随机引物获得的并用³²P-dCTP标记的全长DHS cDNA(SEQ ID NO：1)为探针与尼龙膜在42℃下温育过夜。然后用含0.1％SDS的1×SSC溶液室温下洗涤膜一次，15min，再用含0.1％SDS的0.2×SSC溶液65℃下洗膜三次，每次15min。随后将膜置于X射线胶片下，-70℃过夜。

用Promega公司的PolyA+tract mRNA分离系统从总RNA中分离出PolyA+mRNA。使用Stratagene(La Jolla，Calif)的ZAP ExpresscDNA合成系统，以PolyA+mRNA为模板合成cDNA。

番茄叶cDNA文库筛选

取Match F1杂交番茄株叶子，用2M山梨醇处理6h，从中分离得到的cDNA文库稀释至约5×10⁶PFU/ml。使用³²P标记的600bpRT-PCR片段对文库进行筛选。切下所得的三个阳性cDNA，并按照说明书将其整合到pBK-CMV噬菌体载体上(Stratagene)。全长cDNA被插入到pBK-CMV载体中。

质粒DNA分离和DNA测序

用Sanbrook等人(Supra)描述的碱裂解法分离质粒DNA。使用双脱氧法对全长阳性cDNA克隆进行测序(Sanger，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467.)。使用BLAST search对开放阅读框进行编辑和分析(GenBank，Bethesda MD)，并使用BCM searchlauncher多序列对比模式-诱导的多对比法(Multiple SequenceAlignments Pattern-Induced Multiple AligmentMethod)(见F.Corpet，Nuc.Acids Res.，16：10881-10890(1987))获得编码基因相应的氨基酸序列与五个同源性最高的蛋白序列间的对比。用MultipleFinder来鉴别所得氨基酸序列的功能基序。

番茄RNA的印迹杂交分析

从不同阶段的番茄花(花蕾、开花和完全开放或变干的衰老花瓣)、番茄叶子和不同成熟阶段的番茄果实(果实花端着色(breaker)，也就是绿果实只有不到10％为红色；粉红色，就是整个果实为橙色或粉红色；红色(硬或软))中分离得到总RNA，取10μg上述RNA在1％的变性甲醛琼脂糖凝胶上分离并固定于尼龙膜上。使用随机引物试剂盒(Boehringer Mannheim)标记³²P-dCTP得到的全长番茄cDNA被用作探针检测滤膜(7×10⁷cpm)。室温下，用1×SSC、0.1％SDS洗涤滤膜一次，65℃下用0.2×SSC、0.1％SDS洗涤滤膜三次。滤膜干燥后，置于X射线胶片下，-70℃过夜。所得结果见图50-52。

拟南芥RNA的RNA印迹杂交分析

同上文方法分别从5周龄(泳道1)、6周龄(泳道2)、7周龄(泳道3)的拟南芥叶中分离总RNA，在1％的变性甲醛琼脂糖凝胶上分离并固定于尼龙膜上。使用随机引物试剂盒(Boehringer Mannheim)标记³²P-dCTP得到的全长拟南芥衰老-诱导DHS cDNA被用作探针检测滤膜(7×10⁷cpm)。室温下，用1×SSC、0.1％SDS洗涤滤膜一次，65℃下用0.2×SSC、0.1％SDS洗涤滤膜三次。滤膜干燥后，置于X射线胶片下，-70℃过夜。所得结果见图55。

康乃馨RNA的RNA印迹杂交分析

同上文方法从康乃馨植株花的不同发育阶段的花瓣，即紧实花蕾(tight bud)(泳道1)、开始开放(beginning to open)(泳道2)、完全开放(fully open)(泳道3)、内卷花瓣(inrolling petals)(泳道4)中分离总RNA。使用随机引物试剂盒(Boehringer Mannheim)标记³²P-dCTP得到的全长康乃馨衰老-诱导DHS cDNA被用作探针检测滤膜(7×10⁷cpm)。室温下，用1×SSC、0.1％SDS洗涤滤膜一次，65℃下用0.2×SSC、0.1％SDS洗涤滤膜三次。滤膜干燥后，置于X射线胶片下，-70℃过夜。所得结果见图56。

实施例2

山梨醇诱导番茄衰老-诱导DHS基因

在密闭容器里用2M山梨醇处理番茄叶6h。按以下方法从山梨醇处理后的番茄叶中提取RNA。

取5g叶在液氮中磨碎。研磨粉末与30ml胍缓冲液(4M异硫氰酸胍、2.5mM NaOAc、0.8％□-巯基乙醇、PH8.5)混合。用四层干酪包布(cheesecloth)过滤混合物后于4℃，10,000×g离心30min。取上清液进行氯化铯密度梯度离心，26,000×g离心20h。用75％乙醇清洗RNA沉淀后用600μlDEPC处理过的水重悬浮，然后加入0.75ml95％乙醇和30μl 3MNaOAc，于-70℃沉淀RNA。取10gRNA在1.2％的变性甲醛琼脂糖凝胶上电泳分离，然后转移到尼龙膜上。用通过随机引物获得的并用³²P-dCTP标记的全长DHS cDNA(SEQ ID NO：1)为探针与尼龙膜在42℃下温育过夜。然后用含0.1％SDS的1×SSC溶液室温下洗涤膜一次，15min，再用含0.1％SDS的0.2×SSC溶液65℃下洗膜三次，每次15min。膜置于X射线胶片下，-70℃过夜。

结果见图52，可见山梨醇处理的叶细胞中DHS基因被诱导转录。

实施例3

番茄衰老花中的DHS基因的诱导

收获紧实花蕾和开放、衰老番茄花，并如实施例2提取RNA。取10μgRNA在1.2％的变性甲醛琼脂糖凝胶上电泳分离并转移至尼龙膜。用通过随机引物获得的并用³²P-dCTP标记的全长DHScDNA(SEQ ID NO：1)为探针与尼龙膜在42℃下温育过夜。用含0.1％SDS的1×SSC溶液室温下洗涤膜一次，15min，再用含0.1％SDS的0.2×SSC溶液65℃下洗膜三次，每次15min。膜置于X射线胶片下，-70℃下过夜。

结果见图50，可见在衰老花中DHS基因被诱导转录。

实施例4

番茄成熟过程中果实的DHS基因的诱导

如实施例2方法，从番茄的果实花端着色、粉红和成熟阶段果实中提取RNA。取10μgRNA在1.2％的变性甲醛琼脂糖凝胶上电泳分离并转移至尼龙膜。用通过随机引物获得的并用³²P-dCTP标记的全长DHS cDNA(SEQ ID NO：1)为探针与尼龙膜在42℃下温育过夜。然后用含0.1％SDS的1×SSC溶液室温下洗涤膜一次，15min，再用含0.1％SDS的0.2×SSC溶液65℃下洗膜三次，每次15min。膜置于X射线胶片下，-70℃下过夜。

结果见图51。可见红色成熟果实的DHS基因的转录作用是最强的，果实处于导致变质的衰老起始阶段前。

实施例5

低温诱导番茄的衰老-诱导DHS

种植于罐中的番茄植株(7-8周龄)在生长室中于6℃下暴露2天、3天或6天。光周期设置为8h黑暗和16h光照。将植株搬回温室以复温。未复温的植株则在搬离生长室后立即采摘。按下文方法从叶中提取RNA。

取5g叶在液氮中磨碎。研磨粉末与30ml胍缓冲液(4M异硫氰酸胍、2.5mM NaOAc、0.8％□-巯基乙醇、PH8.5)混合。用四层干酪包布(cheesecloth)过滤混合物后于4℃，10,000×g离心30min。取上清液进行氯化铯密度梯度离心，26,000×g离心20h。用75％乙醇清洗RNA沉淀后用600μlDEPC处理过的水重悬浮，然后加入0.75ml95％乙醇和30μl 3M NaOAc，于-70℃沉淀RNA。取10gRNA在1.2％的变性甲醛琼脂糖凝胶上电泳分离，然后转移到尼龙膜上。用通过随机引物获得的并用³²P-dCTP标记的全长DHS cDNA(SEQ ID NO：1)为探针与尼龙膜在42℃下温育过夜。然后用含0.1％SDS的1×SSC溶液室温下洗涤膜一次，15min，再用含0.1％SDS的0.2×SSC溶液65℃下洗膜三次，每次15min。膜置于X射线胶片下，-70℃过夜。

结果见图53。可见低温和复温过程可诱导叶中DHS基因的转录，并且增强的转录作用与低温造成的损伤相关，损伤程度以细胞膜泄漏程度衡量。

实施例6

使用基于未鉴定的拟南芥基因组序列的引物获得拟南芥PCR产物

使用一对根据拟南芥基因组序列设计的寡核苷酸引物，以拟南芥cDNA为模板得到部分长度的衰老-诱导DHS基因序列。5’引物长19mer，序列为：5’GGTGGTGTTGAGGAAGATC3’(SEQ ID NO：7)；3’引物长20mer，序列为：5’GGTGCACGCCCTGATGAAGC3’(SEQID NO：8)。用Expand High Fidelity PCR System(BoehringerMannheim)，以拟南芥衰老叶cDNA文库为模板进行聚合酶链式反应，反应条件如下。

反应液组成：

cDNA                                1μl(5×10⁷pfu)

dNTP(各10mM)                       1μl

MgCl₂(5mM)+10x缓冲液              5μl

引物1和2(各100μM)                 2μl

Expand High Fidelity DNA聚合酶     1.75U

反应体积                           50μl

反应参数：

94℃3min

94℃/1min，58℃/1min，72℃/2min，45个循环

72℃15min

实施例7

基因组DNA的分离和DNA杂交印迹分析

从番茄叶中提取基因组DNA。取10g叶组织，在液氮中磨成细粉。将25ml匀浆缓冲液(100mM Tris-HCl、100mM EDTA、250mMNaCl、1％肌氨酰、1％2-巯基乙醇、10μg/ml RNase、PH8.0)和12.5ml苯酚混合，将这37.5ml混合物预热至60℃后加到磨碎的组织中。振摇15min，加入12.5ml氯仿-异戊醇(24∶1)，再振摇15min。然后离心，所得水相用25ml苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)和氯仿-异戊醇(24∶1)再提取。室温下加入15ml异丙醇得到核酸沉淀。用1ml水重悬浮沉淀。

按下文用限制性内切酶消化基因组DNA：取10μg基因组DNA，40μl 10×反应缓冲液和100U限制性内切酶(XbaI、EcoRI、EcoRV或HinD III)，总反应体积400μl，反应5到6小时。混合物再用苯酚抽提并用乙沉淀。消化后的DNA用0.8％琼脂糖凝胶电泳，15V约15h。再将凝胶浸没于变性缓冲液(87.66g NaCl和20g NaOH/L)中，轻轻搅动30min。再用蒸馏水清洗，再浸没于中和缓冲液(87.66g NaCl和60.55g Tris-HCl pH7.5/L)中30min并轻轻搅动。DNA用毛细管印迹法转移到Hybond-N⁺带正电荷尼龙膜上。

用1×10⁶cpm/ml ³²P-dCTP标记的全长DHS cDNA或DHS cDNA3’-非编码区序列进行杂交，42℃反应过夜。在含有50％甲酰胺、6×SSC、5×Denhardt’s溶液、0.1％SDS和100mg/ml变性鲑鱼精子DNA的缓冲液中进行预杂交和杂交。膜预杂交2到4小时，杂交反应过夜。

杂交完成后，室温下用2×SSC和0.1％SDS漂洗，再用2×SSC和0.1％SDS冲洗15min，0.2×SSC和0.1％SDS冲洗15min。膜置于X射线胶片下-80℃过夜。结果见图49。

实施例8

拟南芥衰老-诱导基因的分离

以拟南芥衰老中叶子的cDNA文库为模板进行PCR得到一个在拟南芥叶中表达的衰老-诱导基因全长cDNA克隆。最初，相应于该基因5’和3’的PCR产物通过使用以下引物获得：简并上游引物<AAARRYCGMCCYTGCAAGGT>(SEQ ID NO：17)与T7载体引物<AATACGACTCACTATAG>(SEQ ID NO：18)配对，简并下游引物<TCYTTNCCYTCMKCTAAHCC>(SEQ ID NO：19)与T3载体引物<ATTAACCCTCACTAAAG>(SEQ ID NO：20)配对。PCR产物亚克隆至pBluescript上测序。然后用5’特异引物<CTGTTACCAAAAAATCTGTACC>(SEQ ID NO：21)和配对的3’特异引物<AGAAGAAAGTATAAAAACCAT>(SEQ ID NO：22)得到全长cDNA，并亚克隆至pBluescript上测序。

实施例9

番茄果实衰老-诱导eIF-5A基因的分离

以番茄果实cDNA文库为模板PCR得到在番茄果实中表达的衰老-诱导基因全长cDNA克隆。最初，相应于该基因5’和3’端的PCR产物通过使用以下引物获得：简并上游引物(SEQ ID NO：17)与T7载体引物SEQ ID NO：18)配对，简并下游引物(SEQ ID NO：19)与T3载体引物(SEQ ID NO：20)配对。PCR产物亚克隆至pBluescript上测序。然后使用5’特异引物<AAAGAATCCTAGAGAGAGAAAGG>(SEQ ID NO：23)和T7载体引物(SEQ ID NO：18)得到全长cDNA，并亚克隆至pBluescript上测序。

实施例10

康乃馨衰老-诱导eIF-5A基因的分离

以康乃馨处于衰老中的花的cDNA为模板得到在处于衰老中的康乃馨花中表达的衰老-诱导基因全长cDNA克隆。最初，相应于该基因5’和3’的PCR产物通过使用以下引物获得：简并上游引物(SEQID NO：17)与T7载体引物(SEQ ID NO：18)配对，简并下游引物(SEQID NO：19)与T3载体引物(SEQ ID NO：20)配对。PCR产物亚克隆至pBluescript上测序。然后用5’特异引物<TTTTACATCAATCGAAAA>(SEQ ID NO：24)和配对的3’特异引物<ACCAAAAACCTGTGTTATAACT>(SEQ ID NO：25)得到全长cDNA，并亚克隆至pBluescript上测序。

实施例11

拟南芥衰老-诱导基因的分离

在拟南芥衰老中叶子的cDNA文库中筛选得到在拟南芥叶子里表达的衰老-诱导基因全长cDNA克隆。用以筛选的探针序列(SEQ IDNO：26)见图82。该探针是通过以衰老叶cDNA文库为模板，通过Genbank中未鉴定序列(AB017060)所设计的引物进行PCR获得的。PCR产物亚克隆至pBluescript上测序。

实施例12

康乃馨衰老-诱导DHS基因的分离

在康乃馨衰老中花瓣cDNA文库中筛选得到在康乃馨花瓣里表达的衰老-诱导DHS基因全长cDNA。用以筛选的探针序列(SEQ IDNO：27)见图83。该探针是以衰老花瓣cDNA文库为模板和简并引物(上游：5’TTGARGAAGATYMAARTGCCT3’)(SEQ ID NO：28)；下游：(5’CCATCAAAYTCYTGKGCRTT3’)(SEQ ID NO：29)进行PCR获得的。PCR产物亚克隆至pBluescript上测序。

实施例13

以拟南芥DHS基因全长或3’区域的反义多核苷酸转化拟南芥

用二元载体pKYLX71转化土壤杆菌，载体含有拟南芥衰老-诱导DHS基因(SEQ ID NO：30，图80)全长或3’区域的多核苷酸且均表达为反义构型，并处于双35S启动子的调节之下。转化后的土壤杆菌以真空渗入法转化拟南芥植株，用氨苄青霉素选择所得T0株的转化种子。

图65-68为转化的拟南芥株照片，显示DHS基因或其3’末端的反义方向表达导致了生物量提高，如叶子变大和植株变大。图69说明转基因拟南芥株的种子产量提高。

实施例14

以番茄DHS基因全长或3’区域的反义多核苷酸转化番茄

用二元载体pKYLX71转化土壤杆菌，载体含有番茄衰老-诱导DHS基因(SEQ ID NO：31，图81)全长或3’区域的多核苷酸且均表达为反义构型，并处于双35S启动子的调节之下。用这些转化的土壤杆菌构建番茄叶移植体，产生转化的愈伤组织和幼苗并以标准组织培养方法进行选择。在温室中种植转化幼苗以获得成熟的产果实T1株。

图70-79的照片显示转化株中番茄衰老-诱导DHS基因表达的减少引起了生物量提高，如叶子变大和植株变大，如同转化拟南芥株所表现的一样，同时也观察到番茄果实软化和坏死的推迟。

实施例15

用番茄DHS基因3’区域的反义多核苷酸转化番茄植株

以二元载体pKYLX71转化土壤杆菌，载体包含DHS基因(图81)的3’末端多核苷酸且表达为反义构型，并处于双35S启动子控制之下。用这些转化的土壤杆菌构建番茄叶移植体，产生转化的愈伤组织和幼苗并以标准组织培养方法进行选择。在温室中种植转化幼苗以获得成熟的产果实T₁株。

这些DHS表达减少的转基因株的果实完全没有花蒂腐现象(blossom end rot)，而相同条件下的对照株果实中有约33％发病。花蒂腐是一种生理疾病，是由于营养压力引起果实底端(花的末端)的衰老和腐烂。图84A和B的照片显示了对照株果实的花蒂腐和转基因株果实的正常。

实施例16

拟南芥翻译起始因子5A(AteIF-5A)同工型在野生型哥伦比亚生态型-植物材料中的表达

将拟南芥哥伦比亚生态型株的种子种植于盛有Promix BX土壤(Premier Brands，Brampton，ON，Canada)的6英寸罐中。新播种的罐于4℃保持2天，然后转移至生长室中22℃下16h光照/8h黑暗的光周期。使用冷-白荧光灯泡提供光强为150μmol m^-2·s^-1的光照。从2周龄到7周龄，间隔一周采集一次整个莲座，5周龄时采集茎生叶，6周龄时采集茎、长角果、花蕾和花，并采集吸涨种子(水中24h)，于液氮中速冻，保存于-80℃。

丁香假单孢菌(pseudomonas syringae)感染拟南芥株

将拟南芥哥伦比亚生态型株的种子播种到含64个生长单元(cell)的平台上，用Promix BX土壤(Premier Brands，Brampton，ON，Canada)培养。播种后的平台置于4℃保持2天后转移到生长室中，9h光照/15h黑暗的光周期。所有处理均在植株4周龄时进行，尽管生理上由于光照时间缩短导致这些植株生长缓慢。

用无致病力(avr)和有致病力(vir)的丁香假单孢菌番茄致病变种(Pseudomonas syringe pv.Tomato)DC3000(得自Robin Camer博士，University Of Toronto，Toronto，Canana)感染4周龄植株的莲座叶。用1ml无针头的注射器给每株的莲座叶的背轴面接种。参试株分成四组：无接种、模拟接种(用10mM MgCl₂)、无致病力丁香假单孢菌接种(10⁶cfu/ml，10mM MgCl₂)，有致病力丁香假单孢菌接种(10⁶cfu/ml，10mM MgCl₂)。进行两次细菌计数，一次于接种后立即进行，第二次于接种后3天进行，为确保在用无致病力菌株处理时有足够数量的细菌被导入以诱导组织获得抗性。在预先确定的时间点采集接种叶进行后续分析。

通过将DHS基因或损伤-诱导eIF-5A基因以反义方向插入T-DNA，发展了DHS或损伤-诱导eIF-5A表达减少的植株。这些品系表现出对丁香假单孢菌番茄致病变种(Pseudomonas syringe pv.Tomato)DC300的显著抗性，转基因株相对于野生型株的细菌载量呈现高至99％的下降。见图43和44。使用农作物得到的数据也显示其对病原的抗性提高。

用止血钳损伤拟南芥

根据Stotz等人(2000)所述，用止血钳将正常光照条件下生长的4周龄叶沿主叶脉夹伤(约损伤至叶面积的10％)。在0min、1h和9h时分别采集叶组织，并立即速冻于液氮中，-80℃保存以进一步分析。

RNA的分离和RNA印迹杂交分析

根据Davis等人所述(1986)从拟南芥的莲座叶中分离总RNA以进行杂交印迹分析。RNA在1％琼脂糖凝胶上电泳分离并转移到尼龙膜上(Davis et.al.，1986)。用放射性标记的衰老-诱导AteIF-5A、损伤-诱导AteIF-5A、生长AteIF-5A基因的3’UTR部分与固定的RNA在42℃下杂交过夜。这些3’UTR序列通过随机引物试剂盒(BoehringerMannheim)标记上[α-³²P]-dCTP。杂交后的膜用含0.1％SDS的2×SSC42℃洗涤2次每次15min，再用含0.1％SDS的1×SSC 42℃洗涤2次每次30min。-80℃下放射自显影过夜可见杂交。

抗体的生产和纯化

拟南芥(AT)的真核翻译起始因子5A(eIF-5A)同工型在氨基酸水平上具有高度同源性，尤其是在蛋白的N末端区域和中央区域(图1)。为了获得特异的同工型的抗体，根据AteIF-5A同工型相互间表现出独特性的区域来设计多肽。将一个额外的半胱氨酸残基添加到每条肽的N末端以与匙孔血蓝蛋白(KLH)结合。所用序列为：衰老-诱导AteIF-5A的CNDDTLLQQIKS；损伤-诱导AteIF-5A的CTDDGLTAQMRL；生长AteIF-5A的CTDEALLTQLKN。当这些序列被递交到蛋白BLAST(近乎精确的短序列，由拟南芥限定；expected number 2000；word size 2；Matrix PAM90；Gap cost91)分析时，在数据库中找到的有意义序列只有匹配的AteIF-5A而无其他。肽合成于西安大略大学多肽合成实验室(University of Western OntarioPeptide Synthesis facility)。根据Drenckhahn et al.(1993)和Collawn和Patterson(1999)所述，通过使用间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯将载体蛋白匙孔血蓝蛋白(Keyhole LimpetHemocyanin(Sigma))与肽的N末端半胱氨酸残基结合。将连接后的肽注射入兔体内，每隔两周注射一次共四次。最后一次注射后两周放血法收集兔血，收集的血凝固以收集抗血清。

蛋白分级分离和蛋白杂交印迹分析

将上文所列组织在缓冲液(50mM EPPS、pH7.4、0.25M山梨醇、10mM EDTA、2mM EGTA、1mM DTT、10mM氨基-正-己酸、植物组织蛋白酶抑制剂混合物(Protease Inhibitor Cocktail for Planttissues(Sigma)))中，用微量离心管和小杵或大研钵与杵使组织匀质(～0.5g/ml)。在微量离心机以最高转速短暂离心匀浆并丢弃沉淀。按Ghosh等(1988)所述测总蛋白量，用Mini protein Dual Slab cell(BioRad，Mississauga，Ontario)进行SDS-PAGE，凝胶(12％聚丙烯酰胺)用考马斯亮蓝R250(Faribanks等，1971)染色，或用半干转移法(半干转移槽，Bio-Rad，Hercules，CA)将蛋白转印至聚二氟乙烯(PVDF)膜上。用1mg/ml聚乙烯乙醇封闭印迹30s(Miranda等，1993)，再于含0.1％(v/v)吐温20和5％(w/v)奶粉的磷酸盐缓冲液(PBS)中封闭1h。一抗(从第二次注射后的血中得到)用含0.1％(v/v)吐温20和1％(w/v)奶粉的PBS按1∶50稀释。用与碱性磷酸酶偶联的山羊抗兔抗体作为二抗，和碱性磷酸酶底物NBT和BCIP(BioRad，Mississauga，ON)，来显示抗原。

实施例17

制备过表达三种eIF-5A同工型的转化拟南芥植株

引物设计

拟南芥(AT)的真核翻译起始因子5A(eIF-5A)同工型在编码区高度同源(图2)。为避免出现扩增正确基因的问题，用以扩增衰老-诱导AteIF-5A、损伤-诱导AteIF-5A、生长AteIF-5A的引物设计基于5’UTR的接近开始区和3’UTR的末端区，分别见图3、4和5。基于EST资料和来自GenBank数据库的其它序列信息评估5’UTR和3’UTR序列。在引物末端添加合适的限制性内切酶识别位点，以方便后续在二元载体pKYLX71(图6)中按正义方向进行连接反应。扩增衰老-诱导AteIF-5A基因所用的上游引物是5’AAGCTTGATCGTGGTCAACTTCCTCTGTTACC3’，下游引物是5’GAGCTCAGAAGAAGTATAAAAACCATC3’。损伤-诱导AteIF-5A所用上游引物是5’CTCGAGTCGTCACTTCTCTCTCTTAGG3’，下游引物是5’GAGCTCAAGAATAACATCTCATAAGAAAC3’。生长AteIF-5A所用上游引物是5’CTCGAGCTAAACTCCATTCGCTGACTTCGC3’，下游引物是5’GAGCTCTAGTAAATATAAAGAGTGTCTTGC3’。衰老-诱导AteIF-5A引物所加的限制性内切酶位点为Hind III和Sac I位点，损伤-诱导AteIF-5A引物添加Xho I和Sac I位点，生长AteIF-5A引物添加Xho I和Sac I位点，如上文引物序列的下划线部分所示。拟南芥基因组DNA的分离

从3周龄莲座叶中分离基因组DNA。将叶组织在提取缓冲液(200mM Tris、pH7.5、250mM NaCl、25mM EDTA、0.5％SDS)中匀浆化，所得匀浆涡旋混合15s。用微量离心机最高转速离心1min以除去残留碎片。收集上清液并与异丙醇按1∶1混合，涡旋混合后室温放置2min。微量离心机最高转速离心5min收集沉淀，70％乙醇洗涤沉淀，真空干燥2min。干燥物用水重悬，按体积1∶1加入氯仿处理并涡旋混合。微量离心机最高转速离心2min，收集上层液体并用20μl盐溶液(2M醋酸钠)和2倍体积的乙醇处理，-20℃下沉淀30min。然后用微量离心机最高转速离心30min得到纯化的基因组DNA沉淀，干燥后重悬于水中以进行PCR。

基因组DNA的PCR

用上文所述引物进行PCR。PCR反应混合物含：1xTsg或Taq聚合酶反应缓冲液、1U Tsg或Taq聚合酶、0.2mM dNTP、2mM MgCl₂、相应的各自特异引物各15nmol。反应开始于热启动95℃10min，第一个循环包括95℃变性1min，55℃退火2min，72℃延伸2min。随后29循环进行递降程序即每个循环退火温度降低0.5℃，最后一个循环退火温度为40℃。最后72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，根据说明书，使用Millipore Ultrafree-DA切胶并回收DNA用以从琼脂糖spin柱提取DNA(Millipore Corporation，Bedford，MA)。

连接到pGEM-T Easy

根据Promega公司说明书将PCR产物连接到pGEM-T EasyVector载体上(见图7)。简要的说，将PCR产物与pGEMT-EasyVector载体按3∶1混合，与3Weiss U T4DNA连接酶在由PromegapGEM-T Easy Vector System(Promega Corporatio，Madison WI)提供的快速连接缓冲液(30mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、10mM DTT、1mMATP、5％聚乙烯乙二醇(MW8000，ACS Grade)pH7.8)中15℃连接反应过夜，然后转化大肠杆菌DH5-α感受态细胞悬液(用RbCl/CaCl法制备感受态细胞，Kushner，1978)。先将转化反应液置于冰上30min，随后42℃热激90s，再加入1ml 2×YT肉汤培养基于37℃复苏1h。转化后的细胞聚集，用小体积的2×YT肉汤培养基重悬，并涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的琼脂糖平板上培养以进行选择。pGEMT-Easy载体提供了细胞对氨苄青霉素的耐药性，只有发生转化的细胞才能在氨苄平板上生长。筛选并挑选出PCR产物连接到pGEMT-Easy载体的转化细胞。

通过限制性内切酶消化来筛选插入到pGEMT-Easy载体的PCR产物

挑取选择平板上的克隆接种至含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT肉汤培养基于37℃培养过夜。使用Wizard Prep DNA纯化试剂盒(Promega)从选出的克隆里纯化重组质粒。EcoRI 37℃消化质粒DNA1h，1％琼脂糖凝胶电泳后观察，以确定存在AteIF-5As基因大小的插入片段。阳性质粒随后由Core Molecular Biology Facility(Universityof Waterloo，Waterloo，ON)测序，以确定序列适合在植物中(in planta)过表达。

连接到pKYLX71

pGEM：损伤-诱导AteIF-5A和pGEM：生长AteIF-5A构建体均用XhoI和Sac I进行双酶切，连接到也用XhoI和Sac I酶切的二元载体pKYLX71。这种酶切消化可以确保损伤-诱导AteIF-5A和生长AteIF-5A能以正义方向插入二元载体pKYLX71，并处于花椰菜镶嵌病毒双35S启动子控制之下。使用1μg二元载体和3μg损伤-诱导AteIF-5A或生长AteIF-5A进行连接反应。连接在连接缓冲液(30mMTris-HCl、10mM MgCl₂，10mM DTT、1mM ATP、5％聚乙烯乙二醇(MW8000，ACS Grade)pH7.8)及3weiss U T4DNA连接酶中进行。15℃连接反应过夜，并转化大肠杆菌DH5-α感受态细胞悬液(用RbCl/CaCl法制备感受态，Kushner，1978)。先将转化混合液置于冰上30min，随后42℃热激90s，再加入1ml 2×YT肉汤培养基于37℃复苏1h。转化后的细胞聚集，用小体积的2×YT肉汤培养基重悬，并涂布于含有50μg/ml四环素的琼脂糖平板上培养以进行选择。pGEMT-Easy载体提供了细菌细胞对四环素的耐药性，只有发生转化的细胞才能在四环素平板上生长。通过PCR和XhoI和Sac I双酶切筛选并检出插入损伤-诱导AteIF-5A或生长AteIF-5A基因的转化细胞。随后的PCR扩增(同上文所述基因组DNA扩增)和消化反应所得产物在1％琼脂糖凝胶电泳分离，以确定有正确大小的插入片段。

土壤杆菌的电穿孔和选择

pKYLX71：损伤-诱导AteIF-5A和pKYLX71：生长AteIF-5A构建体被电穿孔导入根癌土壤杆菌GV3010感受态细胞。制备感受态细胞，先将一个单克隆接种到含50μg/ml利福平和50μg/ml庆大霉素的5ml 2×YT肉汤培养基中，用Forma Scientific Orbital Shaker(Fisher Scientific)280rpm转速28℃振摇培养过夜，然后按不同稀释度(1∶500、1∶1000、1∶2000)接种到含50μg/ml利福平和50μg/ml庆大霉素30ml 2×YT肉汤培养基中。当菌液OD₆₀₀达到0.5-0.8时，冷却菌液并离心，在SS-34转子(Sorvall)中2000g转速进行15min。沉淀用50ml冰冷水悬浮，再用2000g转速离心15min。如此洗涤程序重复4次以除去盐分和死细胞。最后得到沉淀用40ml冰冷的10％(v/v)甘油重悬，并于2000g转速离心15min，重复一次。用100μl冰冷10％(v/v)甘油重悬并混合均匀。将细胞分装为每份100μl贮存于冰上。

为将DNA电穿孔导入土壤杆菌感受态细胞，取上述100μl细胞与500ngDNA构建体混合均匀。随后将细菌：载体混合物转移至预冷的电穿孔杯中并置于Gene Pluser(Biorad)，调节至以下设置：2.5kv，25μF和200Ω。电穿孔后加入1ml 2×YT肉汤培养基，将整个悬液转移到培养试管中。该电穿孔培养物28℃280rpm振摇培养3h使细胞复苏，再加入含50μg/ml利福平和50μg/ml庆大霉素的2×YT肉汤培养基培养。电穿孔细胞在培养基中生长2天后，涂布于含四环素、庆大霉素、利福平各50μg/ml的平板上再培养2天。最后得到的克隆用PCR和SacI-XhoI双酶切及在1％琼脂糖凝胶上分离显示进行筛选，得到正确导入了pKYLX71：损伤-诱导AteIF-5A或pKYLX71：生长AteIF-5A构建体的克隆。

植株的转化

含有pKYLX71：损伤-诱导AteIF-5A或pKYLX71：生长AteIF-5A的根瘤土壤杆菌GV3010阳性克隆被用来转化野生型拟南芥哥伦比亚生态型植株。制备转化植株所用的菌液时，首先挑取含pKYLX71：损伤-诱导AteIF-5A或pKYLX71：生长AteIF-5A构建体的阳性单克隆，接种至各含50μg/ml四环素、庆大霉素和利福平的5ml 2×YT肉汤培养基中，置于Forma Scientific Orbital Shaker(Fisher Scientific)以280rpm转速28℃振摇培养2天，再接种至35ml(总量)也含50μg/ml利福平和50μg/ml庆大霉素2×YT肉汤培养基中。这35ml菌液以280rpm转速28℃振摇培养过夜，并接种至535ml(总量)含50μg/ml利福平和50μg/ml庆大霉素2×YT肉汤培养基中。以280rpm转速28℃振摇培养过夜，到OD₆₀₀约为2.0为止。

用两个250ml离心管，以1945g转速4℃在GSA转子(Sorvall)中离心上述菌液15min。用500ml渗透培养基(1.1gMS盐、25g蔗糖、0.25g MES、KOH调pH5.7、100ng/ml苄基氨基嘌呤、50μlVac-In-Stuff(Silwet L-77；Lehle Seeds))重悬浮沉淀，然后置于一个大塑料盘中，再放入有4个橡皮塞的真空干燥器中。取5只罐，每只长有8株处于正确发育阶段的植株用以连续的渗透。每只罐先在垃圾筒上倒置以除去所有松土，然后置于一个塑料容器内(罐仍然倒置)并放进玻璃干燥器中，这样使得4个大橡皮塞可以支持住倒置罐子使花苔(bolt)浸入土壤杆菌浆液而不是植株的莲座浸入。植株保持这种倒转状态，抽真空(400mmHg)10min。经真空渗入的植株恢复后与平常一样在生长室条件下(见植物材料部分)生长。几周后，当长角果变干种子成熟后，采集种子。每只罐的种子放在一起。

转化植株的选择和分离分析

为鉴定初级转化株，从真空渗入株收集的种子先用1％(v/v)次氯酸钠和0.1％(v/v)吐温80进行表面消毒，在转子(Barbsterd/Thermolyne)中进行20min，用无菌水漂洗4次，再用0.8％无菌琼脂重悬。然后种入无菌的半浓度Murashing and Skoog(MS)培养基中(2.2g/L)，并补充1％(w/v)蔗糖、0.5g/L 2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES)、0.7％(w/v)细菌用琼脂和40-50μg/ml卡那霉素(Murashige and Shoog，1962)。只有转化植株才能在卡那霉素平板上生长，因为二元载体给转化植株提供了卡那霉素抗性基因(图6)。因为无卡那霉素抗性基因，不含二元载体的幼苗变黄并死亡。野生型幼苗作为对照种植于不含卡那霉素的MS培养基上，同时含空白pKYLX71载体的纯合株种子也作为对照种植于卡那霉素平板上。空白载体对照用来证明卡那霉素对幼苗生长影响和二元载体随机整合至拟南芥基因组所产生的影响。在每块含MS培养基和40-50μg/ml卡那霉素平板上的一个小区域里种植少量野生型种子。这么做是为了确保培养基有足够的选择性来选出转化植株，并同时试验卡那霉素的浓度。

播种后的平板于4℃保持3天以使发芽同步化。3天后平板转移至生长室，在16h光照/8h黑暗的光周期下于20±2℃再生长7天。光照保持在150umol m^-2·s^-1，使用冷白荧光灯泡。pKYLX71：损伤-诱导AteIF-5A和pKYLX71：生长AteIF-5A载体转化拟南芥的效率得以确定。

自播种起总计10天后，分别取正义损伤-诱导AteIF-5A和正义生长AteIF-5A转化植株各14或16株，移植到有32个生长单元的Promix BX土壤(Premier Brands，Brampton，ON，Canada)平台上。这些T1代植株随即转移到另一个生长室，该生长室被控制为22℃、16h光照/8h黑暗光周期。使用冷白荧光灯泡提供光强150μmol m^-2·s^-1。T1代植株成熟并产生T2代种子。采集这些种子并保藏于-20℃以利进一步筛选。T1代植株命名为1，2，3等。所有16个品系的正义生长AteIF-5A株均存活并产种，但14株正义损伤-诱导AteIF-5A转化株中仅有9株存活并产种。

用选择T1代转化植株的方法来选择T2代转化植株。含正义生长AteIF-5A的品系12没能在选择培养基上产生转化植株，未包括到进一步的工作中。含正义生长AteIF-5A的品系1到16(除去品系12)每种均产生8个亚品系。这些亚品系被命名为A到H，因此如在T1品系1中，T2代植株被命名为1A、1B、1C等。正义损伤-诱导AteIF-5A植株品系1、2、3、4、5、7、9和11每种产生8个亚品系(A-H)。T1株的品系12仅产生约30粒T2种子，仅产生一个T2亚品系。正义损伤-诱导AteIF-5A植株的T2品系仍在生长和鉴定中。正义生长AteIF-5A的T2植株已经成熟并产种，采集种子并保藏于-20℃直至进一步分析。

正义生长AteIF-5AT3代转化植株的选择用与T2同样的方法来进行。根据表型分析和正义生长AteIF-5A的过量表达程度选出8个品系。表达水平分成四类：高水平表达、中等水平表达、低水平表达和无表达(由共抑制引起)。每种水平选出两个品系，每个品系移植12株。这个四种表达水平的相应品系为：1A、2D、4D、15A、8D、9H、11C和16C。正义生长AteIF-5A植株的T3代仍在生长和鉴定中。

实施例18

正义损伤-诱导AteIF-5A和正义生长AteIF-5A转化植株的表型分析：照片记录

正义损伤-诱导AteIF-5A和正义生长AteIF-5A品系的形态表型在分离过程中用拍照记录，相应野生型植株对照(拟南芥哥伦比亚生态型)和空白二元载体pKYLX71转化植株对照的表型也被同样记录。

种子度量

收集正义生长AteIF-5A T2植株的T3种子，测量种子总产量(重量和体积)、种子大小(长和宽)并计算所产种子的单个重量和体积。用Sartorius电子分析天平(analytcal digitized scale)称量种子总重，将每棵植株的种子倒入一个最小刻度为100μl的1ml玻璃针筒内来测量种子总体积。为了确定种子大小(长、宽和计算得出单个体积)，将种子放在含有测微计的载玻片上，用Olympus BX51显微镜观测。联用Spot Insight Color Camera(Diagostic Institution Inc.)和Compaq Evo D500(Compaq Company Corporation；IntelPentium 4CPU1.7GHz，262MG RAM，Windows 2000)进行显微拍照。使用Windows系统的Image-Pro Express Version 4.0程序。用照片中的测微计作为标度测量每个亚品系的10粒种子。测量结果输入MicrosoftExcel分析并计算诸如标准差和体积。

实施例19

正义损伤-诱导AteIF-5A和正义生长AteIF-5A蛋白分级分离流分的生化分析和蛋白杂交印迹分析

收集每个亚品系的正义生长AteIF-5A植株的T2植株的第一片茎生叶并按上文描述提取蛋白。品系1A、2A到16A的总蛋白用12％SDS-PAGE分级分离，并转移到PDVF膜上。用生长αAteIF-5A抗体(1∶50稀释度)作探针检测印迹。收集野生型和空白二元载体对照株的第一片茎生叶并提取总蛋白作为对照。

实施例20

拟南芥翻译起始因子5A(AteIF-5A)同工型在野生型哥伦比亚生态型植株中的表达

采集不同发育阶段的若干植物组织并提取总蛋白以进行蛋白杂交印迹分析。图8中的蛋白杂交印迹分析结果显示在2周龄莲座叶中未见衰老-诱导AteIF-5A，但从3周龄叶子开始衰老-诱导AteIF-5A上调并大量增加直至5周龄，其后大量减少但7周龄时仍然存在。在PEG处理植株或对照植株中均未检测到衰老-诱导AteIF-5A，但在花泳道中(包括衰老花)和吸涨种子泳道中存在，反映有子叶的组织的衰老。当用损伤-诱导αAteIF-5A抗体作探针检测印迹时，在长角果、吸涨种子和茎的泳道可观察到浅带。在长角果和茎泳道中可观察到损伤-诱导AteIF-5A可能是由于采集组织导致的损伤所引起。因为采集长角果和茎的操作困难，它们并没有被速冻，使得损伤-诱导AteIF-5A同工型一定程度增量调节。当用生长αAteIF-5A抗体作探针检测印迹时，只有吸涨种子显示有带，支持了这个同工型参与细胞分裂的观点。

在几个时间点采集未处理株、用MgCl₂模拟接种株、无致病力或有致病力的丁香假单孢菌处理株的组织以分析AteIF-5A在病原体入侵时的表达。植株识别无致病力菌株并诱导过敏反应，导致感染区域的细胞死亡或坏死，因而抵御了病原体引起的疾病。而且，局部性反应逐步变成系统性反应以保护植物不受进一步的侵犯。这种作用被称为系统获得性抗性(Systemic Acquired Resistance，SAR)，它包括一套基因的表达，这套基因称为病原体应答(PathogenResponse，PR)基因。另一方面，植株不能识别有致病力的菌株，因而不产生过敏反应并会导致疾病。拟南芥病态症状包括叶子变黄和感染后几天细胞死亡。感染后72h，采集对照株、模拟感染株、无致病力的菌种处理株和有致病力的菌株处理株组织，用三种αAteIF-5A抗体(图9)为探针进行蛋白杂交印迹分析。在这个时间点，SAR和疾病分别在无致病力的菌种处理株和有致病力的菌种处理株中都被观察到。当用衰老-诱导αAteIF-5A抗体为探针时，在所有样品中均可观察到一条大致相同的带。既然所有植株均为4周龄，所以这并不奇怪，因为衰老同工型在3周龄开始可被观察到(图8)。当用损伤-诱导αAteIF-5A抗体为探针检测印迹时，在未处理对照株、模拟处理株和无致病力的菌种处理株可检测到一条浅带，而在有致病力的菌种处理株可检测到一条颜色很深的带。这种损伤同工型的增量调节可归咎于疾病导致的细胞死亡(也是一种细胞损伤)。用生长αAteIF-5A抗体为探针检测印迹时未显示任何带，因此图中未反映。在这些处理株中衰老-诱导AteIF-5A的表达未见变化，证明其特异于自然衰老。损伤-诱导AteIF-5A表达的提高也证明它特异于损伤引起的死亡。为了进一步探索这种可能性，用拟南芥的损伤叶进行实验。

损伤实验显示了与病理实验相似的结果(图10)。用RNA杂交印迹分析显示衰老-诱导AteIF-5A、损伤-诱导AteIF-5A、生长AteIF-5A的转录变化。探针特异于每种AteIF-5As并且含有各自的3’UTR序列。观察到与病理实验结果相似，衰老-诱导AteIF-5A表达未变化，因为这些为4周龄株且样品采集仅间隔9h。这再次与衰老-诱导AteIF-5A是特异的自然衰老同工型的事实一致。然而损伤-诱导AteIF-5A的表达9h后上升。很可能发生了一些翻译控制，因为未诱导时转录物表现为组成型(图10)，但是不诱导蛋白不表现出高表达(图9)。生长AteIF-5A转录物在所有样品中几乎都检测不到，并且表现出损伤后的表达下降。

实施例21

过量表达三种eIF-5A同工型的拟南芥转化植株的产生

从基因组DNA用PCR分离AteIF-5A(图11)。PCR产物连接到pGEM(图12)上，并且序列经证实适合在植物中过表达。用XhoI和Sac I双酶切将损伤-诱导AteIF-5A和生长AteIF-5A基因从pGEM上切下，以正义方向连接到pKYLX71上，位于花椰菜镶嵌病毒双35S启动子后。用酶切和PCR确定阳性连接反应产物(图13)。然后用pKYLX71：损伤-诱导AteIF-5A和pKYLX71：生长AteIF-5A电穿孔转化根瘤土壤杆菌GV3010，再用转化的菌株通过真空渗入感染野生型拟南芥哥伦比亚生态型植株。采集转化后植株的种子并用含卡那霉素的MS平板上选择转化植株。

过量表达损伤-诱导AteIF-5A(正义损伤-诱导AteIF-5A)的拟南芥植株

T1代植株种于含50μg/ml卡那霉素的MS平板上，4℃贮存3天，在生长室中7天(图14)。有14棵转化植株移植到土中。这14棵T1代植株的一个共同表型是发育障碍。品系1、4、6、8、10、11、12、13和14的生长被严重阻碍而且品系6、8、10、13和14不产种。品系2和3中度受阻而品系5、7和9的生长与野生型相似(图15和16)。T1代正义损伤-诱导AteIF-5A植株的其它一些表型包括黄色叶子、紫色子叶、卷曲叶和花形差异。值得注意的是，直到植株被移植到土壤中才观察到生长受阻的现象。这一点可能的一个解释是，在移植时根发生了轻微损伤(移植不可避免的一个后果)而且不能恢复。事实上在预备实验里，用卡那霉素溶液浸泡种子并直接播种到土壤中，未见生长受阻的现象(而上文70％的植株在一定程度上生长受阻)，是因为没有移植所以根没有被损伤。

品系1、2、3、4、5、7、8、11和12产生T2种子(图17)。除了只长出一株转化植株的品系12，每个T2品系中有8个亚品系A-H并用于当前分析。

过量表达生长AteIF-5A(正义生长AteIF-5A)的拟南芥植株

正义生长AteIF-5A植株的T1代种子长于选择培养基上，长出16棵转化植株(图18)。用照片记录这些转化植株的整个生命阶段。其表型从与野生型相似(品系1、2、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15和16)到生长中度受阻且植株显黄色(品系2、4和9，图19)间变化。所有品系都用于产生T2代种子，每个品系有8个用A-H标记的亚品系。品系12未产生转化植株，认为是野生型。T2代植株有比T1代植株更大的表型。产生T3代的品系将被详细讨论。

根据转入的生长AteIF-5A基因的表达水平来分组描述正义生长AteIF-5A植株T2代的性质。从每个品系的茎生叶提取蛋白并进行蛋白质杂交印迹(图20)。因为在同一品系内A-H这些亚品系的大多数有相似表型，所以只对每个品系的亚品系A进行蛋白质杂交印迹分析以从总体上概括生长AteIF-5A的表达水平。从野生型植株和空白二元载体转化植株的茎生叶提取的蛋白作为凝胶电泳的对照。这些亚品系中观察到的表达水平可分类为高(品系1、2、3、10和13)、中(品系4、5、6和15)、低(品系7、8、9和14)或无表达(品系11和16，以及野生型和空白载体对照株)。也用抗衰老-诱导AteIF-5A和抗损伤-诱导AteIF-5A的抗体为探针作印迹。蛋白质杂交印迹结果显示正义生长AteIF-5A植株中表达提高的是由于生长AteIF-5A，而未见另两种AteIF-5A同工型的总体增量调节，因为未检测到可观数量的任一种AteIF-5A同工型。这也证明了同工型特异抗体的特异性是可以接受的。

根据表型和生长AteIF-5A表达水平(见表1对每个品系表型的概要)来选择产生T3代种子的正义生长AteIF-5A品系。每种表达水平组中各选出两个品系。这些将被使用的品系为1A、2D、4D、15A、8D、9H、11C和16C。

根据图20中的蛋白杂交印迹结果，品系1高水平表达生长AteIF-5A。该品系植株相比野生型植株有大而深绿色的莲座，而且叶子相当圆(图21)。品系1的莲座也有涡旋状表型，其上的叶都向同一方向卷曲。这些正义生长AteIF-5A植株比野生型植株稍晚些抽苔。品系2也高水平表达生长AteIF-5A，但与品系1不同的是这些植株小且黄(图22)。品系2也比野生型和空白载体对照植株稍晚些抽苔，并产生较小的花苔(约一半大小)和较少的长角果。

在中等水平表达品系中，品系4表现出与野生型相似的叶子/莲座大小和花苔大小，虽然它比野生型和空白载体对照株早几天抽苔。第二个中等水平表达生长AteIF-5A的是品系15。这些植株如同品系14，与野生型非常相似，但是莲座所占区域大于对照组(图23和24)，莲座的叶的尖端也比对照组更圆。但是它的花苔未表现出任何与众不同的表型。

低水平表达品系中准备用来产生T3代的为品系8和9。品系8与对照组植株相比有很大的叶子和莲座(图25)，叶子也比对照组植株更宽、更圆。而抽苔时间，花苔大小和数目似乎与对照组一致。正义生长AteIF-5A品系9的叶子形状与品系8相似，但远比品系8的黄而且小(图26)。如同品系2(高水平表达品系之一)，这些品系的植株表现出发育障碍和更短的花苔，但不同于品系2的是品系9约与对照组同时抽苔。

根据蛋白质杂交印迹结果(图20)，正义生长AteIF-5A植株的两个品系11和16没有增量调节表达生长AteIF-5A。这可能归咎于转基因和内源基因的共抑制。尽管这些植株看起来与对照组相像(图27和28)，但由于几个原因相信转基因被整合到品系11和16植株的基因组中。首先，通过卡那霉素MS平板的选择性说明它们确实有卡那霉素抗性。其次，品系16的莲座、花苔和叶(图28)比对照组至少大50％。但最有力的证据是它们产生的T3代种子的大小和组成。

测量所有正义生长AteIF-5A植株的T2代品系的T3种子。每个品系种子均被拍照(图29中突出显示了最大和最小者)，用照片上的测微计为标度使用计算机(in silico)测量大小。对于每个品系和对照组，测量视野中最大的10粒种子并用以计算。发现高水平表达的品系2的种子是野生型和空白载体对照株的3倍大。而表达水平最低的品系(品系11和16)有一些最小的种子，大小仅为野生型和空白载体对照株的88％。每个品系种子的平均大小以nm3为单位(图30)表示。由于拟南芥的种子近似椭圆体，计算时使用椭圆体体积计算公式。测得的对照组种子大小与Boyes等人(2001)确定并发表的指导方针是一致的。由单个种子大小的测量值和种子总产量(重量和体积)，计算单个种子的平均重量并绘图(图31)。可见大多数品系的种子大小都与对照组不同，但在单个种子重量上有与对照组相同的趋势。事实上，当用种子重量对种子大小(体积)作图时，关系基本是线性的，R²＝0.7142。有5个品系例外要么是密度提高(其中3个)，要么是密度减小(其中两个)。密度提高的品系之一为8D，将用来产生T3代。所有T2植株的种子总产量变化很大，几乎无趋势。然而值得注意是一个中等水平表达正义生长AteIF-5A的品系4D，它的种子产量最大(重量和体积都是)。事实上，它的种子产量比对照组高2.5倍并用来产生T3代。

T3种子按前所述种于选择平板上。品系1A、2D、4D、15A、8D、9H、11C和16C被移植到土中。正义生长AteIF-5A植株的品系1的其它几个亚品系的种子未发芽。品系2H也没有发芽，它是未发芽亚品系种子中最大的。来自品系11(发生共抑制的品系之一)的植株没有这个年龄典型植株那样健康。产自它的种子也是所测种子中最小的种子之一。可见这些品系仍然在分离，因为所有品系仍然有无卡那霉素抗性的植株和产生不发芽种子的植株。这很可能是转基因的副作用而非由技术引起，因为相同方式处理的对照组种子全发芽。

实施例22

拟南芥衰老-诱导eIF-5A的鉴定

制备全长拟南芥衰老-诱导eIF-5A的方法学

基于几种植物eIF-5A基因的简并引物与T3&T7载体引物组合用以从拟南芥cDNA文库里PCR扩增出eIF-5A基因。具体的说，eIF-5A基因的5’区域通过使用T3引物(定位于载体中eIF-5A基因的上游)和一个下游(反向)简并引物进行PCR扩增得到。同样的，3’区域通过使用T7引物(定位于文库载体中eIF-5A基因的下游)和一个下游(正向)简并引物进行PCR扩增得到。全长eIF-5A基因源自对该基因5’和3’区域的序列对比分析。

每个PCR反应有2-3个主要产物。这些片段被克隆到pBluescript质粒并测序。依靠Genbank进行作图分析来鉴定eIF-5A基因阳性PCR片段。对拟南芥只有一个上游和下游阳性eIF-5A基因PCR片段。

根据5’和3’PCR片段测序结果来设计特异的5’和3’末端引物。通过使用特异的5’和3’末端引物和相应cDNA文库为模板来扩增得到全长拟南芥eIF-5A基因。所得全长基因通过测序被进一步确认。最后，我们克隆到一个拟南芥eIF-5A同工型基因，它被称作衰老-诱导eIF-5A。

T3和T7引物：

T3：5’-ATT AAC CCT CAC TAA AG-3’

T7：5’-AAT ACG ACT CAC TAT AG-3’

扩增拟南芥eIF-5A基因的简并引物：

正向(上游)引物：5’-AAA RRY CGM CCY TGC AAG GT-3’

反向(下游)引物：5’-TCY TTN CCY TCM KCT AAH CC-3’

将全长衰老-诱导eIF-5A基因的反义序列亚克隆到pKYLX71载体(含SAG12启动子)

为拟南芥衰老-诱导eIF-5A反义全长构建体使用的特异(同源)引物：正向全长衰老-诱导eIF-5A引物(30mer)：

5’-CCGAGCTCCTGTTACCAAAAAATCTGATCC-3’(注：下划线部分为Sac I识别位点，用以将PCR片段的5’末端连接到pBluescript的多克隆位点(MCS))。反向全长衰老-诱导eIF-5A引物(36mer)：

5’-ACCTCGAGCGGCCGCAGAAGAAGTATAAAAAACCATC-3’(注：下划线部分为Not I识别位点，用以将PCR片段连接到pBluescript的多克隆位点(MCS))。

在pBluescript的多克隆位点(MCS)中，Sac I和Not I位点的排列方向必须保证基因以反义方向插入(也就是Not I位点在Sac I的上游)。

实施例23

使用SAG12启动子反义表达全长拟南芥衰老-诱导eIF-5A

实验证据表明一套“衰老-相关基因”(″senescence-associatedgenes″)或SAG的转录在衰老起始时提高(Lohman等1994；Weaver等1998)。事实上，衰老首先表现于新mRNA的合成而且很可能减量调节其它mRNA，这提示选择性合成蛋白对衰老来说是必需的(Nooden，1988)。Watanabe和Imaseki(1982)使用体外翻译并随后以凝胶电泳，来探测发生在可译mRNA群体上的改变，从而首先证明衰老程序伴随着基因表达的改变。这项最早的工作和后续的体外翻译蛋白分析揭示在衰老过程中，大部分mRNA量显著减少而其余可译mRNA量则增加(Watanabe and Imaseki，1982；Davies andGrierson，1989；Becker and Apel，1993：Buchanan-Wollaston，1994；Smaret al，1995)。对来自衰老叶组织的mRNA的cDNA文库的差示筛选也证明在衰老过程中许多基因表达受到减量调节，而其它基因受到增量调节。已经从多种植物中鉴别出SAG，包括拟南芥(Hensel etal.1993；Taylor等1993；Lohman等1994；Oh等1996)、芦笋(King等1995)、大麦(Becker and Apel，1993)、欧洲油菜(Brassica napus)(Buchanan-Wollaston，1994)、玉米(Smart等1995)、萝卜(Azumi andWatanabe，1991)和番茄(Davies and Grierson，1989；Drake等1996)。可从形态学上鉴别衰老，如叶片特征性模式的变黄，从叶边缘开始最终到达叶脉(Weaker等1998)。拟南芥莲座叶的明显衰老表现在发芽后的约21天，同时伴随SAG12的剧烈增量调节（Noh and Amasino，1996)。SAG12是最接近自然衰老的特异性基因，因而被称作衰老标志。SAG在嫩叶没有可探测到的表达，而在～20％变黄后的较老叶子中被诱导，但是不被不能诱导叶子变黄的处理所诱导(Weaker等1998)。它高度特异于自然衰老过程，可用以下事实解释：SAG12的产物与半胱氨酸蛋白酶相似，并且可能参与衰老过程中的蛋白质周转(protein turnover)(Lohman等1994；Weaker等1998)。

转基因株的描述

生产转基因拟南芥植株，表达转入的全长衰老-诱导eIF-5A反义序列，这个反义序列处于SAG12(特异于叶衰老)的启动子控制下。这个启动子在叶自然衰老起始时被活化，约为发芽后21d(Noh andAmasino，1996)。但在环境压力诱导的衰老事件中不被活化。在这个时间点，转基因植株表现出全长衰老-诱导eIF-5A被抑制的表型。在转基因拟南芥反义全长衰老-诱导eIF-5A株的3-8周龄采集莲座叶。

制备纯合SAG12启动子控制的反义全长衰老-诱导eIF-5A的转基因拟南芥方法学

将SAG12-反义全长衰老-诱导eIF-5A构建体插入pKYLX71

首先，用EcoRI和Hind III双酶切pKYLX71质粒以除去双35S启动子，所得粘末端用Klenow酶处理以得到平末端。然后连接不含该启动子的pKYLX71以再次环化质粒。

第二步，用以下描述的含SacI和XbaI位点的引物从基因组DNAPCR扩增得到拟南芥SAG12启动子。然后使用限制性酶Sac I和XbaI酶切并用T4 DNA连接酶将启动子序列插入到pBluescript的多克隆位点(MCS)。

正向SAG12引物为：

5’-GGCCGTCGACGATATCTCTTTTTATATTCAAAC-3’(下划线部分为Sac I识别位点，用以将PCR片段的5’末端连接到pBluescript的多克隆位点(MCS)的Sac I位点上)。反向SAG12引物：5’-CGTCTAGACATTGTTTTAGGAAAGTTAAATGA-3’(下划线部分为XbaI识别位点，用以将PCR片段的5’末端连接到pBluescript的多克隆位点(MCS)的XbaI位点上)。

第三步，为构建pBluescript-SAG12：反义全长衰老-诱导eIF-5A构建体，使用如下描述的含Sac I和Not I位点的引物，从拟南芥cDNA文库PCR扩增得到全长衰老-诱导eIF-5A基因，并如上文描述亚克隆到pBluescript-SAG12上。注意，pBluescript-SAG12载体的MCS中的Sac I和Not I位点方向必须使基因以反义方向亚克隆入(也就是Not I位点在Sac I的上游)。

正向全长衰老-诱导eIF-5A引物：

5’-CCGAGCTCCTGTTACCAAAAAATCTGTACC-3’(注：下划线部分为Sac I识别位点，用以将PCR片段的5’末端连接到pBluescript-SAG12的多克隆位点(MCS))。反向全长衰老-诱导eIF-5A引物：

5’-ACCTCGAGCGGCCGCCAGAAGAAGTATAAAAACCATC-3’(下划线部分为Not I识别位点，用以将PCR片段连接到pBluescript-SAG12的多克隆位点(MCS))。

最后，通过用Sac I和XhoI消化pKYLX71，也用Sac I和Sal I从pBluescript-SAG12消化SAG12：全长衰老-诱导eIF-5A盒，在二元载体pKYLX71中构建所需构建体。

XhoI和Sal I形成的粘末端部分互补，因此这两个消化得到结构的突出端(具体的是XhoI和Sal I、Sac I和Sac I)能够在T4连接酶的作用下连接起来，构成最终构建体(pKYLX71上的SAG12：反义衰老-诱导eIF-5A)。

转化和T1种子采集

在大肠杆菌DHα细胞中扩大培养pKYLX71-SAG12：反义eIF-5A构建体，随后分离并电穿孔转入土壤杆菌感受态细胞。然后将土壤杆菌转化菌株渗入4.5周龄的拟南芥野生型植株，所得渗入植株记为“T₀”株，它们被培养到生命末期。采集种子，记为T₁种子。用10个卡那霉素平板(1/2MS盐、50μg/ml卡那霉素)筛选T₁种子，以野生型作为对照，只有含pKYLX71-SAG12：反义eIF-5A构建体的种子可以存活并在卡那霉素(K50)培养基上生长。从这些平板中选出24株T₁幼苗并种于土中。从T₁转基因植株采集的种子记为T₂种子。每株幼苗产生一个植株品系(#1＝含一植株的一个品系，#2＝含一植株的一个品系，等等)

表型筛选和鉴定

一旦鉴别出卡那霉素抗性的T₁种子，就连续长出T₂，T₃和T₄代植株。通过在K50培养基上筛选种子，使区别开继承了遗传构建体的植株和具有纯合的该构建体的植株成为可能。当在罐中培养时，在T₃代植株中观察到一个表现发育障碍表型的品系。但是，当同样的种子组在相同条件下再次培育时，未见到这个表型。

根据种子高产，从24棵T₁代植株中选出4个品系(品系T2.14、T2.18、T2.19和T2.23)种于K50培养基平板上，用野生型种子作为对照。每个品系约有75％的种子在K50培养基上存活并按外形分成小、中、大三类。每个品系的小、中、大幼苗从平板上转移到土中。在温室条件下，小幼苗恢复不如中和大幼苗快。在第6周，小幼苗刚开始有抽苔征兆，而其它植株已经抽苔和开花。共有6棵T₂代植株(来自共3个品系×8棵＝96棵转基因植株)表现明显的抽苔推迟，被认为是“晚花苔”(late bolt)株。这些植株的种子产量也显著低于其它转基因植株。

从96棵T₂代植株中选出3个品系以产生T₃代植株(品系T3.19.S8和T3.14.L7是晚抽苔株；T3.23.S3是非晚抽苔株)。当种于K50培养基上时，这些植株表现出纯合性存活。移植13株幼苗到罐中(每罐10株)。在这组植株中，可观察到T3.14.L7品系的一个醒目的矮小表型。采集T₄代种子，并且观察到该品系有更低的种子产量。在品系T3.19.S8中观察到一个密集生长表型(长角果密集生长，有更多的枝)，而在T3.23.S3中观察到与野生型相似的表型。比较了来自3个转基因品系的种子大小，但没能找到显著的统计差异。也进行了叶绿素水平分析，但没有发现与野生型对照的显著差异。

品系T3.19.S8、T3.14.L7和T3.23.S3的T₄代种子用K50培养基筛选以得到下一代植株。与死亡的野生型种子相比，筛选结果显示这些种子继承基因构建体的证据(在平板上均绿色生长)。但是当幼苗移植到单独的平台上时，没有矮小表型出现，这提示转入的反义eIF-5A已经丢失。最后，收集所有T₅代植株的种子并在K50平板上筛选，它们表现出对卡那霉素的抗性。现正进行研究以确认转入的反义序列已经丢失和T₄代植株中转入的基因不成对。

从母系T2.14、T2.19和T2.23中选出8个子品系，并在K50培养基平板上用野生型种子作为对照进行筛选。根据低种子产量选出3个品系：T3.14.S8、T3.14.L8和T3.23.S1。另5个选出品系为T3.18.S7、T3.18.S2、T3.19.S1、T3.18.S5和T3.23.S6。在K50培养基平板上筛选的所有品系均表现出纯合性存活，而T3.14.L8、T3.14.S8和T3.23.S1的幼苗表现出杂合性存活。品系T3.14.L8和T3.14.S8的幼苗存活，表现白色上有绿色脉管组织，而T3.23.S6则表现为完全深绿色存活。这些幼苗被选出进行移植。共有来自每个品系的28株幼苗被移植到生长单元，在温室条件下生长。

在第3周，除了品系T3.14.L8和T3.23.S1的所有植株和T3.14.S7、T3.14.S2、T3.19.S1、T3.19.S5、T3.23.S1和T3.23.S6中的一些植株外，所有植株开始抽苔。在T3.14.S8和T3.14.L8中观察到不规则的莲座叶外形(第二对叶变长的表型)。第5周，在T3.18.S7和T3.23.S6中观察到另外的不规则叶外形(莲座叶增多和皱边缘莲座叶的表型)。第7周，在T3.18.S7、T3.18.S2、T3.19.S1、T3.19.S5、T3.23.S1、T3.23.S6中观察到纺锤形茎和无延长茎的表型。分别在第5和第6周采集所有植株的第一和第二茎生叶，以研究衰老-诱导eIF-5A蛋白的表达。

实施例24

产氧量的确定

采集叶子，测重量前先测量面积。使用1ml冷脱气研磨缓冲液、研钵和研杵将叶子仔细磨碎。随后将匀浆转移到一个EP管中并立即置于冰上。分离番茄叶匀浆还需要用Miracloth膜过滤。

所有样品均取50μl匀浆，加入到盛有5ml研磨缓冲液和25μlDCPIP(2，6-二氯靛酚)的10ml试管中。充分振荡，然后一组样品置于一对灯光照下15min，另一组置于黑暗15min。温育15min后，向两组样品中均加入50μl DCMU(3-(3，4-二氯苯基)-1，1-二甲基脲)以停止反应，随后用微量离心机以14,000g离心2min。以研磨缓冲液为空白对照，读取所得上清液在590nm处的吸光度。

该分析所用的摩尔消光系数为16×10³，也就是1mol/L的浓度变化所改变的溶液吸光度为16×10³μmol DCPIP减少(/h/ml)，即＝(吸光度差值)×[1/16×10³(umol/L)]×[反应体积(ml)]×[10⁶(ml/L)]×[60(min/h)/反应时间(min)]×[1/样品体积(ml)]。

每减少2mol DCPIP，产生1mol O₂。

参考文献：Allen J.F.and Holmes N.g.1986.Electron Transport andRedox Titration s in Photosynthesis：Energy Transduction.Edited byM.F.Hipkins&N.R.Baker，IRL Press，Oxford Pp 107-108.

实施例25

淀粉含量的确定

使用改进的Lustinec等人所提出的方法来确定番茄茎中的淀粉含量。使用玻璃纤维纸来确定植物组织中的淀粉、支链淀粉、直链淀粉的含量。使用Omnimixer(每5s 12 reps)，和3倍体积的水使番茄茎组织匀浆化。随后用Polytron匀浆机处理30s。匀浆分装成10ml一份，分析前保存于-20℃。分析时，取10ml匀浆解冻并与等体积高氯酸(HClO₄，70％w/w)混合，室温温育20min以溶解淀粉。同时准备一些马铃薯淀粉溶液(浓度范围为0.1-1.0mg/ml)以得到标准曲线。搅拌匀浆(或马铃薯淀粉标准溶液)，并使用一个真空烧瓶和一台吸气器，将匀浆于Whatman GF/A玻璃微纤维纸(直径9.0cm)上过滤。每1ml滤液与3ml碘溶液(8mM I₂、17mM KI、514mM NaCl)混合，4℃温育30min以形成淀粉-碘沉淀。在Whatman GF/A玻璃微纤维纸(直径9.0cm)上收集沉淀，使用一个真空烧瓶和一台吸气器。然后如下洗涤并过滤：10ml碘溶液B(83mM I₂、180mM KI、8％高氯酸(HClO₄))一次，5ml乙醇-NaCl液(67％乙醇、342mM NaCl)一次，3ml乙醇-NaOH液(67％乙醇、250mM NaOH)两次。一旦乙醇挥发干净，从吸气器移走微纤维纸并插入到有可调盖的玻璃管中。取9ml硫酸(0.75M H₂SO₄加入这个玻璃管，然后将管子置于沸水浴30min。三次吸取洗提液每次1ml，加入到玻璃试管中，向每只试管加入1ml 5％苯酚并迅速加入浓硫酸5ml。旋转试管并于室温温育30min以充分显色。同时准备分光光度计空白样：将1ml 0.75M硫酸和1ml 5％苯酚混合，并迅速加入5ml浓硫酸。空白同样于室温混合30min。在480nm处用空白校准光度计，测量所有样品和马铃薯淀粉标准溶液并记录结果。通过马铃薯淀粉标准溶液准备标准曲线，来读出每个样品的淀粉含量。

实施例26

用拟南芥正义衰老-诱导eIF-5A(AteIF-5A)和番茄正义衰老-诱导eIF-5A基因各自转化拟南芥哥伦比亚生态型植株。这些基因在转基因植株整个生命周期中组成型表达。这些植株的开花茎的木质部发育明显提高。见图89-94。

转基因植株和对照植株的种子种于1/2MS培养基琼脂平板上，置于生长室在22℃，80％rh，16h光照/天条件下生长9d。随后，将幼苗移植到有32个生长单元的平台上的商品土壤中，生长48d，维持如上条件。选出主要开花茎进行显微观察。在莲座上方2mm内从主茎上横切，将切面用间苯三酚-HCl染色。我们发现，茎的木质部在这个年龄达到发育的最高峰。对比了转基因植株和对照植株的木质部大小(切面面积)。此外，也测了转基因植株和对照的韧皮部和木髓。

组织面积如下测量。横切面用Zeiss显微镜拍照，显微照片用Photoshop数字化处理。这些照片打印在纸上，并切下不同组织。它们的面积用面积测量计加以测量。为计算每个组织的实际面积，使用以下公式：实际面积＝(单个组织的纸面面积)/(放大倍率)²。

结果显示衰老-诱导eIF-5A也涉及联系于木质部发生作用的细胞程序性死亡。在拟南芥中组成性的反义抑制衰老-诱导AteIF-5A，减小了开花茎的密集度，也减小了木质部细胞层的数目。与此对比，拟南芥或番茄衰老-诱导eIF-5A组成性过量表达的植株的茎平均比相应野生型植株密1.7倍，而且开花茎每个横切面的总木质部面积是野生型植株的2倍。具有过量表达的转基因植株也有显著提高的莲座叶生物量，并比野生型株生长快，这可能反映了营养摄取的增强。当番茄衰老-诱导eIF-5A在拟南芥中过量表达时，也可观察到相同的表型。

这些结果共同表明衰老-诱导eIF-5A不仅调节叶和花的衰老，也参与木质部发生。

实施例27

脱氧羟丁赖氨酸合酶的抑制推迟大气环境下预包装莴苣切段的褐变

可买到的有包装的沙拉通常保存在气调(controlled atmosphere)条件下，其中氧含量水平较大气浓度被大幅度降低，以延长产品的储藏时间。最普通的预包装沙拉的腐败征兆为莴苣切开面的褐变。尽管气调包装可推迟褐变，但这也可导致香气和滋味的变淡。在这项研究里，脱氧羟丁赖氨酸合酶(DHS)的减量调节表现了可作为推迟莴苣切面褐变可选策略的潜力。DHS催化真核起始因子5A(eIF-5A)的活化，eIF-5A作为一个核-质穿梭蛋白对mRNA进行选择。DHS涉及莴苣切面的褐变，因为对DHS表达的抑制(通过反义技术)导致大气条件下褐变起始的显著推迟。具体的，80％的野生型莴苣段在被切下后6d显示褐变，而在来自5个处于表型分离过程中的品系的转基因植株中，平均仅有27％的莴苣段在相同时间褐变，甚至有一些植株不表现褐变。见图51，53。

实施例28

油菜脱氧羟丁赖氨酸合酶的抑制提高种子产量

脱氧羟丁赖氨酸合酶(DHS)催化从无活性真核起始因子5A(eIF-5A)转化为活性形式的两个反应的第一个，而活性eIF-5A促进翻译。从衰老叶cDNA文库中分离一个油菜DHS编码基因的全长cDNA克隆。通过在花椰菜镶嵌病毒(CaMV-35S)启动子控制下反义表达油菜DHS cDNA的3’UTR，在油菜转基因植株中抑制DHS。反义表达该转入基因的植株的叶DHS蛋白水平下降，并表现出叶的自然衰老的推迟。DHS表达抑制也使莲座叶变大了1.5-2倍，提高种子产量90％。油菜中这些抑制DHS引起的多种影响与前文所得的拟南芥的实验结果一致(Wang等2003，Plant Mol.Biol.52：1223-1225)，这提示这个蛋白在植物生长和衰老中扮演重要角色。

实施例29

通过抑制物和反义技术抑制DHS延长康乃馨的花瓶保鲜时间

从康乃馨花瓣中分离编码DHS的全长cDNA克隆(AF396079)。DHS催化从无活性真核起始因子5A(eIF-5A)转化为活性形式的两个反应的第一个。RNA杂交印迹技术分析揭示DHS表达相关于康乃馨花瓣衰老。用DHS反应抑制物处理采摘下的康乃馨花，包括二氨基丁烷(腐胺)，二氨基丙烷，二氨基己烷，二氨基辛烷和精胺，如此延长花的保鲜时间83％。为了更好的评估DHS在康乃馨花衰老中的作用，通过土壤杆菌转化菌株将组成性花椰菜镶嵌病毒双35S启动子控制下的康乃馨DHS cDNA的3’UTR反义序列导入转基因植株，以抑制蛋白的表达。分析三个DHS表达减少的转基因植株品系，发现它们比野生型有相对较长的花瓶保鲜时间。事实上，其中一个品系的花瓶保鲜时间延长程度大于100％。这些发现表明DHS在花的衰老中扮演重要角色。

实施例30

GA3处理拟南芥以挽回抑制脱氧羟丁赖氨酸合酶(DHS)引起的抽苔推迟的表型

脱氧羟丁赖氨酸合酶(DHS)是一种普遍存在的真核起始因子5A(eIF-5A)翻译后活化所必需的酶，它是正常植物生长和发育的基本要素。通过在衰老特异SAG12启动子控制下在拟南芥中反义表达全长拟南芥DHS cDNA，来抑制DHS。表达转入基因的植株的叶中DHS蛋白水平下降，并表现出抽苔推迟和叶的衰老起始的显著推迟(约2-5周)。花苔(bolter)也变短，尽管这并不引起生物量或种子产量的降低。用GA3处理转基因植株可反转抽苔推迟表型。通过在GCT控制下反义表达DHS得到一个相似表型，GCI是一个糖皮质激素-诱导启动子，可被地塞米松(DEX)活化。GA3处理再次反转这个表型，也就是说，GA3处理过的转基因植株抽苔正常，花苔大小正常，叶的衰老起始不推迟。这些结果共同证明DHS通过在拟南芥中活化三个eIF-5A同工型中的一个或更多，影响了GA代谢。

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Park，M.H.，E.C.Wolff，and J.E.Folk.1993.Hypusine：its post-translational formation in eukaryotic initiation factor 5A and its potentialrole in cellular regulation.BioFactor4(2)，95-104.

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Rosorius，O.，B.Reicher，F.Kraetzer，P.Heger，M.-C.Dabauvalle，andJ.Hauber.1999.Nuclear pore localization and nucleocytoplasmic transportof eIF-5A：evidence for direct interaction with the export receptor CRM1.J.Cell Sci.112：2369-2380.

Stotz 2000

Tome，M.E. and E.W.Gemer.1997.Cellular eukaryotic initiationfactor 5A content as a mediator of polyamine effects of growth andapoptosis.Biol.Signals 6，150-156.

Wang，C.Y.and J.E.Baker.1980.Extending vase life of carnationswith minooxyacetic acid，polyamines，EDU，and CCCP.HorSci.15，805-806.

Wang，T.-W.，L.Lu，C.-G.Zhang，C.A.Taylor，and J.E.Thompson.Unpublished a. Suppression of deoxyhypusine synthesieexpression in Arabidopsis thaliana delays leaf secescence.

Wang，T.-W.，W.Wu，C.Taylor，and J.E.Thompson.Unpublished b.Characerization of eukaryotic translatin initiation factor-5A cDNAisoforms from tomato.

Wang，T.-W.，C.-G.Zhang，L.Lu，L.N.Nowack，and J.E.Thompson.Unpublished c. Extending vase life of carnation by deoxyhypusinesynthesis inhibitors and transient transfection with antisense deoxyhypusinsynthase.

Wang，T.-W.，L.Lu，D.Wang，and J.E.Thompson.2001.Isolatin andcharacterization of senescence-inducedd cDNAs ecoding deoxyhypusinesynthase and eukarotic translaton initiation factor 5A from tomato.J.Biol.Chem.276(20)：17541-17549.

Zuk，D.and A.Jacobson.1998.A single amino acid subsititution inyeast eIF-5A result in mRNA stabilization.EMBO J.17(10)：2914-2925.

                              序列表

<110>森尼斯科技术公司(SENESCO TECHNOLOGIES，INC.)

<120>反义寡核苷酸或siRNA抑制eIF-5A1表达的用途

<130>13.947-P

<140>

<141>

<150>10/383,614

<151>2003-03-10

<150>10/277,969

<151>2002-10-23

<150>10/200,148

<151>2002-07-23

<150>10/141,647

<151>2002-05-07

<150>09/909,796

<151>2001-07-23

<150>60/451,677

<151>2003-03-05

<150>60/476,194

<151>2003-06-06

<150>60/504,731

<151>2003-09-22

<160>85

<170>PatentIn Ver.3.2

<210>1

<211>1139

<212>DNA

<213>大鼠种(Rattus sp.)

<220>

<221>CDS

<222>(33)..(494)

<400>1

caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc   53

                                    Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe

                                      1               5

gag aca gga gat gca ggg gcc tca gcc acc ttc cca atg cag tgc tca    101

Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser

         10                  15                  20

gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg ctc aag ggc cgg cca tgt aag    149

Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cyg Lys

     25                  30                  35

atc gtc gag atg tct act tcg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag    197

Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys

 40                  45                  50                  55

gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat    245

Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp

                 60                  65                  70

atc tgc ccg tcg act cat aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat    293

Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn

             75                  80                  85

gat ttc cag ctg att ggc atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag    341

Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln

         90                  95                 100

gac agt ggg gag gta cga gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt    389

Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu

    105                 110                 115

ggc aag gag att gag cag aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc    437

Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile

120                 125                 130                 135

aca gtg ctg tcc gcc atg aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gcc    485

Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala

                140                 145                 150

atg gca aaa taactggctt ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc            534

Met Ala Lys

atgagcctac agaggcccct cccccagctc tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca  594

atttatttga cgttttattt tggttttcct caccccttca aactgtcggg gagaccctgc  654

ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga gggagccatg gccttggtga agctacctgc  714

ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc  774

cctctccctt tttcttttta attcaatttg gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg  834

gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca tctggtcccc tgttctccat agtccttcac  894

ccccaagcac cactgacaga ctggggacca gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa  954

acccctctat aggggtgaca agaagaggag ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc  1014

atctgggaag gccttgcccc catgggcttt accctttcct gtgggctttc tccctgacac   1074

atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaaaa   1134

aaaaa                                                               1139

<210>2

<211>154

<212>PRT

<213>大鼠种(Rattus sp.)

<400>2

Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala

  1               5                  10                  15

Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val

             20                  25                  30

Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val G1u Met Ser Thr Ser Lys Thr

         35                  40                  45

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe

     50                  55                  60

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp

 65                  70                  75                  80

Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp

                 85                  90                  95

Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu

            100                 105                 110

Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp

        115                 120                  125

Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu

     130                135                 140

Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys

145                 150

<210>3

<211>462

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>3

atggcagatg acttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg  60

cagtgctcag cattacgtaa gaatggcttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc  120

gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag cacggccacg ccaaggtcca tctggttggt 180

attgacatct ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcaactca taatatggat 240

gtccccaaca tcaaaaggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatca 300

ctgctccagg acagcgggga ggtacgagag gaccttcgtc tccctgaggg agaccttggc 360

aaggagattg agcagaagta cgactgtgga gaagagatcc tgatcacggt gctgtctgcc 420

atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa                    462

<210>4

<211>460

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>4

atggcagacg aaattgattt cactactgga gatgccgggg cttccagcac ttaccctatg 60

cagtgctcgg ccttgcgcaa aaacggcttc gtggtgctca aaggacgacc atgcaaaata 120

gtggagatgt caacttccaa aactggaaag catggtcatg ccaaggttca ccttgttgga 180

attgatattt tcacgggcaa aaaatatgaa gatatttgtc cttctactca caacatggat 240

gttccaaata ttaagagaaa tgattatcaa ctgatatgca ttcaagatgg ttacctttcc 300

ctgctgacag aaactggtga agttcgtgag gatcttaaac tgccagaagg tgaactaggc 360

aaagaaatag agggaaaata caatgcaggt gaagatgtac aggtgtctgt catgtgtgca 420

atgagtgaag aatatgctgt agccataaaa ccctgcaaat                       460

<210>5

<211>462

<212>DNA

<213>大鼠种(Rattus sp.)

<400>5

atggcagatg atttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg  60

cagtgctcag cattacgtaa gaatggtttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc  120

gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag catggccatg ccaaggtcca tctggttggc  180

attgacattt ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcgactca taatatggat  240

gtccccaaca tcaaacggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatcc  300

ctgctccagg acagtgggga ggtacgagag gaccttcgtc tgcctgaagg agaccttggc  360

aaggagattg agcagaagta tgactgtgga gaagagatcc tgatcacagt gctgtctgcc  420

atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa                     462

<210>6

<211>606

<212>DNA

<213>大鼠种(Rattus sp.)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(453)

<400>6

gct gtg tat tat tgg gcc cat aag aac cac ata cct gtg ctg agt cct    48

Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His Ile Pro Val Leu Ser Pro

  1               5                  10                  15

gca ctc aca gac ggc tca ctg ggt gac atg atc ttt ttc cat tcc tat   96

Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Ile Phe Phe His Ser Tyr

             20                  25                  30

aaa aac cca ggc ttg gtc ctg gac atc gtt gaa gac ctg cgg ctc atc   144

Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp Ile Val Glu Asp Leu Arg Leu Ile

         35                  40                  45    

aac atg cag gcc att ttc gcc aag cgc act ggg atg atc atc ctg ggt   192

Asn Met Gln Ala Ile Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly

     50                  55                  60

gga ggc gtg gtc aag cac cac atc gcc aat gct aac ctc atg cgg aat   240

Gly Gly Val Val Lys His His Ile Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn

 65                  70                  75                  80

gga gct gac tac gct gtt tat atc aac aca gcc cag gag ttt gat ggc   288

Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly

                 85                  90                  95

tca gac tca gga gcc cgg cca gat gag gct gtc tcc tgg ggc aag atc   336

Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile

            100                 105                 110

cgg atg gat gca cag cca gta aag gtc tat gct gat gca tct ctg gtt   384

Arg Met Asp Ala Gln Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val

        115                 120                 125

ttc ccc ttg ctg gtg gct gag aca ttc gcc caa aag gca gat gcc ttc   432

Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gln Lys Ala Asp Ala Phe

    130                 135                 140

aga gct gag aag aat gag gac tgagcagatg ggtaaagacg gaggcttctg      483

Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp

145                 150

ccacaccttt atttattatt tgcataccaa cccctcctgg gccctctcct tggtcagcag 543

catcttgaga ataaatggcc tttttgttgg tttctgtaaa aaaaggactt taaaaaaaaa 603

aaa                                                               606

<210>7

<211>151

<212>PRT

<213>大鼠种(Rattus sp.)

<400>7

Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His Ile Pro Val Leu Ser Pro

  1               5                  10                  15

Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Ile Phe Phe His Ser Tyr

             20                  25                  30

Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp Ile Val Glu Asp Leu Arg Leu Ile

         35                  40                  45

Asn Met Gln Ala Ile Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly

     50                  55                  60

Gly Gly Val Val Lys His His Ile Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn

 65                  70                  75                  80

Gly Ala Asp Tyr Ala Va1 Tyr Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly

                 85                  90                  95

Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile

            100                 105                 110

Arg Met Asp Ala Gln Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val

        115                 120                 125

Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gln Lys Ala Asp Ala Phe

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp

145                 150

<210>8

<211>453

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>8

tccgtgtatt actgggccca gaagaaccac atccctgtgt ttagtcccgc acttacagac 60

ggctcgctgg gcgacatgat cttcttccat tcctacaaga acccgggcct ggtcctggac 120

atcgttgagg acctgaggct catcaacaca caggccatct ttgccaagtg cactgggatg 180

atcattctgg gcgggggcgt ggtcaagcac cacattgcca atgccaacct catgcggaac 240

ggggccgact acgctgttta catcaacaca gcccaggagt ttgatggctc tgactcaggt 300

gcccgaccag acgaggctgt ctcctggggc aagatccggg tggatgcaca gcccgtcaag 360

gtctatgctg acgcctccct ggtcttcccc ctgcttgtgg ctgaaacctt tgcccagaag 420

atggatgccttcatgcatga gaagaacgag gac                               453

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成引物

<220>

<221>modified_base

<222>(12)

<223>a、t、c或g

<400>9

tcsaarachg gnaagcaygg                                              20

<210>10

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成引物

<400>10

gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt                     42

<210>11

<211>972

<212>DNA

<213>大鼠种(Rattus sp.)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(327)

<400>11

tcg aag acc ggt aag cac ggc cat gcc aag gtc cat ctg gtt ggt att    48

Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile

  1               5                  10                  15

gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat atc tgc ccg tcg act cat    96

Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His

             20                  25                  30

aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat gat ttc cag ctg att ggc    144

Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly

         35                  40                  45

atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag gac agt ggg gag gta cga    192

Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg

     50                  55                  60

gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt ggc aag gag att gag cag    240

Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln

 65                  70                  75                  80

aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc aca gtg ctg tcc gcc atg    288

Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met

                 85                  90                  95

aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gcc atg gca aaa taactggctt     337

Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys

            100                 105

ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc atgagcctac agaggcccct cccccagctc  397

tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca atttatttga cgttttattt tggttttcct  457

caccccttca aactgtcggg gagaccctgc ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga  517

gggagccatg gccttggtga agctacctgc ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag  577

ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc cctctccctt tttcttttta attcaatttg  637

gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca  697

tctggtcccc tgttctccat agtccttcac ccccaagcac cactgacaga ctggggacca  757

gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa acccctctat aggggtgaca agaagaggag  817

ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc atctgggaag gccttgcccc catgggcttt  877

accctttcct gtgggctttc tccctgacac atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact  937

acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa                             972

<210>12

<211>109

<212>PRT

<213>大鼠种(Rattus sp.)

<400>12

Ser Lyr Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile

  1               5                  10                  15

Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His

             20                  25                  30

Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly

         35                  40                  45

Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg

     50                  55                  60

Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln

 65                  70                  75                  80

Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met

                 85                  90                  95

Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys

            100                 105

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成引物

<400>13

caggtctaga gttggaatcg aagc                                         24

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成引物

<400>14

atatctcgag ccttgattgc aacagctgcc                                   30

<210>15

<211>489

<212>DNA

<213>大鼠种(Rattus sp.)

<220>

<221>CDS

<222>(33)..(485)

<400>15

caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc   53

                                    Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe

                                      1               5

gag aca gga gat gca ggg gcc tca gcc acc ttc cca atg cag tgc tca   101

Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser

         10                  15                  20

gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg ctc aag ggc cgg cca tgt aag   149

Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys

     25                  30                  35

atc gtc gag atg tct act tcg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag    197

Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys

 40                  45                  50                  55

gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat    245

Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp

                 60                  65                  70

atc tgc ccg tcg act cat aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat    293

Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn

             75                  80                  85

gat ttc cag ctg att ggc atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag    341

Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln

         90                  95                 100

gac agt ggg gag gta cga gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt    389

Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu

    105                 110                 115

ggc aag gag att gag cag aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc    437

Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lye Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile

120                 125                 130                 135

aca gtg ctg tcc gcc atg aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gct    485

Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala

                140                 145                 150

cgag                                                               489

<210>16

<211>151

<212>PRT

<213>大鼠种(Rattus sp.)

<400>16

Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala

  1               5                  10                  15

Thr Phe Pro Met Gln Cys ger Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val

             20                  25                  30

Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr

         35                  40                  45

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe

     50                  55                  60

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp

 65                  70                  75                  80

Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp

                 85                  90                  95

Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu

            100                 105                 110

Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp

        115                 120                 125

Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu

    130                 135                 140

Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala

145                 150

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成引物

<400>17

gtctgtgtat tattgggccc                                              20

<210>18

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成引物

<400>18

gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt                     42

<210>19

<211>1299

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>19

ggcacgaggg cggcggcggc ggtagaggcg gcggcggcgg cggcagcggg ctcggaggca  60

gcggttgggc tcgcggcgag cggacggggt cgagtcagtg cgttcgcgcg agttggaatc  120

gaagcctctt aaaatggcag atgacttgga cttcgagaca ggagatgcag gggcctcagc  180

caccttccca atgcagtgct cagcattacg taagaatggc tttgtggtgc tcaaaggccg  240

gccatgtaag atcgtcgaga tgtctacttc gaagactggc aagcacggcc acgccaaggt  300

ccatctggtt ggtattgaca tctttactgg gaagaaatat gaagatatct gcccgtcaac  360

tcataatatg gatgtcccca acatcaaaag gaatgacttc cagctgattg gcatccagga  420

tgggtaccta tcactgctcc aggacagcgg ggaggtacga gaggaccttc gtctccctga  480

gggagacctt ggcaaggaga ttgagcagaa gtacgactgt ggagaagaga tcctgatcac  540

ggtgctgtct gccatgacag aggaggcagc tgttgcaatc aaggccatgg caaaataact  600

ggctcccagg atggcggtgg tggcagcagt gatcctctga acctgcagag gccccctccc  660

cgagcctggc ctggctctgg cccggtccta agctggactc ctcctacaca atttatttga  720

cgttttattt tggttttccc caccccctca atctgtcggg gagcccctgc ccttcaccta  780

gctcccttgg ccaggagcga gcgaagctgt ggccttggtg aagctgccct cctcttctcc  840

cctcacacta cagccctggt gggggagaag ggggtgggtg ctgcttgtgg tttagtcttt  900

tttttttttt tttttttttt tttaaattca atctggaatc agaaagcggt ggattctggc  960

aaatggtcct tgtgccctcc ccactcatcc ctggtctggt cccctgttgc ccatagccct  1020

ttaccctgag caccacccca acagactggg gaccagcccc ctcgcctgcc tgtgtctctc  1080

cccaaacccc tttagatggg gagggaagag gaggagaggg gaggggacct gccccctcct  1140

caggcatctg ggagggccct gcccccatgg gctttaccct tccctgcggg ctctctcccc  1200

gacacatttg ttaaaatcaa acctgaataa aactacaagt ttaatatgaa aaaaaaaaaa  1260

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa                         1299

<210>20

<211>462

<212>DNA

<213>大鼠种(Rattus sp.)

<400>20

atggcagatg atttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg  60

cagtgctcag cattacgtaa gaatggtttt gtggtgctca agggccggcc atgtaagatc  120

gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag catggccatg ccaaggtcca tctggttggt  180

attgatattt ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcgactca taacatggat  240

gtccccaaca tcaaaaggaa tgatttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatcc  300

ctgctccagg acagtgggga ggtacgagag gaccttcgtc tgcctgaggg agaccttggc  360

aaggagattg agcagaagta tgactgtgga gaagagatcc tgatcacagt gctgtccgcc  420

atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa                     462

<210>21

<211>l54

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>21

Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala

  1               5                  10                  15

Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val

             20                  25                  30

Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr

         35                  40                  45

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe

     50                  55                  60

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp

 65                  70                  75                  80

Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp

                 85                  90                  95

Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu

            100                 105                 110

Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp

        115                 120                 125

Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu

    130                 135                 140

Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys

145                 150

<210>22

<211>153

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>22

Met Ala Asp Glu Ile Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser

  1               5                  10                  15

Thr Tyr Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val

             20                  25                  30

Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr

         35                  40                  45

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe

     50                  55                  60

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp

 65                  70                  75                  80

Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp

                 85                  90                  95

Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu

            100                 105                 110

Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn

        115                 120                 125

Ala Gly Glu Asp Val Gln Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu

    130                 135                 140

Tyr Ala Val Ala Ile Lys Pro Cys Lys

145                 150

<210>23

<211>154

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>23    

Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala

  1               5                  10                  15

Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val

             20                  25                  30

Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr

         35                  40                  45

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Va1 Gly Ile Asp Ile Phe

     50                  55                  60

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp

 65                  70                  75                  80

Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp

                 85                  90                  95

Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu

            100                 105                 110

Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp

        115                 120                 125

Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu

    130                 135                 140

Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys

145                 150

<210>24

<211>153

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>24

Met Ala Asp Glu Ile Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly A1a Ser Ser

  1               5                  10                      15

Thr Tyr Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val

             20                  25                  30

Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr

         35                  40                  45

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe

     50                  55                  60

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp

 65                  70                  75                  80

Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp

                 85                  90                  95

Gly Cys Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu

            100                 105                 110

Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn

        115                 120                 125

Ala Gly Glu Asp Val Gln Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu

    130                 135                 140

Tyr Ala Val Ala Ile Lys Pro Cys Lys

145                 150

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>25

gacttggact tcgagacagg                                              20

<210>26

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>26

gcacggccac gccaaggtc                                               19

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>27

ggacagcggg gaggtacgag                                              20

<210>28

<211>153

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：说明性共有序列

<400>28

Met Ala Asp Glu Ile Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser

  1               5                  10                  15

Thr Tyr Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val

             20                  25                  30

Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr

         35                  40                  45

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe

     50                  55                  60

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp

 65                  70                  75                  80

Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp

                 85                  90                  95

Gly Cys Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu

            100                 105                 110

Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn

        115                 120                 125

Ala Gly Glu Asp Val Gln Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu

    130                 135                 140

Tyr Ala Val Ala Ile Lys Pro Cys Lys

145                 150

<210>29

<211>1309

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>29

ggcacgaggg tagaggcggc ggcggcggcg gcagcgggct cggaggcagc ggttgggctc  60

gcggcgagcg gacggggtcg agtcagtgcg ttcgcgcgag ttggaatcga agcctcttaa  120

aatggcagat gacttggact tcgagacagg agatgcaggg gcctcagcca ccttcccaat  180

gcagtgctca gcattacgta agaatggctt tgtggtgctc aaaggccggc catgtaagat  240

cgtcgagatg tctacttcga agactggcaa gcacggccac gccaaggtcc atctggttgg  300

tattgacatc tttactggga agaaatatga agatatctgc ccgtcaactc ataatatgga  360

tgtccccaac atcaaaagga atgacttcca gctgattggc atccaggatg ggtacctatc  420

actgctccag gacagcgggg aggtacgaga ggaccttcgt ctccctgagg gagaccttgg  480

caaggagatt gagcagaagt acgactgtgg agaagagatc ctgatcacgg tgctgtctgc  540

catgacagag gaggcagctg ttgcaatcaa ggccatggca aaataactgg ctcccaggat  600

ggcggtggtg gcagcagtga tcctctgaac ctgcagaggc cccctccccg agcctggcct  660

ggctctggcc cggtcctaag ctggactcct cctacacaat ttatttgacg ttttattttg  720

gttttcccca ccccctcaat ctgtcgggga gcccctgccc ttcacctagc tcccttggcc  780

aggagcgagc gaagctgtgg ccttggtgaa gctgccctcc tcttctcccc tcacactaca  840

gccctggtgg gggagaaggg ggtgggtgct gcttgtggtt tagtcttttt tttttttttt  900

tttttttttt aaattcaatc tggaatcaga aagcggtgga ttctggcaaa tggtccttgt  960

gccctcccca ctcatccctg gtctggtccc ctgttgccca tagcccttta ccctgagcac  1020

caccccaaca gactggggac cagccccctc gcctgcctgt gtctctcccc aaaccccttt  1080

agatggggag ggaagaggag gagaggggag gggacctgcc ccctcctcag gcatctggga  1140

gggccctgcc cccatgggct ttacccttcc ctgcgggctc tctccccgac acatttgtta  1200

aaatcaaacc tgaataaaac tacaagttta atatgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa  1260

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa              1309

<210>30

<211>23

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>30

aaaggaatga cttccagctg att                                          23

<210>31

<211>23

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>31

aagatcgtcg agatgtctac ttc                                          23

<210>32

<211>23

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>32

aaggtccatc tggttggtat tga                                          23

<210>33

<211>23

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>33

aagctggact cctcctacac aat                                          23

<210>34

<211>23

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>34

aaagtcgacc ttcagtaagg att                                          23

<210>35

<211>20

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>35

cctgtctcga agtccaagtc                                              20

<210>36

<211>20

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>36

gacttggact tcgagacagg                                              20

<210>37

<211>20

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>37

ggaccttggc gtggccgtgc                                              20

<210>38

<211>20

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>38

gcacggccac gccaaggtcc                                              20

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>39

ctcgtacctc cccgctctcc                                              20

<210>40

<211>19

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>40

ggacagcggg gaggtacga                                               19

<210>41

<211>465

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>41

atggcagatg acttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg  60

cagtgctcag cattacgtaa gaatggcttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc  120

gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag cacggccacg ccaaggtcca tctggttggt  180

attgacatct ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcaactca taatatggat  240

gtccccaaca tcaaaaggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatca  300

ctgctccagg acagcgggga ggtacgagag gaccttcgtc tccctgaggg agaccttggc  360

aaggagattg agcagaagta cgactgtgga gaagagatcc tgatcacggt gctgtctgcc  420

atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aataa                  465

<210>42

<211>462

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>42

atggcagacg aaattgattt cactactgga gatgccgggg cttccagcac ttaccctatg  60

cagtgctcgg ccttgcgcaa aaacggcttc gtggtgctca aaggacgacc atgcaaaata  120

gtggagatgt caacttccaa aactggaaag catggtcatg ccaaggttca ccttgttgga  180

attgatattt tcacgggcaa aaaatatgaa gatatttgtc cttctactca caacatggat  240

gttccaaata ttaagagaaa tgattatcaa ctgatatgca ttcaagatgg ttacctttcc  300

ctgctgacag aaactggtga agttcgtgag gatcttaaac tgccagaagg tgaactaggc  360

aaagaaatag agggaaaata caatgcaggt gaagatgtac aggtgtctgt catgtgtgca  420

atgagtgaag aatatgctgt agccataaaa ccctgcaaat aa                     462

<210>43

<211>154

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>43

Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala

  1               5                  10                  15

Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val

             20                  25                  30

Leu Lys Gly Trp Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Ala Ser Lys Thr

         35                  40                  45

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe

     50                  55                  60

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp

 65                  70                  75                  80

Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp

                 85                  90                  95

Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Pro Glu Asp Leu

            100                 105                 110

Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp

        115                 120                 125

Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Leu Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu

    130                 135                 140

Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys

145                 150

<210>44

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>44

aaaggaatga cttccagctg a                                            21

<210>45

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>DNA/RNA结合分子说明：合成寡核苷酸

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>45

aaaggaauga cuuccagcug att                                          23

<210>46

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>DNA/RNA结合分子说明：合成寡核苷酸

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>46

ucagcuggaa gucauuccuu utt                                          23

<210>47

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>47

aagatcgtcg agatgtctac t                                            21

<210>48

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>DNA/RNA结合分子说明：合成寡核苷酸

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>48

aagaucgucg agaugucuac utt                                          23

<210>49

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>DNA/RNA结合分子说明：合成寡核苷酸

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>49

aguagacauc ucgacgaucu utt                                          23

<210>50

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>50

aaggtccatc tggttggtat t                                            21

<210>51

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>DNA/RNA结合分子说明：合成寡核苷酸

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>51

aagguccauc ugguugguau utt                                          23

<210>52

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>DNA/RNA结合分子说明：合成寡核苷酸

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>52

aauaccaacc agauggaccu utt                                          23

<210>53

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>53

aagctggact cctcctacac a                                            21

<210>54

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>DNA/RNA结合分子说明：合成寡核苷酸

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>54

aagcuggacu ccuccuacac att                                          23

<210>55

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>DNA/RNA结合分子说明：合成寡核苷酸

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>55

uguguaggag gaguccagcu utt                                          23

<210>56

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>56

aaagtcgacc ttcagtaagg a                                            21

<210>57

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>DNA/RNA结合分子说明：合成寡核苷酸

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>57

aaagucgacc uucaguaagg att                                          23

<210>58

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>DNA/RNA结合分子说明：合成寡核苷酸

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>58

uccuuacuga aggucgacuu utt                                          23

<210>59

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成引物

<400>59

gccaagctta atggcagatg atttgg                                       26

<210>60

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成引物

<400>60

ctgaattcca gttattttgc catgg                                        25

<210>61

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成引物

<400>61

aatgaattcc gccatgacag aggaggc                                      27

<210>62

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成引物

<400>62

gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt                     42

<210>63

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>63

cctgtctcga agtccaagtc                                              20

<210>64

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>64

ggaccttggc gtggccgtgc                                              20

<210>65

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>65

ctcgtacctc cccgctctcc                                              20

<210>66

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>66

cgtaccggta cggttccagg                                              20

<210>67

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>67

ggaccttggc gtggccgtgc                                              20

<210>68

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成肽

<400>68

Cys Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr

  1               5                  10                  15

Asp

<210>69

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>69

aaaggaatga cttccagctg acctgtctc                                    29

<210>70

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>70

aatcagctgg aagtcattcc tcctgtctc                                    29

<210>71

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>71

aagatcgtcg agatgtctac tcctgtctc                                    29

<210>72

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>72

aaagtagaca tctcgacgat ccctgtctc                                    29

<210>73

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>73

aaggtccatc tggttggtat tcctgtctc                                    29

<210>74

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>74

aaaataccaa ccagatggac ccctgtctc                                    29

<210>75

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>75

aagctggact cctcctacac acctgtctc                                    29

<210>76

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>76

aatgtgtagg aggagtccag ccctgtctc                                    29

<210>77

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>77

aaagtcgacc ttcagtaagg acctgtctc                                    29

<210>78

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>78

aatccttact gaaggtcgac tcctgtctc                                    29

<210>79

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>79

aagcuggacu ccuccuacac                                              20

<210>80

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>80

aaacacaucc uccucagguc g                                            21

<210>81

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>81

aaaggaatga cttccagctg a                                            21

<210>82

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>82

aagatcgtcg agatgtctac t                                            21

<210>83

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>83

aaggtccatc tggttggtat t                                            21

<210>84

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>84

aagctggact cctcctacac a                                            21

<210>85

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：合成寡核苷酸

<400>85

aaagtcgacc ttcagtaagg a                                            21