公开/公告号CN1856343A
专利类型发明专利
公开/公告日2006-11-01
原文格式PDF
申请/专利权人 塞格日斯探索股份有限公司;
申请/专利号CN200480027856.2
发明设计人 M·汉森;
申请日2004-09-27
分类号B01D9/00;
代理机构上海专利商标事务所有限公司;
代理人范征
地址 美国加利福尼亚州
入库时间 2023-12-17 17:51:11
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2011-01-05
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):B01D9/00 授权公告日:20080903 终止日期:20091027 申请日:20040927
专利权的终止
2008-09-03
授权
授权
2006-12-27
实质审查的生效
实质审查的生效
2006-11-01
公开
公开
发明领域
本发明总地涉及结晶学和蛋白质晶体生长。更具体说，本发明涉及促进完整膜蛋白晶体生长的装置和方法。
发明背景
确定蛋白质结构是现代药物发现和分子生物学中的重要步骤。采用X射线或电子结晶学技术，实际上可从衍射数据在原子水平分辨率上确定生物大分子如蛋白质、核酸及其各种复合物的三维结构。这种结构信息使我们加深了对重要生物过程的理解，也可指导药物设计。
确定靶大分子的晶体结构的第一个步骤是生长出大的、衍射良好的大分子结晶。因为结构信息对于药物开发的重要性，收集和分析衍射数据的技术变得更加快速和自动化。然而，蛋白质晶体生长已经成为确定结构过程中的限速步骤。据证明，当传统的晶体生长方法应用于许多生物大分子时不成功或效率低。具体说，自动化技术难以处理完整膜蛋白，因为它们需要晶体生长介质中存在去污剂和脂质分子。
蒸汽扩散是最广泛采用的蛋白质结晶技术。在蒸气扩散中，让含有大分子、稳定缓冲液、沉淀剂(percipient)和结晶助剂的液滴在暴露于较大贮池的封闭系统中平衡。该贮池通常与结晶液滴含有相同的成分(除大分子以外)，但浓度较高，以使水优选从液滴中蒸发。通过将液滴悬挂在玻璃盖板上(悬滴法)或通过让液滴位于贮池溶剂(液面)水平之上的基座上(直滴法(the sitting drop method))将该液滴与结晶溶剂贮池分开。一定时间后，结晶液滴和贮池溶液通过蒸气扩散平衡。获得大分子的过饱和浓度，导致液滴中的大分子样品结晶。
膜蛋白一般高度疏水，因此难于结晶。膜蛋白也趋于无定形聚集，而不形成良序三维结晶。脂质立方相(Lipidic Cubic Phase，LCP)结晶等技术已成功用于通过将膜蛋白样品与液体混合形成蛋白和脂质的凝胶样乳液来结晶完整膜蛋白(Landau，EM和JP Rosenbusch，PNAS，1996，93：14532-14535)。该乳液中的脂质形成立方体形三维晶格，其中疏水膜蛋白可形成三维结晶。
因此，晶体生长介质中需要去污剂和脂质分子使完整膜蛋白的结晶变得复杂。虽然自动化技术能够使生物分子的高通量结晶明显生长，但是去污剂和脂质的存在阻碍了大部分高通量技术。一般用直滴技术进行快速结晶筛选，在表面如塑料或玻璃上形成排列的(in arrays)结晶。尝试用高通量结晶技术结晶完整膜蛋白产生的结果令人失望，因为将膜蛋白维持在溶解状态需要去污剂，以及脂质，这会明显降低结晶液滴的表面张力。该液滴常常完全覆盖塑料表面，抑制结晶。
而且，希望结晶液滴与其所在表面的接触面最小化，因为有提示说表面和液体界面是晶体生长随机性的主要来源。具体说，由于灰尘累积和其它表面变化，表面/液体界面非常有助于非均质性。因此，液滴和表面之间接触面越小导致结晶越好。
据提示，烷基乙烯酮二聚物(AKD)可用于可溶性大分子的结晶表面(Shibuichi等，1996，J.Phys.Chem.50：19512-17)，但不用于完整膜蛋白。烷基乙烯酮二聚物产生防水性的能力是造纸工业中熟知的，其中它用作防湿剂。由于这种防水性，Fujii和Hirayama用烷基乙烯酮二聚物涂覆的表面来结晶水溶性蛋白质溶菌酶(I.Fujii和N.Hirayama，Acta Crystallogr D.Biol.Crystallogr.1999，55：1247-49)。烷基乙烯酮二聚物在冷却时自发形成分形结构。Fujii和Hirayama证明了这些分形表面增大了液滴的表面接触角，从而使液滴和表面的接触面最小化。
然而，未证明烷基乙烯酮二聚物表面能够一致有效地使溶于去污剂和脂质的完整膜蛋白结晶。当结晶液滴中存在去污剂时，采用烷基乙烯酮二聚物涂覆表面和去污剂的实验在防止表面变湿并促进结晶方面有很大的可变性。这种可变性使纯烷基乙烯酮二聚物涂层不适合用于大部分结晶目的，包括高通量方法。而且，将烷基乙烯酮二聚物涂层用于结晶生物分子比常规的硅化更加昂贵，即使是用于结晶可溶的生物分子。
因此，需要建立能够使结晶液滴和液滴所在表面之间的相互作用最小化的表面或表面涂层。更具体说，需要这样的表面，即使在表面活性去污剂和脂质存在下这种表面也可产生完整膜蛋白的高质量晶体。
因此，本发明涉及建立和使用包含或涂覆有掺有成核剂的烷基乙烯酮二聚物以提高内膜蛋白结晶的表面。
发明概要
本发明一方面提供了用于促进完整膜蛋白结晶的装置，它包括表面和掺有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物涂层。在本发明的一些实施方式中，成核化合物是二烷基酮。
本发明的另一实施方式考虑采用硬脂酰乙烯酮二聚物作为烷基乙烯酮二聚物。也考虑将二硬脂酰酮用作成核化合物。
本发明另一方面提供了制备表面的方法，以通过用掺有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物涂覆表面来促进完整膜蛋白的结晶。
该方法的另一实施方式考虑采用硬酯酰乙烯酮二聚物作为烷基乙烯酮二聚物。也考虑将二硬脂酰酮用作成核化合物。
在本发明的一些实施方式中，通过气相沉积施加涂层。
本发明另一方面提供了一种结晶完整膜蛋白的方法，该方法通过将含有完整膜蛋白的液滴溶液施加于用掺有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物涂覆的表面上来结晶完整膜蛋白。
本发明的另一实施方式考虑采用硬酯酰乙烯酮二聚物作为烷基乙烯酮二聚物。也考虑将二硬酯酰酮作为成核化合物。在一些变化方式中，将含有完整膜蛋白的液滴施加于涂覆表面顶部作为直滴。在另一变化方式中，将含有完整膜蛋白的液滴施加于涂覆表面作为悬滴。
附图简述
图1显示化合物1，烷基乙烯酮二聚物(AKD)
图2说明5μl水滴在各种表面上。上排(A-C)显示水滴的俯视图，下排(D-F)显示了水滴的侧视图。左边是未处理玻璃(A、D)，中间是硅化玻璃(B、E)，右边是用掺有二硬酯酰酮的硬酯酰乙烯酮二聚物涂覆的玻璃(C、F)。
图3说明5μl含有0.05％DDM去污剂的水滴在各种表面上。上排(A-C)显示水滴的俯视图，下排(D-F)显示了水滴的侧视图。左边是未处理玻璃(A、D)，中间是硅化玻璃(B、E)，右边是用掺有二硬酯酰酮的硬酯酰乙烯酮二聚物涂覆的玻璃(C，F)。
图4显示化合物2，二烷基酮(DAK)
图5显示了SKD分形表面的衍射图案。
发明详述
以下实施例旨在说明本发明的某些原理。这些实施例不旨在将所要求的权利范围限制于任何具体实施例。根据本说明书、任何现有技术和本领域普通技术人员的知识，应以最广泛的合理解释来理解权利要求书。本领域技术人员将容易地理解，可用以下说明书衍生出许多改变形式。
图1显示了烷基乙烯酮二聚物的分子结构图。可加热烷基乙烯酮二聚物并让其形成到表面中。而且，烷基乙烯酮二聚物表面在冷却时自发形成分形结构。这些分形表面的表面粗糙度高，从而产生超级防水性。接触角是防水性或可湿性的一个指标。提高的表面粗糙度导致液滴和液滴所在分形表面之间的接触角较大。表面接触角越大，表面上的液滴越呈球形并且液滴和表面之间的接触面越小。图2中显示了这种效果。
图2显示置于各种表面上的5μl水滴。在未处理玻璃上，表面接触角小于90度，如图2A和2D所示。在涂覆有硅(硅化)的玻璃上，水的表面接触角大于140度，如图2B和2E所示。这与涂覆有烷基乙烯酮二聚物，二硬酯酰乙烯酮的玻璃相当。图2C和2F说明二硬酯酰乙烯酮二聚物涂覆的表面上接触角大。硅化和烷基乙烯酮二聚物涂覆的表面与纯水水滴的接触角大。
如上所述，接触角是表面促进大分子如蛋白质结晶的能力的指标。接触角越大，液滴越呈球形，从而使表面/液体界面的干扰效果最小化。因此，可生长较高质量的晶体。
接触角和表面的这种关系在高通量结晶的新兴领域中尤其重要。因此，高通量结晶是应用本发明的好例子。一般地，高通量技术采用直滴蒸气扩散形式，其中含有待结晶大分子的液滴直立在表面顶部。大部分情况下，优选将塑料，而非硅化玻璃作为结晶表面。将高通量结晶技术用于完整膜蛋白的尝试产生的结果令人失望，因为需要水性介质中存在去污剂。去污剂和脂质对于完整膜蛋白的结晶是必需，因为需要去污剂胶束将大分子维持于溶解状态，需要脂质来防止大分子通过质量作用脱脂。
脂质和去污剂的存在也降低了结晶液滴的表面张力，使液滴和表面之间的接触角明显减小。如图3所示。图3显示置于各种表面上的5μl含有0.05％十二烷基麦芽苷(DDM)去污剂的水滴。在未处理玻璃上，表面接触角小于90度，如图3A和3D所示。在涂覆有硅(硅化)的玻璃上，水的表面接触角也小于90度，如图3B和3E所示。然而，在涂覆有掺有二烷基酮的烷基乙烯酮二聚物(掺有二硬酯酰乙烯酮的硬酯酰乙烯酮二聚物)的玻璃上，表面角大于150度。图3C和3F说明在二硬酯酰乙烯酮二聚物涂覆的表面上接触角大。
因此，烷基乙烯酮二聚物可降低可湿性，并从而增大结晶液滴的接触角，即使在使用去污剂时。具体说，硬酯酰乙烯酮二聚物是烷基乙烯酮二聚物，它在临界胶束浓度或临界胶束浓度以上在去污剂的存在下促进表面可湿性的降低。然而，单独的纯烷基乙烯酮二聚物涂层是不足够的。高纯烷基乙烯酮二聚物涂层在分形表面中的可变性太高。这种可变性在去污剂存在下导致不一致的可湿性。
当采用去污剂时，仅当对硬酯酰乙烯酮二聚物混合物的组成作出修改时能够实现烷基乙烯酮二聚物一致的超级防水特性。因此，烷基乙烯酮二聚物涂层应该“掺”有一些改性化合物，以获得与含有去污剂的液滴一致的结果。在采用硬酯酰乙烯酮二聚物涂层的实验中，含有去污剂的液滴表面可湿性的可变性(接触角)是因为硬酯酰乙烯酮二聚物样品中可变地存在少量二硬酯酰酮杂质。二硬酯酰酮是硬酯酰乙烯酮二聚物的水解产物；重复将液体硬酯酰乙烯酮二聚物暴露于大气会提高二硬酯酰酮的相对比例。图4显示了二烷基酮的分子模型。二硬酯酰酮是二烷基酮的一种形式。二硬酯酰酮和硬酯酰乙烯酮二聚物的比例能够改变表面可湿性和产生的接触角。
掺杂效应的确切原因未知。我们假设，二硬酯酰酮污染物相对于硬酯酰乙烯酮二聚物的熔化温度越高，产生的分形表面的图案就越规则。因此，二硬酯酰酮起到形成硬酯酰乙烯酮二聚物分形结构的成核点的作用。通过提高二硬酯酰酮的相对百分数，也提高了成核点的相对数量，这进而提高所得表面的总复杂性，因为最终混合了多成核点引申出的许多不同分形形成生长图案。不管是什么原因，这说明不同应用中可存在二硬酯酰酮/硬酯酰乙烯酮二聚物的最佳比例，对于结晶的各个类型的完整膜蛋白也存在二硬酯酰酮/硬酯酰乙烯酮二聚物的最佳比例，因为表面的复杂性可促进蛋白结晶成核和有序生长。
烷基乙烯酮二聚物混合物可掺有能改变所得表面的复杂性的任何其它混合物。例如，可将烷基链长度改变的化合物如油酰乙烯酮二聚物引入混合物，以选择性改变分形生长图案，从而降低表面复杂性。
本发明考虑采用掺有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物的混合物，以建立其上可以生长完整膜蛋白结晶的表面。如上所述，可根据任何具体应用确定二聚物和成核化合物(或潜在化合物)的比例。本发明也考虑建立跨表面的(across the surface)烷基乙烯酮二聚物和成核化合物的比例不同的表面。当结晶不同大分子时，这种表面有助于优化比例。可将任何形式的烷基乙烯酮二聚物与能够改变烷基乙烯酮二聚物表面的分形图案的任何成核化合物联合用于本发明。掺有二硬酯酰酮的硬酯酰乙烯酮二聚物是本发明所考虑的烷基乙烯酮二聚物和成核化合物的特定例子。
实质上，可将掺有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物涂料施加于任何表面，以建立结晶表面。例如，可涂覆塑料或玻璃片。可能希望能够将涂层施加得尽可能薄。因为一般掺杂的烷基乙烯酮二聚物涂层是不透明的，较薄的涂层可直接简化对晶体生长的观察。或者，可用X射线衍射来筛选用可能产生晶体的液滴涂覆的片子。合适的生长期后，可在液氮中急骤冷冻晶体生长阵列，并通过评价各晶体生长液滴衍射x射线的能力一同筛选晶体生长。在这种情况下，可平行筛选许多晶体生长条件。
然而，在晶体仍然在烷基乙烯酮二聚物表面上时筛选晶体不会使分析复杂化。此技术需要由蛋白质结晶产生的X射线衍射图案去卷积得到烷基乙烯酮二聚物分形表面的X射线衍射图案。图5显示了硬酯酰乙烯酮二聚物的衍射图案。虽然蛋白质结晶的方向不同会使分析复杂化，但是高度聚焦的X射线束将消除这种可能的复杂情况。
可通过许多不同方法将掺有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物涂覆于表面。用掺有二硬酯酰乙烯酮的硬酯酰乙烯酮二聚物进行初步测试。首先加热硬酯酰乙烯酮二聚物/二硬酯酰乙烯酮混合物，超过其熔点，然后将液体转移到固体表面并冷却。可能产生不同厚度的掺杂的烷基乙烯酮二聚物。本发明考虑采用蒸气室，以均匀地施加层或将烷基乙烯酮二聚物掺杂于表面。
本发明不限于晶体生长的直滴蒸气扩散法。虽然掺杂的烷基乙烯酮二聚物表面可用于采用直滴结晶形式的高通量结晶筛选，但这些表面也可用于其它构造。其它构造包括夹心滴和悬滴蒸气扩散。
将本说明书中引用的所有刊物和专利申请纳入本文作为参考，正如具体地和单独地将各刊物或专利申请单独纳入本文作为参考的那样。
虽然为了清楚地理解以说明和实施例的方式详细描述了上述发明，但是本领域普通技术人员根据本发明内容可以明显看出，可对本发明作出某些改变和修改，而不背离所附权利要求的精神和范围。
机译： 分形形成烷基酮烯二聚体用于整体膜蛋白晶体生长
机译： 二聚体形成分形烷基烯酮用于整体膜蛋白晶体生长
机译： 分形形成烷基烯酮二聚体，用于整体膜蛋白晶体生长
