纯种新西兰白兔口腔颌面部鳞癌细胞系的建立及应用

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，对上百只纯种新西兰白兔上各原发灶、转移灶肿瘤标本进行原代培养，最后建成纯种新西兰白兔颌面部鳞癌无限细胞系。在此基础上完成了本发明。

具体而言，本发明人使用诱癌剂和致癌病毒建立各种纯种新西兰白兔颌面部鳞癌模型，然后手术切除标本移植于同种兔同位粘膜下。经生长后，进行兔间连续传代。再取肿瘤组织行体外培养，建立相应的体外细胞系。对细胞系进行相关的生物学检测。终于筛选得到一种纯种新西兰白兔颌面部鳞癌细胞系。该细胞系生长稳定(已稳定传代26代)，并且在光镜、电镜下的形态学特征与诱发肿瘤组织一致。电镜下显示，具有典型的桥粒和张力原纤维结构和兔诱发肿瘤异常染色体特征。免疫组化分析显示，细胞的肿瘤标记物及癌基因蛋白产物呈高表达。动物学实验表明，该细胞系接种裸鼠后导致裸鼠生产肿瘤，其组织病理形态与兔诱发肿瘤组织一致。

本发明的新西兰白兔颌面部鳞癌细胞不仅可以制备鳞癌模型动物，还可用于筛选治疗鳞癌的候选药物的方法，

一种优选的筛选治疗药物的方法包括步骤：

(a)将1×10⁴-1×10¹¹(较佳地1×10⁵-1×10¹⁰更佳地1×10⁶-1×10⁹)上述的新西兰白兔颌面部鳞癌细胞接种于哺乳动物的口腔黏膜或皮下部位；

(b)培养步骤(a)的哺乳动物14-100天，获得颌面部鳞癌动物模型；

(c)将测试化合物施用于步骤(b)的颌面部鳞癌动物模型，并与未施用测试化合物的步骤(b)的颌面部鳞癌动物模型进行比较，其中施用后导致鳞癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗鳞癌的候选化合物。

本发明的主要优点在于：

(a)本发明的纯种新西兰白兔口腔颌面部鳞癌细胞系的性状稳定，可稳定多次传代；

(b)本发明的纯种新西兰白兔口腔颌面部鳞癌细胞系是罕见的适用于大动物的颌面部鳞癌细胞系，是口腔颌面部鳞癌的基础和临床前期应用研究的理想细胞系。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

纯种新西兰白兔口腔颌面部鳞癌细胞系的建立

(a)、材料

1.实验动物：

纯种新西兰白兔购自上海陈行实验动物繁育厂，体重2-3千克，雌雄不限，在清洁动物房内饲养。

裸鼠购自上海实验动物中心，鼠龄为4～5周，雌雄兼用，其实验和饲养均在SPF条件下的超净层流架中进行，灭菌处理的水和饲料供动物自由摄取。

2.肿瘤来源：

先用致癌剂(DMBA)、诱癌病毒(兔乳头状瘤病毒)诱发纯种新西兰白兔产生口腔颌面部鳞癌，然后从产生口腔颌面部鳞癌的动物上手术获取肿瘤组织。术前未接受任何抗癌治疗。活组织检查及术后病理检查结果均为低分化鳞癌，用于肿瘤细胞原代培养的肿瘤组织均取自原发灶和转移灶。

3.细胞培养材料：

细胞培养液为RPMI 1640，内含20％兔血清，青霉素100IU/ml，链霉素50μg/ml，pH7.0～7.3消化液为0.25％胰酶，0.02％EDTA，pH7.3。

(b)、方法

纯种新西兰白兔口腔颌面部鳞癌细胞系的建立的技术路线如图8所示。简而言之，即手术切除的肿瘤标本移植于同种兔同位粘膜下。经生长后，进行兔间连续传代。再取肿瘤组织行体外培养，建立相应的体外细胞系。具体方法如下：

1.肿瘤的同种移植：

诱发性纯种新西兰白兔舌癌切除标本用生理盐水冲洗后剪碎形成1mm³大小的瘤块，注入3只纯种新西兰白兔同一舌部，行原代移植，共6点，每侧含瘤块1～2块。待移植瘤生长至5～15mm，呈半球状隆起时，取瘤的边缘部分切成1mm³瘤块，同位同种兔移植传代，每次传代用兔2～4只。注意观察移植瘤的转移情况。

2.移植瘤转移灶组织培养：

取兔鳞癌移植动物模型转移灶肿瘤组织，剪切制成约1mm组织块贴壁培养，置入5％CO₂培箱中，37℃，每隔3～5天换2/3量培养液。待细胞生长并铺满瓶底后，用生理盐水冲洗2次，以消化液室温下作用10～15分钟后终止消化，以吹打的方法收获细胞制成细胞悬液，进行传代培养，分种率1∶2，第6代后隔2～3天传代1次。

(c)结果

1.移植瘤的生长传代

原代瘤生长潜伏期最长为30天，15代以后各代均为7～11天，平均10.6天。继续移植传代，自15代开始，传代后移植成活率为95.9％，生长稳定，兔荷瘤最长可生存4个月。历时22个月，共用102只纯种新西兰白兔(图1)传代50代，建立了纯种新西兰白兔口腔颌面部移植瘤(图2)。

2.培养细胞的生长传代

贴壁肿瘤组织块第6天长出细胞晕或岛，第12天生长加速，至15天铺满瓶底，未见有成纤维细胞出现。原代至第5代分别间隔12、5、3、3天，第5代后细胞生长趋于稳定。在传22代之后，在众多培养的细胞系中，获得了一株纯种新西兰白兔颌面部鳞癌细胞系(图3)。该细胞系生长稳定(已稳定传代26代)，并且在光镜、电镜下的形态学特征与诱发肿瘤组织一致(见实施例2)。

获得的该株纯种新西兰白兔颌面部鳞癌细胞系于2005年3月30日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(武汉，中国)，保藏号为CCTCC NO：C200504。

实施例2

纯种新西兰白兔颌面部鳞癌细胞系的生物学特性

在本实施例中，用常规方法对保藏号为CCTCC NO：C200504的纯种新西兰白兔颌面部鳞癌细胞系进行生物学特性的检测。方法如下：

(a)实验方法

1.形态学：

(1)大体形态：

观测移植瘤的表面形态、活动度并剖视，当荷移植瘤兔濒死时行尸体检查。培养细胞传代2～3天后，观察群体细胞的生长形态。

(2)光镜：

对诱发瘤、移植瘤肿瘤及每代移植瘤均行常规组织病理学检查。在倒置相差显微镜下观察培养的活细胞形态结构及其生长特点或于HE染色后进行观察。

(3)电镜：

取第10代瘤边缘部分组织进行观察；同时取第10、18代细胞并离心，制备细胞丸，按常规方法制作超薄切片，经醋酸铀和枸橼酸铅双染色后，于透射电镜下观察。

2.细胞动力学：

肿瘤移植于同种新西兰白兔的原位黏膜下，成瘤后即用卡尺测量其长(a)、宽(b)、高(c)径线，每隔6天测量并记录，按体积(V)＝abcπ/6求每个瘤的近似体积，取各瘤体积的均值绘制移植瘤生长曲线。培养细胞取第21代单细胞悬液，调整细胞浓度，密度为2.0×10⁵/ml，分别取50μl，总1.00×10⁴细胞量接种24孔培养版，共接种48孔，分别加入培养液1ml，继续放置在37℃、5％二氧化碳培养箱内培养。接种后每隔24小时取其中三孔细胞进行消化、收集，血球计数板上计数，每空计数两次，取平均值。Excel软件绘制生长曲线。收集48小时细胞，PBS洗涤一次，制成细胞悬液，CycleTEST^TMPLUSDNA试剂盒(BD公司生产，USA)染色，FACSCalibur流式细胞仪(BD公司，USA)测定细胞周期，采用CellQuest软件获取资料，ModFIT软件进行分析，计算倍增时间。

3.染色体分析：

移植瘤第10代接种后20天，取2只荷瘤并已发生转移的纯种新西兰白兔，每只腹腔内注射0.01％秋水仙素10ml，4小时后取瘤，经胰酶-EDTA消化制备单细胞悬液，按常规方法制备标本。培养细胞传代第3天加入终浓度0.05μg/ml的秋水仙素再培养3小时，收获细胞制备染色体标本，从原代开始每隔4代制备1次至60代。计数分析100个中期分裂细胞。

4.免疫组化检测：

采用常规的LAB法检测诱发肿瘤、第8代移植瘤、第18、24、29、39代培养细胞的肿瘤标记物检测。

5.培养细胞的其它检测：

消化、离心收集培养细胞，制成细胞悬液，以每皿100个细胞接种至3只25cm²底面积培养瓶内，37℃、5％二氧化碳培养箱内继续培养。待培养到细胞集落形成，集落肉眼可见时终止培养。PBS洗涤三次，甲醛∶冰醋酸＝3∶1(新鲜配置)固定15min，PBS洗3次，晾干；姬姆萨染色20min，自来水冲洗，晾干，计数集落数。取第20代细胞悬液(24.5×106个/ml)，分别与不同浓度(0～128μg/ml)的菜豆凝集素(PHA)等量混合，静置20分钟后光镜下观察凝集情况。以正常兔白细胞作阴性对照。DNA荧光染色倒置显微镜和扫描电镜观察检查支原体污染情况。培养细胞生长成片，加入荧光染料甲基橙(AO)+溴乙啶(EB)终浓度为5μg/ml，染色15min。倒去染液，滴加数滴甘油在倒置荧光显微镜下观察。取第6、24代细胞采用盖玻片法，用PBS冲洗培养细胞爬片，0.2％甲醛-戊二醛电镜固定液固定，送上海第二医科大学电镜室按常规制成扫描电镜标本，扫描电镜观察进行支原体污染检测^[1-3]。

6.冻存与复苏：

将培养的纯种新西兰白兔颌面部鳞癌细胞加冻存液(含10％DMSO培养液)，逐级降温入液氮罐冻存，复苏时取出冻存管迅速入42℃水浴中解冻。洗去冻存液后移植裸鼠，培养细胞计活细胞数后继续培养。

7.异体成瘤：

将培养细胞6代、15代细胞消化、收集、计数，以2×10⁹细胞数量接种在裸鼠后肢臀部皮下。

(b)实验结果

1.形态学：

(1)大体形态：

移植瘤潜伏期后呈半球状膨胀性快速生长，覆盖其上的粘膜变红。瘤体直径＞2cm时中央坏死，溃破，形成癌性溃疡。移植部位若出现浸润其舌活动度减少或固定，切除瘤包膜不完整，瘤体周围常见生芽状瘤结节，质地硬，剖面早期鱼肉样的灰白色，呈砂粒样或干酪样改变。在100只实验兔中有60只出现转移。其中肺转移34只(包括23只既有淋巴转移又有肺转移，余者只有肺转移)，淋巴结(包括颈淋巴结和颌下淋巴结)24只。荷瘤均≥3个月。培养细胞传代后在瓶底上形成一层半透明不均质的乳白色膜。

(2)光镜：

各代移植瘤与诱发肿瘤一致，均为低分化鳞癌。培养活细胞半透明贴壁生长，大小不等，以不规则的多边形为主，含少量卵圆形、梭形、空泡样细胞：呈上皮样镶嵌状排列，界线清晰，间桥多而明显，核大卵圆、不均质，多为单核、双核、巨核，核分裂相常见，核仁大，胞浆少，内含颗粒，核浆比值增大。当细胞铺满瓶底后，出现重叠和堆积性生长，失去接触性抑制。(图3)。

(3)电镜：

移植瘤和培养细胞的透射电镜大致相同，细胞排列紧密，外形不规则，有较多的微绒毛；核大不规则，畸形核常见，染色质不均质；胞浆少，内含张力原纤维，细胞间桥粒明显，呈现鳞癌的超微结构特点。

2.细胞动力学：

培养细胞的指数增殖期在传代后第3～8天，最大增殖倍数在第8天达24.7倍；群体倍增时间均值为37.64小时；有丝分裂指数第4天达高峰，为17.04‰。

3.免疫组化检测：

免疫组化结果表明，诱发肿瘤的Cytokeratin(高分子量角蛋白)及培养的细胞Cytokeratin均呈高表达(图6)。

4.培养细胞的其它检测：

集落形成率：排除最大和最小集落，计数直径5±2mm大小集落数，求得3瓶培养细胞的平均集落形成率63.6％。培养细胞在PHA浓度为1μg/ml时即出现凝集反应。

DNA荧光染色：荧光显微镜下可见细胞核着绿色荧光，细胞浆周围未见到支原体颗粒。扫描电镜下也未见到支原体颗粒附着。

5.冻存与复苏：

细胞复苏后活细胞存活率为62％，接种动物仍可致瘤，但潜伏期延长至15～20天，病理检查仍为低分化鳞癌。培养状况生长良好。

6.异种动物成瘤：

接种培养细胞后25-38d不等8只裸鼠6只形成肿瘤，经病理学证实同诱发、移植性肿瘤相同均为低分化的鳞状细胞癌^[4](图7)。

实施例3

用纯种新西兰白兔颌面部鳞癌细胞系建立口腔颌面部鳞癌的新西兰白兔模型

取实施例1中获得的纯种新西兰白兔颌面部鳞癌细胞系CCTCC C200504，经消化液(0.25％胰酶，0.02％EDTA，pH7.3)消化后，收集并计数，以1×10⁸或1×10⁹细胞数量接种在4只2-3月龄的新西兰白兔的口腔黏膜下。

接种后24-36天之间，4只新西兰白兔口腔内陆续出现肿瘤。用实施例2相同的方法进行病理学检测，证实在动物模型上诱发了低分化的颌面部鳞状细胞癌^[5]。

菌种保藏

本发明的纯种新西兰白兔颌面部鳞癌细胞系，于2005年3月30日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(武汉，中国)，保藏号为CCTCC NO：C200504。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

1.何荣根，徐秀祺，周晓健等。人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞系的建立及其生物学特性。肿瘤，1983，3：97

2.廖小宜，李凡，温玉明等.人颊粘膜鳞状细胞癌BCaCD885细胞系的建立及其生物学特征。华西口腔西学杂志，1990，8：238

3.鄂征主编。组织培养和分子细胞学技术，第一版，北京：北京出版社，1979

4.Fidler IJ，Poste G.The pathogenesis of cancermetastasis.Nature，1980，283：139

5.Sacks PG，Parnes SM，Gallick CE，et al.Establishment andcharacterization of two new squamous cell carcinomacell line derivedfrom tumor of the head and  neck.Cancer Res，1988，48：2858