法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-08-06
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N15/31 授权公告日:20081022 终止日期:20130612 申请日:20060612
专利权的终止
2008-10-22
授权
授权
2007-02-14
实质审查的生效
实质审查的生效
2006-12-27
公开
公开
一、技术领域
本发明涉及一种水下沉积物中微生物的鉴定方法，具体地说是一种湖泊沉积物中微生物总DNA的提取及生物量的鉴定方法。
二、背景技术
微生物是地球生物圈的重要组成部分。研究自然界中微生物的生物多样性和微生物群落之间的相互作用以及测定自然界中微生物的活动并且监测他们对生态系统的影响是微生物生态学的主要任务。随着自然环境的恶化，污染加剧，许多有用的微生物资源正在消失，这更增强了人们希望客观了解和认识微生物生态的迫切性。
湖泊沉积物中的微生物群落结构是整个生态系统中的一个重要组成成分，在物质转化中具有重要的作用。对它们的认识有助于人类更好的利用微生物资源以及改善人类的生存环境。大量的研究表明湖泊、海洋、长江等环境中微生物多样性十分丰富，环境中存在的微生物品种和数量远远超过已鉴定的微生物，可由于群落自身的复杂性、多样性和低培养性，可培养的微生物的数量只占总数的不到0.1～1％。采用传统的显微镜检测或微生物培养方法研究微生物群落的多样性时，必将失去大部分的物种信息，从而使的研究结论不够全面。以核酸为基础的分子生物学方法直接从环境样品中提取微生物的总DNA，克服了传统方法的缺陷，为研究湖泊生态环境提供了新的有力手段。
DNA提取一般包括细胞抽提和直接裂解两种方法。其中直接裂解更能客观地反应微生物群落的特征，被更多地用于研究整个微生物群落多样性。直接裂解的方法主要有化学法(SDS-CTAB等)、酶解法(裂解酶和蛋白酶K等)和机械法(冰冻-温育循环、研磨和超声波等)。但是，对于湖泊随着沉积深度加深，微生物含量很少，现有的技术中DNA提取方法对实验设备和操作技术要求较高，许多方法都是针对生物量多的样品，而且费用昂贵。因此建立一种经济而又实用的高效提取湖泊沉积物中微生物的DNA方法显得尤为必要。
三、发明内容
本发明提供了一种对湖泊沉积物中不同深度下沉积物中微生物总DNA的提取以及生物量的检测分析方法，特别是对不能进行显微检测和生物培养的环境样品提供了一种更为全面的检测分析方法。本发明克服了传统方法的缺陷，可以快速全面了解湖泊沉积物中微生物多样性信息，为更好利用微生物资源以及改善人类生存环境提供了方便。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种湖泊沉积物中微生物总DNA的提取及生物量的鉴定方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)抽取沉积物样品冷冻干燥计算样品含水率；样品为新鲜或冷冻保存的，取样要混匀。
(2)配制核酸提取缓冲液，加入十二烷基磺酸钠(SDS)混匀，将沉积物样品加入混合液中，裂解，离心，去除腐质酸和多糖，沉淀分离得到单细胞；核酸提取缓冲液采用浓度为100mM的Tris-Cl、50mM乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液以及2％SDS，pH7.6～8.0，在60℃～70℃条件下水浴1h。式中Tris为三(羟基)氨基甲烷。
(3)收集上清液加入高盐和阳离子去污剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)消化，氯仿、异戊醇提抽；高盐能促进细胞碎片及蛋白质沉淀，提高DNA纯度。高盐NaCl浓度为5M，CTAB溶液浓度为1.5％，60℃～70℃水浴保温5～10min，采用等体积氯仿/异戊醇为24∶1，提抽。
(4)向上述步骤水相中加入萃取剂沉淀，并用醇类洗涤，临界干燥；水相中加入萃取剂在-20℃沉淀2h，萃取剂为0.6V异丙醇或等体积聚乙二醇(分子量8000、浓度为13～15％)，并用冷乙醇洗涤。
(5)透析带电洗脱纯化回收对粗提液处理，紫外测定OD260nm/OD280nm吸光度，定量计算微生物总DNA以及单位沉积物生物量；定量计算时，1个OD260nm单位约等于50μg/ml双链DNA。
本发明克服了传统方法的缺陷，所述对湖泊沉积物中不同深度下沉积物中微生物总DNA的提取以及生物量的检测分析方法，不需要采用传统的显微镜检测或微生物培养方法，直接提取总DNA，对实验设备和操作技术要求较低，特别是对微生物含量少的样品尤其适用。本发明特别适用于从湖泊沉积物中提取微生物基因组总DNA，同时也可应用于池塘、海洋、江系沉积物、活性污泥以及陆地土壤样品等微生物基因组DNA的提取和生物量的鉴定分析。
本发明可成功提取高质量基因组DNA，并应用于种群分析、系统进化、分子标记等研究。本发明提供的方法不仅整个过程简单、不需要花费贵重的药品，比较经济，实用；而且能够快速全面了解环境样品的生物信息，为更好利用微生物资源以及改善人类生存环境提供了方便。
四、附图说明
图1是5个不同深度沉积样品处理分析结果表；
图2是不同深度沉积样品基因组DNA电泳图谱图。
五、具体实施方式
使用本发明所述的方法对太湖5个不同沉积深度样品进行处理。
实施例1
取太湖底沉积深度5cm处样品进行处理，预干重5g。样品含水率为58％。
配制2ml 1mol/l Tris-Cl、1ml 1mol/l EDTA缓冲液(pH8.0)和2ml 20％SDS溶液的混合液。计算样品含水量，补充双蒸水至20ml体系，将沉积样品加到上述混合液中，轻微混匀，65℃水浴保温1h(每隔20min轻微混匀1次)后，10,000×rpm离心10min。
上清液收集，加入2ml 5mol/l NaCl溶液，用来促进细胞碎片及蛋白质沉淀，提高DNA纯度。加入3ml 10％CTAB溶液作为阳离子去污剂消化，混匀，水浴保温5min，加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，轻微混匀，提抽，5,000×rpm4℃离心5min。
向上述水相中加入0.6V体积异丙醇作为萃取剂，轻微混匀，-20℃沉淀2h，4℃下13,000×rpm离心10min。弃去上清液，沉淀用75％冰乙醇洗涤，弃上清，沉淀风干，溶解于10mM Tris-Cl、1mM EDTA，pH8.0的缓冲液中。
核酸粗提液样品纯化后稀释，测定吸光度，计算微生物总DNA量以及单位干重沉积物生物量。1个OD260nm单位约等于50μg/ml双链DNA。得到太湖底沉积深度5cm处样品的生物量为8.81μgDNA/dry wt。
实施例2
取太湖底沉积深度15cm处样品进行处理，预干重5g。样品含水率为46％。
配制2ml 1mol/l Tris-Cl、1ml 1mol/l EDTA缓冲液(pH7.6)和2ml 20％SDS溶液的混合液。计算样品含水量，补充双蒸水至20ml体系，将沉积样品加到上述混合液中，轻微混匀，60℃水浴保温1h(每隔20min轻微混匀1次)后，10,000×rpm离心10min。
上清液收集，加入2ml 5mol/l NaCl溶液，用来促进细胞碎片及蛋白质沉淀，提高DNA纯度。加入3ml 10％CTAB溶液作为阳离子去污剂消化，混匀，水浴保温8min，加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，轻微混匀，提抽，5,000×rpm4℃离心5min。
向上述水相中加入与上清液等体积的聚乙二醇(分子量为8000、重量百分比浓度为15％)作为萃取剂，轻微混匀，-20℃沉淀2h，4℃下13,000×rpm离心10min。弃去上清液，沉淀用75％冰乙醇洗涤，弃上清，沉淀风干，溶解于10mM Tris-Cl、1mM EDTA，pH7.6的缓冲液中。
核酸粗提液样品纯化后稀释，测定吸光度，计算微生物总DNA量以及单位干重沉积物生物量。1个OD260nm单位约等于50μg/ml双链DNA。得到太湖底沉积深度15cm处样品的生物量为4.37μgDNA/dry wt。
实施例3
取太湖底沉积深度25cm处样品进行处理，预干重5g。样品含水率为39％。
配制2ml 1mol/l Tris-Cl、1ml 1mol/l EDTA缓冲液(pH7.8)和2ml 20％SDS溶液的混合液。计算样品含水量，补充双蒸水至20ml体系，将沉积样品加到上述混合液中，轻微混匀，70℃水浴保温1h(每隔20min轻微混匀1次)后，10,000×rpm离心10min。
上清液收集，加入2ml 5mol/l NaCl溶液，用来促进细胞碎片及蛋白质沉淀，提高DNA纯度。加入3ml 10％CTAB溶液作为阳离子去污剂消化，混匀，水浴保温10min，加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，轻微混匀，提抽，5,000×rpm4℃离心5min。
向上述水相中加入与上清液等体积的聚乙二醇(分子量为8000、重量百分比浓度为13％)作为萃取剂，轻微混匀，-20℃沉淀2h，4℃下13,000×rpm离心10min。弃去上清液，沉淀用75％冰乙醇洗涤，弃上清，沉淀风干，溶解于10mMTris-Cl、1mM EDTA，pH7.8的缓冲液中。
核酸粗提液样品纯化后稀释，测定吸光度，计算微生物总DNA量以及单位干重沉积物生物量。1个OD260nm单位约等于50μg/ml双链DNA。得到太湖底沉积深度25cm处样品的生物量为2.63μgDNA/dry wt。
实施例4
取太湖底沉积深度35cm处样品进行处理，预干重5g。样品含水率为34％。
配制2ml 1mol/l Tris-Cl、1ml 1mol/l EDTA缓冲液(pH8.0)和2ml 20％SDS溶液的混合液。计算样品含水量，补充双蒸水至20ml体系，将沉积样品加到上述混合液中，轻微混匀，65℃水浴保温1h(每隔20min轻微混匀1次)后，10,000×rpm离心10min。
上清液收集，加入2ml 5mol/l NaCl溶液，用来促进细胞碎片及蛋白质沉淀，提高DNA纯度。加入3ml 10％CTAB溶液作为阳离子去污剂消化，混匀，水浴保温8min，加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，轻微混匀，提抽，5,000×rpm4℃离心5min。
向上述水相中加入0.6V体积异丙醇作为萃取剂，轻微混匀，-20℃沉淀2h，4℃下13,000×rpm离心10min。弃去上清液，沉淀用75％冰乙醇洗涤，弃上清，沉淀风干，溶解于10mM Tris-Cl、1mM EDTA，pH8.0的缓冲液中。
核酸粗提液样品纯化后稀释，测定吸光度，计算微生物总DNA量以及单位干重沉积物生物量。1个OD260nm单位约等于50μg/ml双链DNA。得到太湖底沉积深度35cm处样品的生物量为1.54μgDNA/dry wt。
实施例5
取太湖底沉积深度45cm处样品进行处理，预干重5g。样品含水率为31％。
配制2ml 1mol/l Tris-Cl、1ml 1mol/l EDTA缓冲液(pH8.0)和2ml 20％SDS溶液的混合液。计算样品含水量，补充双蒸水至20ml体系，将沉积样品加到上述混合液中，轻微混匀，65℃水浴保温1h(每隔20min轻微混匀1次)后，10,000×rpm离心10min。
上清液收集，加入2ml 5mol/l NaCl溶液，用来促进细胞碎片及蛋白质沉淀，提高DNA纯度。加入3ml 10％CTAB溶液作为阳离子去污剂消化，混匀，水浴保温5min，加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，轻微混匀，提抽，5,000×rpm4℃离心5min。
向上述水相中加入0.6V体积异丙醇作为萃取剂，轻微混匀，-20℃沉淀2h，4℃下13,000×rpm离心10min。弃去上清液，沉淀用75％冰乙醇洗涤，弃上清，沉淀风干，溶解于10mM Tris-Cl、1mM EDTA，pH8.0的缓冲液中。
核酸粗提液样品纯化后稀释，测定吸光度，计算微生物总DNA量以及单位干重沉积物生物量。1个OD260nm单位约等于50μg/ml双链DNA。得到太湖底沉积深度45cm处样品的生物量为0.98μgDNA/dry wt。
综上所述，使用本发明所述湖泊沉积物中微生物总DNA的提取及生物量的鉴定方法，对太湖5个不同沉积深度样品进行处理，如图1和图2所示，在图1中，A-E分别代表5、15、25、35、45cm处沉积物样品的处理分析结果。图2所示为不同深度沉积样品基因组DNA电泳图谱图，其中，M：Hind III-digestedλDNAmarker；A-E：不同深度沉积样品。从图1和图2可以看出：湖泊沉积物中微生物总DNA的生物量随深度加深，生物量降低。另外，该方法也显示了处理结果简单、快速的优点。
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