含有细菌鞭毛蛋白作为活性成分的粘膜疫苗佐剂

具体实施方式

本发明的发明人分离了鞭毛蛋白，并给小鼠皮下注射(自动免疫接种)来证实防御性免疫力，并观察皮下注射有鞭毛蛋白的小鼠皮肤组织中形成肉芽肿损害(granulomatous lesion)。结果，我们证实鞭毛蛋白起到了疫苗佐剂的作用。

鞭毛，决定细菌活动性的重要因素，一般由钩形鞘(hook)、基体和鞭毛丝(filament)构成。已知鞭毛具有多种功能，如细菌的泳动活动性或爬动活动性，决定细菌的趋向性，形成生物膜和决定细菌的粘附性(McCarter，L.L.，Microbiol Mol Biol Rev.65：445-62，2001；Kim，Y.K.，McCarter，L.L.，JBacteriol.182：3693-704，2000；McCarter，L. L.，J Bacteriol.177：1595-609，1995；Boles，B.R.，McCarter，L.L.J Bacteriol.182：1035-45，2000；Prouty，M.G.，Correa，N.E.，Klose，K.E.Mol Microbiol.2001 Mar；39(6)：1595-609，2001)。创伤弧菌具有极性鞭毛(McCarter，L.L.，Microbiol Mol Biol Rev.65：445-62，2001)。鞭毛的结构成分称为鞭毛蛋白，且该鞭毛蛋白形成规则排列的鞭毛丝。根据最近的研究结果，已知哺乳动物钟样受体-5(Toll-likereceptor-5，TLR-5)识别革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的鞭毛蛋白，并随后激活宿主细胞的NF-kB途径(Hayashi，F.，Smith，K.D.，Ozinsky，A.，Hwan，T.R.，Yi，E.C.，Goodlett，D.R.，Eng，J.K.，Akira，S.，Underhill，D.M.，Aderem，A.，Nature 410：1099-1103，2001)。TLR，识别与病原体相关的分子模型的受体，作为抵抗各种传染病原体的第一防线天然免疫系统的主要成分，而且是与有效适应性免疫应答的刺激相关的细胞受体(Akira，S.，Hemmi，H.，Immunol.Lett.85：85-95，2003)。因此，TLR激动剂可以是开发各种疫苗佐剂的靶标。

根据本发明的发明人的研究，构成创伤弧菌鞭毛的基因包括DNA序列编号1表达的或氨基酸序列编号2的flaA，DNA序列编号3表达的或氨基酸序列编号4的flaB，DNA序列编号5表达的或氨基酸序列编号6的flaF，DNA序列编号7表达的或氨基酸序列编号8的flaC，DNA序列编号9表达的或氨基酸序列编号10的flaD，DNA序列编号11表达的或氨基酸序列编号12的flaE；每个基因的组成与副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)的基因的组成相似，且它们的同源性也很高。

证明根据本发明的含有鞭毛蛋白(细菌鞭毛的结构成分)的疫苗佐剂效果的方法如下：

1)制备和分离重组鞭毛蛋白；

2)用混合的重组鞭毛蛋白和破伤风类毒素鼻内免疫后，测量抗原特异性免疫应答的水平；

3)用混合的重组鞭毛蛋白和破伤风类毒素鼻内免疫小鼠后，测量宿主对破伤风毒素的防御能力；

4)证实重组鞭毛蛋白提高了上皮细胞IL-8的产生；

5)证实重组鞭毛蛋白和TLR-5结合后诱导了胞内信号传导；

6)观察重组鞭毛蛋白诱导人树突状细胞(dendritic cell，DC)成熟。

因此，本发明涉及含有鞭毛蛋白(细菌鞭毛的结构成分)作为活性成分的疫苗佐剂。

另外，本发明涉及制备具有受鞭毛蛋白诱导的佐剂活性的重组免疫原的方法，该方法包括用编码各种免疫原抗原决定部位的基因来替代结合TLR-5的细菌鞭毛蛋白的结构基因的N-端和C-端之间存在的部分基因。

更具体地，可以通过用编码蛋白抗原决定部位的基因替代SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：12中所示的创伤弧菌的结构成分中FlaA的氨基酸序列1-191、FlaB的氨基酸序列1-191、FlaF的氨基酸序列1-191、FlaC的氨基酸序列1-191、FlaD的氨基酸序列1-191和FlaE的氨基酸序列1-189的N-端区域与FlaA的氨基酸序列277-376、FlaB的氨基酸序列278-377、FlaF的氨基酸序列278-377、FlaC的氨基酸序列285-385、FlaD的氨基酸序列278-377和FlaE氨基酸序列276-375的C-端区域之间的碱基序列来制备具有通过鞭毛蛋白诱导的佐剂活性的重组免疫原。

本发明的蛋白抗原决定部位是破伤风类毒素、流感病毒的免疫原抗原决定部位(immunogenic epitope)、肺炎球菌表面蛋白A(pneumococcal surfaceproteinA，PspA)的特异性抗原和肺炎球菌的雄配子(sperm)等。

可以将本发明的疫苗佐剂配制成口服形式，如水溶剂或油溶剂的溶液、悬浮液、或者乳剂形式，或者使用前为无菌形态的干粉型，而使用时溶解于无热原的水中，或者可以配制成非口服给药(例如，皮下注射、静脉注射或肌肉注射)。

口服制剂中，可以通过常规方法使用载体或成形剂(forming agent)制成各种剂型，例如，片剂、锭剂、水乳剂或油乳剂、可以喷雾的粉剂或颗粒、乳剂、软胶囊或硬胶囊、糖浆或酏剂，可以根据单位剂量或剂型选择。

可以通过悬浮于无毒可用的稀释剂或溶剂如1，2-丁二醇中的无菌注射溶液或乳剂的形式注射非口服制剂。可以使用的稀释剂或溶剂的实例为水、林格氏液(Ringer solution)和等渗生理盐水，也可以使用常规的溶剂如乙醇、聚乙二醇(polyethileneglycol)和聚丙二醇。无菌挥发油可以用作溶剂或乳化性溶剂。栓剂形式中，将药物和无刺激性赋形剂混合后，通过直肠内途径给予药物，无刺激性赋形剂例如是常温下为固体而在直肠温度下为液体的可可脂或聚乙二醇。

本发明的疫苗佐剂的实例是对抗破伤风等的抗毒素疫苗，对抗霍乱，伤寒等的减毒活疫苗或灭活疫苗；对抗流感，非典型肺炎(Severe AcuteRespiratory Syndrome，SARS)等的抗病毒疫苗；对抗子宫宫颈癌等的抗癌疫苗；抗精子的避孕疫苗；以及用于重组疫苗的佐剂，然而，不受限于这些实例。

此外，本发明并不受限于创伤弧菌的鞭毛蛋白，适用于具有与创伤弧菌相似的由鞭毛蛋白基因编码的鞭毛蛋白的其他有鞭毛细菌。

以下更详细地充分解释了本发明，但本发明不受限于这些实施例。

表1中描述了本发明中所用菌株和质粒的特征。在相应的实施例和实验实施例中描述了每个菌株或质粒的详细特征和制造方法

表1

<每种菌株的培养与保存>

以下实施例和实验中，LB(Luria Bertani)培养基(Difco Co.)用于大肠杆菌、沙门氏菌和利斯特氏菌的菌株，心脏浸出液(heart infusion，HI)培养基(Difco Co.)用于培养创伤弧菌。这些菌株培养后，加入甘油，成为50％的溶液并且在深冻冰箱中-80℃保存。

实施例1  转座子文库的构建

将创伤弧菌MO6-24/O型菌株(从美国马里兰大学医学院医院流行病学部的J.Glenn Morris处获得)和包括E.coli SM10λpir的mini-Tn5 lacZ1菌株(从德国Braunschweig，GBF National Research Center for Biotechnology，Kenneth N.Timmis处获得)在37℃，210转/分钟的摇床中培养，两种菌分别在10毫升的2.5HI(2.5％NaCl心脏浸出液)肉汤培养基和20毫升的LB(含有100微克/毫升的氨苄青霉素和100微克/毫升卡那霉素)肉汤培养基中接种单个菌落。

第二天将上述接种培养物离心，并用无抗生素的LB肉汤培养基清洗和离心两次，然后悬浮在100微升的新LB肉汤培养基中。将大肠杆菌和创伤弧菌的单一细菌悬浮液混合在一起并滴在LB琼脂平板上。37℃培养过夜后，将800微升新的2.5HI肉汤培养基加入到LB琼脂平板上生长的菌落中，使用灭菌的玻璃棒将生长的菌落小心刮下。将该细菌悬浮液转移至1.5毫升的塑料试管中并悬浮直至变成均质状态。将该悬浮液稀释至1/10和1/100，然后停止稀释，将稀释液滴至含有200微克/毫升卡那霉素的硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖(thiosulfate citrate bile sucrose，TCBS)琼脂平板上，涂覆直到充分渗透，在37℃下培养过夜。

接下来一天只取在TCBS琼脂平板上生长的弧菌菌落，并用牙签将其接种于含有300微克/毫升卡那霉素的琼脂平板上，并在37℃下培养过夜。第二天将生长的弧菌菌落接种于含有200微克/毫升卡那霉素的100微升2.5HI的96孔培养板上，并在37℃下培养过夜，没有振荡。接下来一天，将80微升50％的甘油加入含有生长细菌的每个孔中，储存于-80℃的深度冷冻冰箱中。当用于实验时，将这些接种于2.5HI肉汤培养基并按需要培养。

实施例2  失去运动性的转座子突变菌落的筛选

将实施例1中制得的创伤弧菌MO6-24/O转座子文库的每个克隆(clone)在37℃下培养过夜，然后使用灭菌的牙签接种于含有0.3％琼脂的半固态HI(心脏浸出液)琼脂平板，并在37℃下培养6小时。然后通过测量细菌生长后的移动范围来测定细菌的运动性程度。

通过筛选步骤选择几乎完全失去运动性的3个转座子突变克隆，并进行鉴定插入转座子的突变基因的实验。

实施例3  鞭毛蛋白操纵子基因的鉴定

通过筛选粘粒基因文库来进行转座子插入区域附近的基因克隆，使用DNA片段作为随机聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法扩增的引物。使用两步PCR扩增方法来扩增转座子插入位点附近的DNA片段。第一步PCR中，使用序列编号13的随机引物1(5-GGCCACGCGTCGACTAGTCANNNNNNNNNNACGCCC-3)，和序列编号14的mini-Tn5 lacZ1特异性引物1(5-TTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGC-3)。第一步PCR设置如下：94℃变性30秒，30℃退火30秒，然后在72℃延伸1分30秒，5个循环；然后通过94℃变性30秒，45℃退火30秒，72℃延伸2分钟，30个循环，再进行30个循环的PCR反应。使用第一步PCR的产物作为模板进行第二步PCR反应。第二步PCR中，使用序列编号15的随机引物2(5-GGCCAAGAGTCGACTAGTCA-3)和序列编号16的mini-Tn5 lacZ1特异性引物2(5-CCGCACTTGTGTATAAGAGTCAG-3)。反应条件为：94℃变性30秒，72℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，30个循环。将这些PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳，从凝胶中分离出扩增的DNA片段，并确定它们的碱基序列。结果，上述的PCR反应扩增了3种特异性的DNA片段。

测定扩增的DNA片段、并用美国国家生物信息中心的GeneBank数据库中记录的基因进行的BLAST分析的结果，表明了与副溶血弧菌的bcr，cheR和flgG基因的同一性。根据本发明的发明人对创伤弧菌的基因组序列分析的完全译码的结果，所述的基因位于极性鞭毛的鞭毛蛋白操纵子中，如图1和2所示。

实施例4  重组鞭毛蛋白的制备和纯化

将分别含有创伤弧菌flaB基因、沙门氏菌fliC基因(序列编号18)和利斯特氏菌flaA基因(序列编号17)的开放读码框(Open Reading Frame，ORF)的DNA片段连接至为蛋白内含子(intein)融合表达载体的pTYB12载体中(New England Biolabs Inc.)，来产生各自的质粒pCMM250、pCMM251、pCMM252。通过电穿孔将每种质粒转化至E.coli ER2566中，并通过加入0.5mM 5-溴-吲哚-3-氯-异丙基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(5-bormo-indol-3-chloro-isopropyl-β-D-galactopyranoside，ITPG)来诱导表达。根据制造商(New England Biolabs Inc.)的说明，使用几丁质珠层析柱(Chitin bead column)和1，4-二硫苏糖醇(1，4-dithiothreiol)从蛋白内含子融合蛋白中纯化Flab、FliC和FlaA蛋白质。使用亲和性PakTM DetoxigelTM内毒素去除凝胶(Pirece Inc.Rockgord，IL)除去包含在分离的FlaB、FliC和FlaA蛋白质中的内毒素。

使用上述的方法将创伤弧菌flaA、flaB、flaF、flaC、flaD和flaE基因的ORF连接至pGEX4T-1载体中(pCMM244-flaB、pCMM245-flaA、pCMM247-flaD、pCMM248-flaE、pCMM249-flaF)。根据制造商(AmershamPharmacia)的说明，纯化谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白质。

实验实施例1  重组鞭毛蛋白的粘膜免疫佐剂活性的实验

每隔7天，用20微升的PBS(磷酸盐缓冲盐水)、单独3微克的破伤风类毒素、或者3微克的破伤风类毒素分别与1微克、5微克和15微克的创伤弧菌FlaB的组合，向7周大的雌性Balb/c小鼠鼻内免疫3次。最后一次免疫后7天，从免疫的小鼠中收集唾液、阴道洗出物和血清样品来测定破伤风类毒素(TT)-特异性全身免疫应答和粘膜免疫应答。通过酶联免疫吸附测试(Enzyme linked immuno sorbant assay，ELISA)方法测量这些应答，将之前接种3次疫苗的小鼠，在全身给药最少200倍破伤风类毒素致死量后，观察7天。结果显示于图3和图4中。

如图3所示的，仅用PBS免疫的对照组小鼠在24小时内全部死亡(100％)，只用破伤风类毒素(TT)鼻内免疫的组中仅有17％存活。然而，用破伤风类毒素和1微克、5微克或15微克的创伤弧菌FlaB的组合(TT+Vv-FlaB)免疫的小鼠有100％的存活。TT组存活的小鼠显示了强直性麻痹，但TT+Vv-FlaB的组存活的小鼠显示出与正常小鼠同样的特征。

如图4所示，就抗原特异性全身免疫应答和粘膜免疫应答的程度而言，TT+Vv-FlaB组高于仅用PBS或TT的组。

为了证实这些疫苗的佐剂活性中哪些对于其它非-创伤弧菌鞭毛的鞭毛蛋白是普通的，用纯化的FlaA重组蛋白和FliC重组蛋白进行了相同的实验，所述FlaA重组蛋白是单核细胞增生利斯特氏菌的鞭毛蛋白结构成分，单核细胞增生利斯特氏菌是革兰氏(+)细菌，所述FliC重组蛋白是鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白结构成分，鼠伤寒沙门氏菌是革兰氏(-)细菌。结果显示于表2和图5中。

   表2

表2的数据是用利斯特氏菌的FlaA、创伤弧菌的FlaB和沙门氏菌的FliC分别与破伤风类毒素组合进行鼻内免疫后，给药破伤风类毒素的结果。表明这些鞭毛蛋白结构成分蛋白质完全保护了宿主免受破伤风类毒素致死量的影响。

表2和图5的结果中，观察到上述3种类型菌株的鞭毛蛋白与疫苗佐剂具有相同的效用。

图3、图4、图5和表2的结果表明，重组鞭毛蛋白起着有效疫苗佐剂的作用。

实验实施例2  鞭毛蛋白对上皮细胞的应答

将Caco-2细胞以2.0×10⁵/孔接种于24孔平板中，并在补充10％胎牛血清(FCS)的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)中维持过夜。第二天用无胎牛血清的DMEM清洗两次，并用没有补充FCS的不同浓度的重组Vv-FlaB处理3小时，使用ELISA试剂盒(R&D系统Co.)测量释放至上清液的IL-8水平。通过实时逆转录-PCR分析来分析由Vv-FlaB处理的Caco-2细胞中的IL-8表达。从由Vv-FlaB处理的细胞中分离总RNA。结果显示于图6中。图6中，显示了重组FlaB结合Caco-2细胞表面的受体和传导胞内信号，并以剂量依赖性的方式促进IL-8，所述IL-8诱导嗜中性粒细胞分泌重要的炎症介质。

实验实施例3  调控TLR-5介导的鞭毛蛋白的IL-8表达

用合适量的表达质粒、报告基因pIL-8-Luc或pNF-κB-Luc(从Hanyang大学医学院的Kim，Jeong Mok教授处获得)和编码TLR-5基因的p3Xflag-hTLR5(从美国Wake Forest大学医学院微生物和免疫系的Steven B.Mizel处获得)来转染以2.0×10⁵/孔接种于24孔平板中的Caco-2细胞。使用对照表达质粒pCMV-β-ga(9BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)将荧光素酶的活性水平规范成lacZsd表达。通过加入适量空白载体来保持表达载体总数的恒定。转染后24小时，用新鲜培养基来替代培养物，每种所述培养基含有创伤弧菌的重组FlaB、沙门氏菌的重组FliC和利斯特氏菌的重组FlaA，以及通过MPACT-CNTM系统纯化的创伤弧菌FlaA、FlaB、FlaF、FlaC、FlaD和FlaE之一，并且和谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白共同给药。给药后几小时，通过照度计(luminometer)(MicroLumatPlus LB 96V，Berthold，Wilbad，德国)测定荧光素酶的活性来测量IL-8的表达，结果显示于图7和图8中。

重组FlaB以剂量依赖性的方式激活了IL-8和pNF-κB的表达。还表明了创伤弧菌的其他鞭毛结构成分FlaA、FlaF、FlaC、FlaD和FlaE具有一定程度的不同。

实验实施例4  重组FlaB对人外周血树突细胞的应答

使用Ficoll Paque PLUS(Amersham Inc.)通过离心从人外周血分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。将识别PBMC中骨髓细胞上选择性表达的CD14的磁珠在6-12℃反应20分钟。通过磁性细胞分选器来分离CD14阳性细胞。将CD14阳性细胞加入含有10％FCS的RPMI培养基中，并共同给予50纳克/毫升粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)及50纳克/毫升白细胞介素-4(IL-4)，培养6天以分化为不成熟的树突细胞。分化后，用实施例4中制得的重组FlaB和沙门氏菌鞭毛蛋白FliC以6nM浓度的剂量处理，并培养24小时。观察FlaB和FliC对人树突细胞分化的影响。给予FliC的原因是用来确定本发明是否可以广泛应用。

对识别树突细胞表面上选择性表达的CD80、CD83和CD86并结合异硫氰酸荧光素(fluorescein isothicyanate，FITC)或藻红蛋白(phycoerythrin，PE)的单克隆抗体进行处理。使用流式细胞计来测量显示阳性信号的细胞组的表达水平。图9显示了结果。

用创伤弧菌的重组FlaB来处理人树突细胞时，意味着树突细胞成熟的CD80、CD83和CD86阳性的百分比水平分别增长了67.3％、23.57％和43.29％。这些水平的增长速率比对照组中的15.29％、0.82％和1.5％高得多。然而，在骨髓细胞上选择地表达的CD14成熟水平降低更多。沙门氏菌的鞭毛蛋白FliC显示出相似的表现。

工业实用性

如以上结果所示，创伤弧菌鞭毛蛋白的结构成分FlaA、FlaB、FlaF、FlaC、FlaD和FlaE，以及沙门氏菌鞭毛蛋白的结构成分FliC和利斯特氏菌鞭毛蛋白的结构成分FlaA刺激上皮细胞的IL-8释放和树突细胞的成熟。还提高了宿主对用作疫苗的免疫刺激剂的抗原特异性免疫应答。

与没有给予鞭毛蛋白作为佐剂的对照组相比，用破伤风类毒素和提及的鞭毛蛋白通过鼻内途径将小鼠免疫时，显示出对抗抗原的IgA水平的显著提高。此外，宿主完全受到保护免受破伤风类毒素的影响。尤其是在阴道洗出物中，IgA水平极大增加，因此可以用作对精子选择性的避孕疫苗的佐剂。

本发明的重组细胞鞭毛蛋白还可以用作对抗其它传染病和抗癌治疗疫苗的有效佐剂。

                            序列表

<110>全南大学校

<120>含有细菌鞭毛蛋白作为活性成分的粘膜疫苗佐剂

<130>P6525YOL

<150>KR10-2004-0001974

<151>2004-01-12

<160>18

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1131

<212>DNA

<213>创伤弧菌(Vibrio vulnificus)

<400>1

atggctatca atgtaaacac taacgtgtca gcaatgaccg cacagcgtta cctaaaccag     60

gccgctgaag gtcaacaaaa atcaatggag cgtttgtctt cgggctataa aatcaatagc    120

gcgaaagatg atgctgcagg tctacaaatt tctaaccgtt tgaactcgca aagccgtggt    180

ctcgacatgg cggttaaaaa tgccaacgat ggtatctcta ttgcacagac tgctgaaggt    240

gcaatgacag agaccaccaa catcctacaa cgtatgcgtg accttgcctt gcaatcgtct    300

aacggttcga actctcgttc tgaacgcgtg gcgattcaag aagaagtgtc agcgttgaac    360

caagaactta accgtatcgc agagacaacc tcttttggtg gtaacaaact ccttaacggt    420

acgtacggtt ctcaatcttt ccaaatcggt gctgactctg gtgaagctgt gatgctttct    480

atgggtaacc ttcgttcaga tacagacgcg atgggcggct tgagctacaa atctgaagaa    540

ggcgtaggcg cagattggcg tgtaagcgac aacactgact tcacgatgtc ttatgtgaat    600

aagcaaggtg aagaaaaaga gatcacagtc aacgccaaag cgggtgacga tcttgaagaa    660

ctggcgactt acatcaacgg tcaaaacgat gatgtgaaag cgtcggtcgg tgaaggcggc     720

aaactgcagc tattcgcttc taaccaacgt gtagaaggtg aagtggaatt cggtggtggt     780

ctagcgtctg agttgaacat tggtgatggc accaaaacca atgtgagcaa cattgatgtc     840

acgacggttg ctggctctca agaagcagta gcgatcattg atggcgcatt gaaatcggta     900

gacagtgagc gtgcetctct aggtgcattc caaaaccgtt tcaaccatgc aatcagcaac     960

ctaagcaaca tcaatgagaa cgtaaacgct tcgagcagcc gtatcaagga taccgactac    1020

gcgaaagaaa cgactcagat gactaagacg caaattctgc agcaggcgag tacttctatc    1080

ctggcgcagg cgaagcagtc accatctgca gctcttagct tgttgggcta a             1131

<210>2

<211>376

<212>PRT

<213>创伤弧菌(Vibrio vulnificus)

<400>2

Met Ala Ile Asn Val Asn Thr Asn Val Ser Ala Met Thr Ala Gln Arg

1               5                   10                  15

Tyr Leu Asn Gln Ala Ala Glu Gly Gln Gln Lys Ser Met Glu Arg Leu

            20                  25                  30

Ser Ser Gly Tyr Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu

        35                  40                  45

Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Ser Gln Ser Arg Gly Leu Asp Met Ala

    50                  55                  60

Val Lys Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Ala Glu Gly

65                  70                  75                  80

Ala Met Thr Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Asp Leu Ala

                85                  90                  95

Leu Gln Ser Ser Asn Gly Ser Asn Ser Arg Ser Glu Arg Val Ala Ile

            100                 105                 110

Gln Glu Glu Val Ser Ala Leu Asn Gln Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

        115                 120                 125

Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr Tyr Gly Ser

    130                 135                 140

Gln Ser Phe Gln Ile Gly Ala Asp Ser Gly Glu Ala Val Met Leu Ser

145                 150                 155                 160

Met Gly Asn Leu Arg Ser Asp Thr Asp Ala Met Gly Gly Leu Ser Tyr

                165                 170                 175

Lys Ser Glu Glu Gly Val Gly Ala Asp Trp Arg Val Ser Asp Asn Thr

            180                 185                 190

Asp Phe Thr Met Ser Tyr Val Asn Lys Gln Gly Glu Glu Lys Glu Ile

        195                 200                 205

Thr Val Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Leu Glu Glu Leu Ala Thr Tyr

    210                 215                 220

Ile Asn Gly Gln Asn Asp Asp Val Lys Ala Ser Val Gly Glu Gly Gly

225                 230                 235                 240

Lys Leu Gln Leu Phe Ala Ser Asn Gln Arg Val Glu Gly Glu Val Glu

                245                 250                 255

Phe Gly Gly Gly Leu Ala Ser Glu Leu Asn Ile Gly Asp Gly Thr Lys

            260                 265                 270

Thr Asn Val Ser Asn Ile Asp Val Thr Thr Val Ala Gly Ser Gln Glu

        275                 280                 285

Ala Val Ala Ile Ile Asp Gly Ala Leu Lys Ser Val Asp Ser Glu Arg

    290                 295                 300

Ala Ser Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Ser Asn

305                 310                 315                 320

Leu Ser Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser SerSer Arg Ile Lys

                325                 330                335

Asp Thr Asp Tyr Ala Lys Glu Thr Thr Gln Met Thr Lys Thr Gln Ile

            340                 345                 350

Leu Gln Gln Ala Ser Thr Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ser Pro

        355                 360                 365

Ser Ala Ala Leu Ser Leu Leu Gly

    370                 375

<210>3

<211>1133

<212>DNA

<213>创伤弧菌(Vibrio vulnificus)

<400>3

atggcagtga atgtaaatac aaacgtagca gcaatgacag cacagcgtta cctgaataac     60

gcaaacagcg cacaacaaac ttcgatggag cgtctgtctt caggtttcaa aatcaacagt    120

gcaaaagatg acgcagccgg tctgcaaatc tctaaccgct tgaacgtaca aagtcgcggt    180

ctagacgttg cggtacgtaa cgccaacgac ggtatctcaa tcgcacaaac cgcagaaggt    240

gcgatgaacg agaccaccaa catcctacaa cgtatgcgtg acctatctct acaatccgcg    300

aacggctcaa actcaaaatc agagcgcgtg gcgattcaag aagaagtgac agcattgaat    360

gacgagctaa accgtattgc agaaaccacg tcttttggtg gtaacaagct gctaaacggt    420

acttacggca cgaaagcaat gcaaattggt gcggataacg gtgaagcggt catgctttca    480

ctgaaagaca tgcgctctga caacgtgatg atgggcggcg tgagctacca agctgaagaa    540

ggcaaagaca agaactggaa tgtggccgca ggcgacaacg acttgacgat tgcactgaca    600

gacagctttg gtaacgagca agagatcgaa atcaacgcga aagcgggtga tgacatcgaa    660

gagctagcga cgtacatcaa cggtcaaact gaccttgtaa aagcgtcagt gggtgaaggc    720

ggcaagctac agatctttgc tggtaacaac aaagttcaag gtgaaattgc tttctcaggt     780

agcctagctg gtgaacttgg cctaggcgaa ggcaaaaacg tcacggtaga cacgattgac     840

gtgacaaccg tacaaggtgc gcaagagtcg gtagcgattg tggatgcggc actgaaatac     900

gtagacagcc accgtgcaga gctgggtgca ttccagaacc gtttcaacca tgcaatcagc     960

aacttggaca acatcaacga aaacgtgaac gcgtcgaaga gccgaatcaa agataccgac    1020

ttcgcgaaag aaacgactca gttgaccaag acacaaattc tatcgcaagc atcaagttcc    1080

attcttgcgc aagcgaaaca agcgccaaac tcagcgctaa gtctactagg cta           1133

<210>4

<211>375

<212>PRT

<213>创伤弧菌(Vibrio vulnificus)

<400>4

Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ala Ala Met Thr Ala Gln Arg

1               5                   10                  15

Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met Glu Arg Leu

            20                  25                  30

Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu

        35                  40                  45

Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu Asp Val Ala

    50                  55                  60

Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Ala Glu Gly

65                  70                  75                  80

Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Asp Leu Ser

                85                  90                  95

Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg Val Ala Ile

            100                 105                 110

Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

        115                 120                 125

Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr Tyr Gly Thr

    130                 135                 140

Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val Met Leu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly Val Ser Tyr

                165                 170                 175

Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala Ala Gly Asp

            180                 185                 190

Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn Glu Gln Glu

        195                 200                 205

Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu Leu Ala Thr

    210                 215                 220

Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val Gly Glu Gly

225                 230                 235                 240

Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln Gly Glu Ile

                245                 250                 255

Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly Glu Gly Lys

            260                 265                 270

Asn Val Thr Val Asp ThrIle Asp Val Thr Thr Val Gln Gly Ala Gln

        275                 280                 285

Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val Asp Ser His

    290                 295                 300

Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Ser

305                 310                 315                 320

Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys Ser Arg Ile

                325                 330                 335

Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr Lys Thr Gln

            340                 345                 350

Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ala

        355                 360                 365

Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu

    370                 375

<210>5

<211>1133

<212>DNA

<213>创伤弧菌(Vibrio vulnificus)

<400>5

gtggcgatca ccgttaatac caatgtggca gcacttgtcg cacagcgtca tttgaccagt     60

gcaaccgaca tgctgaatca atccttggag cgtttgtctt cagggaagcg tattaatagt    120

gcaaaagacg atgcggcagg gctgcaaatt tcgaatcgtc ttcagtcgca aatgcgtggt    180

ttagatatcg cggtgcgaaa tgccaatgat ggcatctcca ttatgcagac tgcggaaggg    240

gcaatgaatg aaaccactaa tattctccaa aggatgcgtg atctttcatt gcaatccgcc    300

aatggttcca atagctatgc tgaaagaata gccttacaag aagaaatgac cgcgttaaat    360

gacgagttga accgtatcgc agaaaccacc tcgttcggtg ggcgtaaatt gctcaatggt    420

tcctttggct cggctgcctt tcagataggg gcagcgtcag gtgaagcggt gcaagtgcaa    480

ctgaagtcga tgcgcagtga tggtattgat atgggtggct tcagttacat tgcaaacgga    540

cgtgcccgtt ctgattggca agtaaaagag ggggcgaatg cgcttagcat gtcattcacg    600

aatcgttttg gtgaaacaga aacgatccaa attaatgcga aagccggcga tgatatcgaa    660

gagcttgcga cctacattaa tggtcagact gacaaagtca cggcatcggt gaatgaagaa    720

ggtcagctac agttgtttat ggccggcgaa gaaacctcag gaacgttatc gttttcagga    780

gacttagcca gtgaactcgg tttgcaacta aaaggttacg atgcggtgga taatatcgac     840

attacttctg tcggtggcgc tcaacaagca gtggctgtcc ttgataccgc gatgaaatac     900

gtcgatagtc atcgtgctga gctaggggca tatcaaaacc gcttcagcca tgcgattaat     960

aacctcgaca acatccacga aaacttggcg acatcaaaca gtcgcattca agatacagac    1020

tatgcgaagg aaaccacgcg catggtcaaa caacagatcc tacagcaagt cagtacttct    1080

attttggcgc aggcgaaaaa agggccgaat ctcgcgttga ccttgctggg ata           1133

<210>6

<211>375

<212>PRT

<213>创伤弧菌(Vibrio vulnificus)

<400>6

Val Ala Ile Thr Val Asn Thr Asn Val Ala Ala Leu Val Ala Gln Arg

1               5                   10                  15

His Leu Thr Ser Ala Thr Asp Met Leu Asn Gln Ser Leu Glu Arg Leu

            20                  25                  30

Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu

        35                  40                  45

Gln Ile Ser Asn Arg Leu Gln Ser Gln Met Arg Gly Leu Asp Ile Ala

    50                  55                  60

Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Met Gln Thr Ala Glu Gly

65                  70                  75                  80

Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Asp Leu Ser

                85                  90                  95

Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Tyr Ala Glu Arg Ile Ala Leu

            100                 105                     110

Gln Glu Glu Met Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

        115                 120                 125

Thr Thr Ser Phe Gly Gly Arg Lys Leu Leu Asn Gly Ser Phe Gly Ser

    130                 135                 140

Ala Ala Phe Gln Ile Gly Ala Ala Ser Gly Glu Ala Val Gln Val Gln

145                 150                 155                 160

Leu Lys Ser Met Arg Ser Asp Gly Ile Asp Met Gly Gly Phe Ser Tyr

                165                 170                 175

Ile Ala Asn Gly Arg Ala Arg Ser Asp Trp Gln Val Lys Glu Gly Ala

            180                 185                 190

Asn Ala Leu Ser Met Ser Phe Thr Asn Arg Phe Gly Glu Thr Glu Thr

        195                 200                 205

Ile Gln Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu Leu Ala Thr

    210                 215                 220

Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Lys Val Thr Ala Ser Val Asn Glu Glu

225                 230                 235                 240

Gly Gln Leu Gln Leu Phe Met Ala Gly Glu Glu Thr Ser Gly Thr Leu

                245                 250                 255

Ser Phe Ser Gly Asp Leu Ala Ser Glu Leu Gly Leu Gln Leu Lys Gly

            260                 265                 270

Tyr Asp Ala Val Asp Asn Ile Asp Ile Thr Ser Val Gly Gly Ala Gln

        275                 280                 285

Gln Ala Val Ala Val Leu Asp Thr Ala Met Lys Tyr Val Asp Ser His

    290                 295                 300

Arg Ala Glu Leu Gly Ala Tyr Gln Asn Arg Phe Ser His Ala Ile Asn

305                 310                 315                 320

Asn Leu Asp Asn Ile His Glu Asn Leu Ala Thr Ser Asn Ser Arg Ile

                325                 330                 335

Gln Asp Thr Asp Tyr Ala Lys Glu Thr Thr Arg Met Val Lys Gln Gln

            340                 345                 350

Ile Leu Gln Gln Val Ser Thr Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Lys Gly

        355                 360                 365

Pro Asn Leu Ala Leu Thr Leu

    370                 375

<210>7

<211>1158

<212>DNA

<213>创伤弧菌(Vibrio vulnificus)

<400>7

atggctgtaa cagtaagcac taacgtatcc gcgatgactg cgcaacgtta tctaaacaaa     60

gcgacagatg agttaaacac ctcaatggaa cgtttgtcat ctggtcataa aattaatagc    120

gccaaagatg atgcggccgg tttgcaaatt tctaaccgct taaccgctca gtctcgtggc    180

ctagatgtgg cgatgcgtaa tgccaacgat ggtatctcta tcgctcaaac cgccgaaggg    240

gcgatgaatg aagcgacggc agtcttgcag cgcatgcgtg acttgtcgat tcaatccgcg    300

aacggtacta actcaacgtc tgagcgccaa gcgattcatg aagaagcgag tgctctacaa    360

gacgaaatta accgtattgc tgaaaccaca tcgtttggtg gacgccgtct actgaatggc    420

acctttggtg atgcagcatt ccagattggt tctaactctg gtgaagcgat gattatgggc    480

ttaaccagca tccgtgccga tgatttccgt atgggtggca cgaccttcca gtctgaaaat    540

ggcaaaaaca aagattggga agtgagcgcg gataacgcag agctgaacat cgtattgcca    600

gagatgggtg aagatgaaga tggcaatgtt atcgatttag aaatcaacat catggcgaaa    660

agcggtgatg atattgaaga attggcaacg tacatcaatg gtcaatcgga ctacatcaac    720

gcatcggtaa gtgaagatgg caagctgcaa atctttgttg ctcaaccaaa tgtgaaaggc    780

gatatctcga tttcgggtag ccttgcctct gaactgggtt tgagtgacga accgattgcg    840

acaacagtac aagatttgga tctgcgtacc gtacaaggtt ctcagaacgc aattagcgtt    900

attgacgcgg cattgaagta cgttgattca caacgtgcgg acttaggtgc aaaacagaac     960

cgtttaagcc acagtattaa taacttggcg aacgttcaag aaaacgttga tgcatcgaac    1020

agccgtatta aagatactga ttttgcgaag gaaacgacgc aaatgacgaa agcacagatt    1080

ttgcaacagg caggtacttc tattcttgct caagcaaaac aattgccaaa ctctgcaatg    1140

tcactattgc agggctaa                                                  1158

<210>8

<211>383

<212>PRT

<213>创伤弧菌(Vibrio vulnificus)

<400>8

Met Ala Val Thr Val Ser Thr Asn Val Ser Ala Met Thr Ala Gln Arg

1               5                   10                  15

Tyr Leu Asn Lys Ala Thr Asp Glu Leu Asn Thr Ser Met Glu Arg Leu

            20                  25                  30

Ser Ser Gly His Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu

        35                  40                  45

Gln Ile Ser Asn Arg Leu Thr Ala Gln Ser Arg Gly Leu Asp Val Ala

    50                  55                  60

Met Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Ala Glu Gly

65                  70                  75                  80

Ala Met Asn Glu Ala Thr Ala Val Leu Gln Arg Met Arg Asp Leu Ser

                85                  90                  95

Ile Gln Ser Ala Asn Gly Thr Asn Ser Thr Ser Glu Arg Gln Ala Ile

            100                 105                 110

His Glu Glu Ala Ser Ala Leu Gln Asp Glu Ile Asn Arg Ile Ala Glu

        115                 120                 125

Thr Thr Ser Phe Gly Gly Arg Arg Leu Leu Asn Gly Thr Phe Gly Asp

    130                 135                 140

Ala Ala Phe Gln Ile Gly Ser Asn Ser Gly Glu Ala Met Ile Met Gly

145                 150                 155                 160

Leu Thr Ser Ile Arg Ala Asp Asp Phe Arg Met Gly Gly Thr Thr Phe

                165                 170                 175

Gln Ser Glu Asn Gly Lys Asn Lys Asp Trp Glu Val Ser Ala Asp Asn

            180                 185                 190

Ala Glu Leu Asn Ile Val Leu Pro Glu Met Gly Glu Asp Glu Asp Gly

        195                 200                 205

Asn Val Ile Asp Leu Glu Ile Asn Ile Met Ala Lys Ser Gly Asp Asp

    210                 215                 220

Ile Glu Glu Leu Ala Thr Tyr Ile Asn Gly Gln Ser Asp Tyr Ile Asn

225                 230                 235                 240

Ala Ser Val Ser Glu Asp Gly Lys Leu Gln Ile Phe Val Ala Gln Pro

                245                 250                 255

Asn Val Lys Gly Asp Ile Ser Ile Ser Gly Ser Leu Ala Ser Glu Leu

            260                 265                 270

Gly Leu Ser Asp Glu Pro Ile Ala Thr Thr Val Gln Asp Leu Asp Leu

        275                 280                 285

Arg Thr Val Gln Gly Ser Gln Asn Ala Ile Ser Val Ile Asp Ala Ala

    290                 295                 300

Leu Lys Tyr Val Asp Ser Gln Arg Ala Asp Leu Gly Ala Lys Gln Asn

305                 310                 315                 320

Arg Leu Ser His Ser Ile Asn Asn Leu Ala Asn Val Gln Glu Asn Val

                325                 330                 335

Asp Ala Ser Asn Ser Arg Ile Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr

            340                 345                 350

Thr Gln Met Thr Lys Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Ile

        355                 360                 365

Leu Ala Gln Ala Lys Gln Leu Pro Asn Ser Ala Met Ser Leu Leu

    370                 375                 380

<210>9

<211>1134

<212>DNA

<213>创伤弧菌(Vibrio vulnificus)

<400>9

atggcagtga atgtaaatac aaacgtagca gcaatgacag cacagcgtta cctgaataac     60

gcaaacagcg cacaacaaac ttcgatggag cgtctgtctt caggtttcaa aatcaacagt    120

gcaaaagatg acgcagccgg tctgcaaatc tctaaccgct tgaacgtgca aagtcgcggt    180

ctagacgttg cggtacgtaa cgccaacgac ggtatctcaa tcgcacaaac cgcagaaggt    240

gcgatgaacg agaccaccaa catcctacaa cgtatgcgtg acctatctct gcaatcagcg    300

aacggctcaa actcaaaatc agagcgcgtg gcgattcaag aagagatcac cgcattgaac    360

gacgagctaa accgtatcgc agaaaccacg tcttttggtg gtaacaaact gctcaacggc    420

acttacggca cgaaagcaat gcaaattggt gcggataacg gtgaagcggt catgctgtca    480

ctcaaagaca tgcgctctga caacgtgatg atgggcggcg tgagctacca agctgaagaa    540

ggcaaagaca agaactggaa tgtggccgca ggcgacaacg acttgacgat tgcactgaca    600

gacagctttg gtaacgagca agagatcgaa atcaacgcga aagcgggcga tgacatcgaa    660

gagctagcga cgtacatcaa cggtcaaact gaccttgtaa aagcgtcagt gggtgaaggc    720

ggcaagctac agatctttgc tggtaacaac aaagttcaag gtgaaattgc tttctcaggt    780

agcctagctg gtgaacttgg cctaggcgaa ggcaaaaacg tcacggtaga cacgattgac    840

gtgacaaccg tacaaggtgc gcaagagtcg gtagcgattg tggatgcggc actgaaatac     900

gtagacagcc accgtgcaga gctgggtgca ttccagaacc gtttcaacca tgcaatcagc     960

aacttggaca acatcaacga gaacgtgaac gcgtcgaaga gccgaatcaa agataccgac    1020

ttcgcgaaag aaacgactca gttgaccaag acacaaattc tatcgcaagc atcaagttcc    1080

attcttgcgc aagcgaaaca agcgccaaac tcagcgctaa gtctactagg ctaa          1134

<210>10

<211>377

<212>PRT

<213>创伤弧菌(Vibrio vulnificus)

<400>10

Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ala Ala Met Thr Ala Gln Arg

1               5                   10                  15

Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met Glu Arg Leu

            20                  25                  30

Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu

        35                  40                  45

Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu Asp Val Ala

    50                  55                  60

Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Ala Glu Gly

65                  70                  75                  80

Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Asp Leu Ser

                85                  90                  95

Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg Val Ala Ile

            100                 105                 110

Gln Glu Glu Ile Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

        115                 120                 125

Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr Tyr Gly Thr

    130                 135                 140

Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val Met Leu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly Val Ser Tyr

                165                 170                 175

Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala Ala Gly Asp

            180                 185                 190

Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn Glu Gln Glu

        195                 200                 205

Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu Leu Ala Thr

    210                 215                 220

Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val Gly Glu Gly

225                 230                 235                 240

Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln Gly Glu Ile

                245                 250                 255

Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly Glu Gly Lys

            260                 265                 270

Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln Gly Ala Gln

        275                 280                 285

Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val Asp Ser His

    290                 295                 300

Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Ser

305                 310                 315                 320

Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys Ser Arg Ile

                325                 330                 335

Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr Lys Thr Gln

            340                 345                 350

Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ala

        355                 360                 365

Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly

    370                 375

<210>11

<211>1127

<212>DNA

<213>创伤弧菌(Vibrio vulnificus)

<400>11

atggtttcac tcaataccaa cgtgtctgcg atggtcgctc agaggcatct gagcacagcg     60

gcaagtcagg tagctgaaac ccaaaaaaat ctaagttccg gattccgaat taatagtgcc    120

agcgatgatg ccgctggaat gcagatagcg aatacgcttc acgtccaaac ccgtggtttg    180

gatgtggcat taactaacgc tcatagtgct tatgctgttg cagaaacagc ggaaggggcg    240

ttggaagagg gcagtgaaat actgcagaga ttgcgatctc tttctcttca agccgcaaac    300

ggatcgaatt ctgatgagga tcggcaaagt ttgcagttgg aagtggtggt attgaaagat    360

gaagtggaaa gaatagccag gacaaccaca tttgcgggta aaaatctgtt tgatggaagt    420

tatggttcaa aaagttttca tcttggggca aattctaatt ccatttcttt gcaactcaaa    480

aacatgcgga ctcacgttcc tgagatgggc gggtatcatt accttgcctc ggagccagcg    540

gatgaggatt ggcaagttga caaggaatca aggcaactta gctttacttt tcgagatagc    600

gaaggggatg atcaatccat taagatctcg cttaagcctg gagacagtct cgaagaagtc    660

gctacgtata tcaattcaca gcaaaatgtt gtggagtcct cggtgacgga tgatcggcga    720

ttgcagtttt atgtcgctaa tcgtcacgct cctgatggtt taaatatctc aggaagcttg    780

gagggagagc tagactttga accgcaagga caagtgacgc tcgatgaact cgatatcagt    840

agtgtgggtg gtgctcaatt ggcgattgct gttgttgata ctgcaattca atatctggat    900

tctcaccgaa gtgaaatcgg cagttttcaa aatcgggtag aggggacgat ggacaatttg     960

caaagtatca atcgcaatgt cactgaatca aaagggcgaa tatgggatac cgattttgcg    1020

aaagcatcaa ccgctttagt gaagtctcag gtattgcaac aggctacctc tgccttgctg    1080

gctcaagcca agcaagcccc aggcagtgca attggattgc tatctta                  1127

<210>12

<211>375

<212>PRT

<213>创伤弧菌(Vibrio vulnificus)

<400>12

Met Val Ser Leu Asn Thr Asn Val Ser Ala Met Val Ala Gln Arg His

1               5                   10                  15

Leu Ser Thr Ala Ala Ser Gln Val Ala Glu Thr Gln Lys Asn Leu Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Phe Arg Ile Asn Ser Ala Ser Asp Asp Ala Ala Gly Met Gln

        35                  40                  45

Ile Ala Asn Thr Leu His Val Gln Thr Arg Gly Leu Asp Val Ala Leu

    50                  55                  60

Thr Asn Ala His Ser Ala Tyr Ala Val Ala Glu Thr Ala Glu Gly Ala

65                  70                  75                  80

Leu Glu Glu Gly Ser Glu Ile Leu Gln Arg Leu Arg Ser Leu Ser Leu

                85                  90                  95

Gln Ala Ala Asn Gly Ser Asn Ser Asp Glu Asp Arg Gln Ser Leu Gln

            100                 105                 110

Leu Glu Val Val Val Leu Lys Asp Glu Val Glu Arg Ile Ala Arg Thr

        115                 120                 125

Thr Thr Phe Ala Gly Lys Asn Leu Phe Asp Gly Ser Tyr Gly Ser Lys

    130                 135                 140

Ser Phe His Leu Gly Ala Asn Ser Asn Ser Ile Ser Leu Gln Leu Lys

145                 150                 155                 160

Asn Met Arg Thr His Val Pro Glu Met Gly Gly Tyr His Tyr Leu Ala

                165                 170                 175

Ser Glu Pro Ala Asp Glu Asp Trp Gln Val Asp Lys Glu Ser Arg Gln

            180                 185                 190

Leu Ser Phe Thr Phe Arg Asp Ser Glu Gly Asp Asp Gln Ser Ile Lys

        195                 200                 205

Ile Ser Leu Lys Pro Gly Asp Ser Leu Glu Glu Val Ala Thr Tyr Ile

    210                 215                 220

Asn Ser Gln Gln Asn Val Val Glu Ser Ser Val Thr Asp Asp Arg Arg

225                 230                 235                 240

Leu Gln Phe Tyr Val Ala Asn Arg His Ala Pro Asp Gly Leu Asn Ile

                245                 250                 255

Ser Gly Ser Leu Glu Gly Glu Leu Asp Phe Glu Pro Gln Gly Gln Val

            260                 265                 270

Thr Leu Asp Glu Leu Asp Ile Ser Ser Val Gly Gly Ala Gln Leu Ala

        275                 280                 285

Ile Ala Val Val Asp Thr Ala Ile Gln Tyr Leu Asp Ser His Arg Ser

    290                 295                 300

Glu Ile Gly Ser Phe Gln Asn Arg Val Glu Gly Thr Met Asp Asn Leu

305                 310                 315                 320

Gln Ser Ile Asn Arg Asn Val Thr Glu Ser Lys Gly Arg Ile Trp Asp

                325                 330                 335

Thr Asp Phe Ala Lys Ala Ser Thr Ala Leu Val Lys Ser Gln Val Leu

            340                 345                 350

Gln Gln Ala Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ala Pro Gly

        355                 360                 365

Ser Ala Ile Gly Leu Leu Ser

    370                 375

<210>13

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>随机引物1(arbitrary primer 1)

<400>13

ggccacgcgt cgactagtca nnnnnnnnnn acgccc                      36

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>特异性引物1(specific primer 1)

<400>14

ttcttcacga ggcagacctc agcgc                                  25

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>随机引物2(arbitrary primer 2)

<400>15

ggccaagagt cgactagtca                                        20

<210>16

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>特异性引物2(specific primer 2)

<400>16

ccgcacttgt gtataagagt cag                                             23

<210>17

<211>864

<212>DNA

<213>单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)flaA

<400>17

atgaaagtaa atactaatat cattagcttg aaaacacaag aatatcttcg taaaaataac     60

gaaggcatga ctcaagcgca agaacgtttg gcatctggta aacgtattaa cagttctctt    120

gatgacgctg ctggtcttgc agttgttact cgtatgaacg ttaaatctac aggcttagat    180

gcagcaagca aaaactcatc catgggtatt gacttgttac aaacagcgga ttcagctctt    240

agctccatga gttcaatctt gcaacgtatg cgtcaattag cagtacaatc ttctaacggt    300

tcattcagtg acgaagatcg taaacaatac actgctgaat tcggtagctt gatcaaagaa    360

cttgatcacg ttgctgacac tactaactac aacaacatca aattactaga tcaaactgct    420

acaggtgctg ctactcaagt aagcatccaa gcgtctgata aagctaatga cttaatcaat    480

atcgatcttt tcaatgcgaa aggtctttct gctggaacaa tcactttagg tagtggttct    540

acagttgctg gttatagtgc attatctgtt gctgatgctg attcttctca agaagcaacg    600

gaagctattg atgaattaat caataacatc tctaacggtc gtgcacttct aggtgctggt    660

atgagtcgcc ttagctacaa tgtatctaac gtgaacaacc aatccatcgc aactaaagca    720

tctgcttcct ctattgaaga tgcagatatg gctgctgaaa tgtccgaaat gactaaatac    780

aaaattctta cacaaacatc tatcagcatg ctttctcaag caaaccaaac accgcaaatg    840

ttaactcaat taattaacag ctaa                                           864

<210>18

<211>1488

<212>DNA

<213>鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)fliC

<400>18

atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa cctgaacaaa     60

tcccagtccg ctctgggcac cgctatcgag cgtctgtctt ccggtctgcg tatcaacagc    120

gcgaaagacg atgcggcagg tcaggcgatt gctaaccgtt ttaccgcgaa catcaaaggt    180

ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc    240

gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgct    300

aacagcacca actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgcctg    360

aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaacg gcgtgaaagt cctggcgcag    420

gacaacaccc tgaccatcca ggttggtgcc aacgacggtg aaactatcga tatcgatctg    480

aagcagatca actctcagac cctgggtctg gatacgctga atgtgcaaca aaaatataag    540

gtcagcgata cggctgcaac tgttacagga tatgccgata ctacgattgc tttagacaat    600

agtactttta aagcctcggc tactggtctt ggtggtactg accagaaaat tgatggcgat    660

ttaaaatttg atgatacgac tggaaaatat tacgccaaag ttaccgttac ggggggaact    720

ggtaaagatg gctattatga agtttccgtt gataagacga acggtgaggt gactcttgct    780

ggcggtgcga cttccccgct tacaggtgga ctacctgcga cagcaactga ggatgtgaaa    840

aatgtacaag ttgcaaatgc tgatttgaca gaggctaaag ccgcattgac agcagcaggt    900

gttaccggca cagcatctgt tgttaagatg tcttatactg ataataacgg taaaactatt     960

gatggtggtt tagcagttaa ggtaggcgat gattactatt ctgcaactca aaataaagat    1020

ggttccataa gtattaatac tacgaaatac actgcagatg acggtacatc caaaactgca    1080

ctaaacaaac tgggtggcgc agacggcaaa accgaagttg tttctattgg tggtaaaact    1140

tacgctgcaa gtaaagccga aggtcacaac tttaaagcac agcctgatct ggcggaagcg    1200

gctgctacaa ccaccgaaaa cccgctgcag aaaattgatg ctgctttggc acaggttgac    1260

acgttacgtt ctgacctggg tgcggtacag aaccgtttca actccgctat taccaacctg    1320

ggcaacaccg taaacaacct gacttctgcc cgtagccgta tcgaagattc cgactacgcg    1380

accgaagttt ccaacatgtc tcgcgcgcag attctgcagc aggccggtac ctccgttctg    1440

gcgcaggcga accaggttcc gcaaaacgtc ctctctttac tgcgttaa                 1488