与有丝分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个与有丝分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的蛋白及其编码基因与其在制备与有丝分裂原激活蛋白激酶p38信号通路相关疾病的治疗性药物中的应用。

背景技术

研究表明细胞信号异常与人类疾病密切相关(Mora-Garcia P，Sakamoto KM.Cell signaling defects and human disease.Mol Genet Metab 1999；66(3)：143-71.)。在信号转导过程中起关键作用的蛋白激酶是目前最重要的疾病治疗靶标之一(Cohen P.Protein kinases-the major drug targets of the twenty-firstcentury.Nature Reviews Drug Discovery.2002；1(4)：309-15.)。真核细胞的有丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)超家族包括ERK1/2、JNK1/2/3、p38α/β/γ/δ、ERK4/5及ERK5/BMK1，它们负责将各种胞外刺激信号传递至胞核，从而调控基因表达(Johnson G L and Lapadat R.Mitogen-ActivatedProtein Kinase Pathways Mediated by ERK，JNK，and p38 Protein Kinases.Science.2002；298(5600)：1911-2，Enslen H，Davi s RJ.Regulation of MAP kinases bydocking domains.Biol Cell.2001；93(1-2)：5-14.)。其中，有丝分裂原激活蛋白激酶p38(p38 NAPK)参与炎症、应急、发育、细胞生长与凋亡、细胞周期调控、缺血/再灌损伤及心肌肥厚等生理、病理过程中的信号传导(Herlaar E，Brown Z.p38MAPK signalling cascades in inflammatory disease.Mol Med Today.1999；5(10)：439-47，Ambrosino C，Nebreda AR.Cell cycle regulation by p38 MAP kinases.Biol Cell 2001；93(1-2)：47-51，Takeda K，Ichijo H.Neuronal p38 signalling：an emerging regulator of cell fate and function in the nervous system.GenesCells 2002；7(11)：1099-111，Bulavin DV，Higashimoto Y，Popoff IJ，et al.Initiation of a G2/M checkpoint after ultraviolet radiation requires p38kinase.Nature.2001；411(6833)：102-7)。抑制p38激酶活性，可有效阻断其介导的病理信号转导，从而减轻、甚至消除其病理现象(Lee JC，Kumar S，GriswoldDE.et al.Inhibition of p38 MAP kinase as a therapeutic strategy.Immunopharmacology.2000；47(2-3)：185-201，Lee JC，Kassis S，Kumar S，et al.p38 mitogen-activated protein kinase inhibitors--mechanisms and therapeuticpotentials.Pharmacol Ther.1999；82(2-3)：389-97)。例如：p38激酶的抑制剂可减轻缺血性脑损伤(Barone FC，Irving EA，Ray AM，et al.SB 239063，asecond-generation p38 inhibitor.reduces brain injury and neurologicaldeficits in cerebral focal ischemia.J Pharmacol Exp Ther 2001；296(2)：312-21)，阻止β-淀粉样肽诱导肌动蛋白应急纤维的形成(Song C，Perides G，Wang D，etal.beta-Amyloid peptide induces formation of actin stress fibers through p38mitogen-activated protein kinase.J Neurochem.2002；83(4)：828-36.)。因此，p38激酶是人们较为关注的药物靶标(Lee JC，Kumar S，Griswold DE，et al.Inhibition of p38 MAP kinase as a therapeutic strategy.Immunopharmacology.2000；47(2-3)：185-201，Lee JC，Kassis S，Kumar S，et al.p38 mitogen-activatedprotein kinase inhibitors--mechanisms and therapeutic potentials.PharmacolTher.1999；82(2-3)：389-97，Adams JL，Badger AM，Kumar S，Lee JC.p38 MAPkinase：molecular target for the inhibition of pro-inflammatory cytokines.Prog Med Chem 2001；)。蛋白质之间的相互作用调控细胞信号传导(Souroujon MC，Mochly-Rosen D.Peptide modulators of protein-protein interactions inintracellular signaling.Nat Biotechnol.1999；16(12)：919-24)。干扰蛋白质之间的相互作用，从而抑制病理信号的转导，已成为一种重要的疾病治疗策略(Huang Z.Structural chemistry and therapeutic intervention ofprotein-protein interactions in immune response，human immunodeficiency virusentry，and apoptosis.Pharmacol Ther.2000；86(3)：20l-15.)。

生物体内正常基因的转录产物因无互补序列不会形成双链RNA，因此生物体内出现了双链RNA就会激发RNAi(RNA interference，RNA干扰)机制。RNA干扰技术是在双链RNA(ds RNA)分子的介导下特异性降解靶基因的生物技术，能使基因表达沉默，达到拮抗靶基因和实现生物(基因)治疗目的。将双链RNA降解成长度为21-25nt的小干扰RNA片段(siRNA，small interfering RNA)，这些小片段会进一步介导与其同源的单链RNA降解。

发明内容

本发明的目的是提供一个与有丝分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与有丝分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的蛋白，名称为NP60，来源于人属人(Homo sapiens)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与有丝分裂原激活蛋白激酶p38相互作用，并对其具有调控作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：1由553个氨基酸残基组成，

编码与有丝分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的蛋白NP60的基因(NP60)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID №：2由1662个碱基组成，其编码序列为自5’端第1至1662位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增NP60中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

将编码本发明蛋白NP60的基因NP60的干扰RNA的编码基因导入宿主，使宿主细胞内NP60沉默，进而可抑制有丝分裂原激活蛋白激酶p38的活性。因此可以NP60干扰RNA的编码基因作为活性成分制备成药物，用于治疗与有丝分裂原激活蛋白激酶p38信号通路相关的疾病，如炎症、缺血/再灌损伤及心肌肥厚等。

所述NP60干扰RNA的编码基因可通过含有所述NP60干扰RNA编码基因的RNAi表达载体导入宿主；用于构建所述RNAi表达载体的出发载体可为任意一种可在人体中表达外源基因的真核表达载体，如pSuper、pSilencer 1.0-U6、pH1-siRNA siRNA、mU6pro等质粒载体或在病毒载体基础上构建的载体，其中，mu6pro为优选的出发载体。

以mU6pro为出发载体，构建的RNAi表达载体为NP60-SiRNA。

本发明提供了一个与有丝分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的蛋白NP60及其编码基因。实验证明，该蛋白可与有丝分裂原激活蛋白激酶p38相互作用，调节有丝分裂原激活蛋白激酶p38的活性，从而介导有丝分裂原激活蛋白激酶p38对炎症、细胞渗透压改变等多种细胞应急反应。因此，本发明的蛋白NP60可作为一个新的药物靶分子，通过干预生物体内有丝分裂原激活蛋白激酶p38的活性，从而达到治疗和该信号通路相关的疾病，如炎症、缺血/再灌损伤及心肌肥厚等。本发明在医学和生物制药领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为ELISA法检测NP60及其结构域突变体和有丝分裂原激活蛋白激酶p38相互作用的结果

图2为Western blotting检测NP60介导的上游激酶对有丝分裂原激活蛋白激酶p38激活作用的结果

图3为Western blotting检测NP60介导细胞渗透压改变对有丝分裂原激活蛋白激酶p38活性调节作用的结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物及探针均由上海生工合成。

实施例1、NP60的克隆

采用酵母双杂交的方法，以有丝分裂原激活蛋白激酶p38作为诱饵蛋白，在人源的胃肠道组织的cDNA文库(Ge，B.，Gram，H.，Di Padova，F.，Huang，B.，New，L.，Ulevitch，R.J.，Luo，Y.and Han，J.(2002).MAPKK-independent activation ofp38alpha mediated by TAB1-dependent autophosphorylation of p38alpha.Science295，1291-4)中进行筛选，具体方法如下：

用人源胃肠道组织得到的cDNA文库进行酵母双杂交，筛选与p38相合的蛋白。结果在1.5×10⁷个克隆中筛选得到了四个编码相同基因的克隆(Ge，B.，Gram，H.，DiPadova，F.，Huang，B.，New，L.，Ulevitch，R.J.，Luo，Y.and Han，J.(2002).MAPKK-independent activation of p38alpha mediated by TAB1-dependentautophosphorylation of p38alpha.Science 295，1291-4)。将该基因命名为NP60，测序结果表明该基因具有具有序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列，序列表中的SEQID №：2由1662个碱基组成，其编码序列为自5’端第1至1662位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质。

实施例2、ELISA法检测NP60与有丝分裂原激活蛋白激酶p38的相互作用

一、NP60及其各结构域缺失突变体、有丝分裂原激活蛋白激酶p38的原核表达

1、构建分别含有NP60、NP60各结构域缺失突变体基因、有丝分裂原激活蛋白激酶p38基因的原核表达载体

将实施例1获得的基因NP60用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切后，与经相同酶酶切的载体PGEX4T-1(Promega，Madison，WI)连接，得到NP60的原核表达载体，命名为GST-NP60-PGEX4T-1。NP60各结构域缺失突变体的表达载体构建：以NP60全长序列表达载体GST-NP60-PGEX4T-1为模版，PCR得到NP60三个结构域缺失突变体序列，将这三个结构域缺失突变体分别命名为：ΔPWWP-NP60(87-553aa)、ΔAT-NP60(185-553aa)、ΔNAD-NP60(1-353aa)。再用相同方法将PCR扩增的上述三种NP60结构域缺失突变体序列分别克隆入载体PGEX4T-1中，得到三种NP60结构域缺失突变体的原核表达载体。有丝分裂原激活蛋白激酶p38基因的原核表达载体的构建方法参见文献(Jiang，Y.，Chen.C，Li，Z.et al.，Characterization of the structureand function of a new mitogen-activated protein kinase(p38beta)，J.Biol.Chem.，1996，271(30)：17920-17926.)。

2、NP60及其各结构域缺失突变体有丝分裂原激活蛋白激酶p38的原核表达

将步骤1构建的NP60的原核表达载体GST-NP60-PGEX4T-1及各结构域缺失突变体的原核表达载体和有丝分裂原激活蛋白激酶p38基因的原核表达载体分别用CaCl₂法转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，经筛选，得到几种重组菌的阳性克隆；将几种重组子分别接种于100mL液体LB培养基中，在37℃下，培养至OD_600nm＝0.6后加IPTG至终浓度1mM，于30℃诱导表达3小时。培养结束后，对表达产物进行12％ SDS-PAGE电泳检测，结果经表达获得了分子量分别为86KD(GST-NP60蛋白)、77KD(GST-ΔPWWP-NP60蛋白)、66KD(GST-ΔAT-NP60蛋白)、64KD(GST-ΔNAD-NP60蛋白)和40KD(his-p38蛋白)的蛋白，与预期结果相符，然后对上述蛋白分别进行纯化。

二、ELISA法检测NP60及其结构域缺失突变体与有丝分裂原激活蛋白激酶p38的相互作用

用ELISA的方法检测步骤一中经纯化的蛋白NP60及其结构域缺失突变体与有丝分裂原激活蛋白激酶p38的相互作用，具体方法为：取1ug纯化的GST，GST-NP60，GST-ΔPWWP-NP60，GST-ΔAT-NP60，GST-ΔNAD-NP60及GST-ATF₂(重组蛋白经AmershamBiosciences公司的Glutathione Sepherose4B亲和柱纯化，纯化方法详见使用说明)分别包被于96孔酶标板，然后加入含3％脱脂奶粉的PBST(含1‰Tween20的磷酸盐缓冲液，pH7.6)于37℃封闭1h。另取0.1ug his-p38溶于含3％脱脂奶粉的PBST，37℃结合1h，用PBST液洗涤3次，然后依次加入鼠抗-p38单克隆抗体以及辣根过氧化物酶耦连的羊抗鼠抗体(均购自Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)(1∶1000)依次37℃结合1h，PBST洗涤3次后加入100ul TMB室温反应15min，然后加50ul H₂SO₄终止反应，于450nm检测吸光值。检测结果如图1所示(GST、GST-NP60、ΔPWWP-NP60、ΔAT-NP60、ΔNAD-NP60、GST-ATF₂代表GST蛋白以及与GST融合的NP60以及其三个结构域分别缺失的突变体以及ATF₂蛋白；“+”分别表示该样品中参入指定量的该蛋白，“-”表示未参入)，结果与阴性对照GST蛋白相比，GST-NP60、GST-ΔPWWP-NP60、GST-ΔNAD-NP60均能与p38结合，而GST-ΔAT-NP60突变体则与p38无结合活性。表明NP60可以与有丝分裂原激活蛋白激酶p38发生相互作用，且结合的关键序列可能位于AT-hook结构域(序列表中SEQ ID №：1的自N端第88到184位氨基酸残基)。

实施例三、检测293T及293GP细胞中NP60介导的上游激酶对有丝分裂原激活蛋白激酶p38的激活

一、NP60、有丝分裂原激活蛋白激酶p38的真核表达

1、NP60、有丝分裂原激活蛋白激酶p38基因及其上游激酶MKK6b基因的真核表达载体的构建

以293T细胞总RNA的反转录产物为模版，在正向引物5’-CATATGGCGGCTGTGAGTCTG-3’和反向引物5’-CTCGAGATGTATGTAGGCTCGGTA-3’的引导下，PCR扩增NP60基因，将1668bp的PCR产物经限制性内切酶EcoR I及Xho I酶切后克隆入经相同酶酶切的载体pcDNA6Myc/His A(Invitrogen，Rockyille，MA)中。有丝分裂原激活蛋白激酶p38基因和MKK6b基因的真核表达质粒的构建方法参见文献：(Han J，Lee JD，Jiang Y，Li Z，Feng L，Ulevitch RJ.Characterization of thestructure and function of a novel MAP kinase kinase(MKK6)J Biol Chem.1996Feb 9；271(6)：2886-91.)。将构建的NP60、有丝分裂原激活蛋白激酶p38基因及其上游激酶MKK6b基因的真核表达载体，分别命名为myc-NP60，flag-p38以及HA-MKK6b。

2、NP60、有丝分裂原激活蛋白激酶p38的真核表达

将步骤1构建的NP60、有丝分裂原激活蛋白激酶p38基因及其上游激酶MKK6b基因的真核表达载体myc-NP60，flag-p38以及HA-MKK6b分别用磷酸钙法法转染真核细胞293T，瞬时过表达。

二、Western blotting检测NP60介导的上游激酶对有丝分裂原激活蛋白激酶p38的激活作用

提取步骤一的经培养后阳性转染细胞的总蛋白，用有丝分裂原激活蛋白激酶p38磷酸化的蛋白为抗体(New England BioLabs，Beverley，MA)，用Western blotting法检测有丝分裂原激活蛋白激酶p38是否磷酸化。检测结果如图2所示(p38a、myc-NP60、MKK6b分别表示过表达NP60、有丝分裂原激活蛋白激酶p38基因及MKK6b基因于293T细胞，“+、-”的含义分别代表转染或未转染，*P-p38a表示用磷酸化p38的抗体检测得到的Western blot结果)，表明过表达NP60可以增强p38的磷酸化水平，表明NP60可协助有丝分裂原激活蛋白激酶p38的激活。

实施例四、检测细胞渗透压改变时NP60对有丝分裂原激活蛋白激酶p38活性的调节作用

一、细胞内源NP60的沉默

以293GP细胞为例，检测细胞渗透压改变时NP60对有丝分裂原激活蛋白激酶p38活性的调节作用。首先利用RNA干扰技术，将293GP细胞内源的NP60沉默，具体方法如下：

1、NP60的RNAi干扰载体的构建

干涉靶序列编码基因的正义序列为5’-gctgtggatgctgttgaag-3’(19bp)，反义序列为5’-cttcaacagcatccacagc-3’(19bp)，以TTCG为Loop，连入干涉载体mU6pro(Yu，J.Y.，DeRuiter，S.L.and Turner，D.L.(2002).RNA interference byexpression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.ProcNatl Acad Sci USA 99，6047-52)，将构建的NP60的RNAi干扰载体命名为NP60-SiRNA。

2、细胞内源NP60的沉默及检测

将步骤1构建的NP60的RNAi干扰载体NP60-SiRNA用磷酸钙法法转染293GP细胞，再用PCR的方法对阳性转染细胞做进一步检测，检测方法为：提取细胞总RNA，以反转录产物为模版，在正向引物5’-gagtctagtaccgtgaaggg-3’和反向引物5’-gatcccttgcagcacaccac-3’的引导下，PCR检测NP60基因，以actin基因为对照，扩增actin基因片段的引物为5’-caccaactgggacgacat3’(正向引物)和5’-catactcctgcttgctgatc3’(反向引物)，检测结果表明获得了NP60沉默的293GP细胞。

二、检测细胞渗透压改变时NP60对有丝分裂原激活蛋白激酶p38活性的调节作用

用0.3M山梨糖醇(sorbitol)刺激步骤一获得的NP60沉默的293GP细胞30分钟。然后，收集细胞，提取细胞的总蛋白。用与实施例3相同的方法检测有丝分裂原激活蛋白激酶p38是否磷酸化，检测结果如图3所示(mu6、NP60-SiRNA分别表示转染有mU6pro和NP60-SiRNA干涉质粒的293GP细胞，0.3M Sorbitol表示给予上述转染细胞0.3M山梨醇的刺激，“+、-”分别表示转染或未转染、以及刺激或未刺激；*P-p38、*P-JNK1/2、*P-ERK1/2、p38、分别表示用磷酸化p38、磷酸化JNK1/2、磷酸化ERK1/2的抗体(均购自New England BioLabs，Beverley，MA)以及p38蛋白的抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)检测的western blot结果)，表明NP60沉默的293GP细胞中，Sorbitol刺激引起的p38的磷酸化水平与对照组相比有减弱，而另两种MAPKs：JNK1/2以及ERK1/2的磷酸化水平则无变化，表明NP60选择性地调节Sorbitol引起的p38的磷酸化水平。在内源NP60沉默的293GP细胞内，山梨糖醇激活有丝分裂原激活蛋白激酶p38的活性丧失，表明NP60可介导细胞渗透压改变对有丝分裂原激活蛋白激酶p38活性的调节。

                             序列表

<160>2

<210>1

<211>553

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

Met Ala Ala Val Ser Leu Arg Leu Gly Asp Leu Val Trp Gly Lys Leu

1               5                   10                  15

Gly Arg Tyr Pro Pro Trp Pro Gly Lys Ile Val Asn Pro Pro Lys Asp

            20                  25                  30

Leu Lys Lys Pro Arg Gly Lys Lys Cys Phe Phe Val Lys Phe Phe Gly

        35                  40                  45

Thr Glu Asp His Ala Trp Ile Lys Val Glu Gln Leu Lys Pro Tyr His

    50                  55                  60

Ala His Lys Glu Glu Met Ile Lys Ile Asn Lys Gly Lys Arg Phe Gln

65                  70                  75                  80

Gln Ala Val Asp Ala Val Glu Glu Phe Leu Arg Arg Ala Lys Gly Lys

                85                  90                  95

Asp Gln Thr Ser Ser His Asn Ser Ser Asp Asp Lys Asn Arg Arg Asn

            100                 105                 110

Ser Ser Glu Glu Arg Ser Arg Pro Asn Ser Gly Asp Glu Lys Arg Lys

        115                 120                 125

Leu Ser Leu Ser Glu Gly Lys Val Lys Lys Asn Met Gly Glu Gly Lys

    130                 135                 140

Lys Arg Val Ser Ser Gly Ser Ser Glu Arg Gly Ser Lys Ser Pro Leu

145                 150                 155                 160

Lys Arg Ala Gln Glu Gln Ser Pro Arg Lys Arg Gly Arg Pro Pro Lys

                165                 170                 175

Asp Glu Lys Asp Leu Thr Ile Pro Glu Ser Ser Thr Val Lys Gly Met

            180                 185                 190

Met Ala Gly Pro Met Ala Ala Phe Lys Trp Gln Pro Thr Ala Ser Glu

        195                 200                 205

Pro Val Lys Asp Ala Asp Pro His Phe His His Phe Leu Leu Ser Gln

    210                 215                 220

Thr Glu Lys Pro Ala Val Cys Tyr Gln Ala Ile Thr Lys Lys Leu Lys

225                 230                 235                 240

Ile Cys Glu Glu Glu Thr Gly Ser Thr Ser Ile Gln Ala Ala Asp Ser

                245                 250                 255

Thr Ala Val Asn Gly Ser Ile Thr Pro Thr Asp Lys Lys Ile Gly Phe

            260                 265                 270

Leu Gly Leu Gly Leu Met Gly Ser Gly Ile Val Ser Asn Leu Leu Lys

        275                 280                 285

Met Gly His Thr Val Thr Val Trp Asn Arg Thr Ala Glu Lys Cys Asp

    290                 295                 300

Leu Phe Ile Gln Glu Gly Ala Arg Leu Gly Arg Thr Pro Ala Glu Val

305                 310                 315                 320

Val Ser Thr Cys Asp Ile Thr Phe Ala Cys Val Ser Asp Pro Lys Ala

                325                 330                 335

Ala Lys Asp Leu Val Leu Gly Pro Ser Gly Val Leu Gln Gly Ile Arg

            340                 345                 350

Pro Gly Lys Cys Tyr Val Asp Met Ser Thr Val Asp Ala Asp Thr Val

        355                 360                 365

Thr Glu Leu Ala Gln Val Ile Val Ser Arg Gly Gly Arg Phe Leu Glu

    370                 375                 380

Ala Pro Val Ser Gly Asn Gln Gln Leu Ser Asn Asp Gly Met Leu Val

385                 390                 395                 400

Ile Leu Ala Ala Gly Asp Arg Gly Leu Tyr Glu Asp Cys Ser Ser Cys

                405                 410                 415

Phe Gln Ala Met Gly Lys Thr Ser Phe Phe Leu Gly Glu Val Gly Asn

            420                 425                 430

Ala Ala Lys Met Met Leu Ile Val Asn Met Val Gln Gly Ser Phe Met

        435                 440                 445

Ala Thr Ile Ala Glu Gly Leu Thr Leu Ala Gln Val Thr Gly Gln Ser

    450                 455                 460

Gln Gln Thr Leu Leu Asp Ile Leu Asn Gln Gly Gln Leu Ala Ser Ile

465                 470                 475                 480

Phe Leu Asp Gln Lys Cys Gln Asn Ile Leu Gln Gly Asn Phe Lys Pro

                485                 490                 495

Asp Phe Tyr Leu Lys Tyr Ile Gln Lys Asp Leu Arg Leu Ala Ile Ala

            500                 505                 510

Leu Gly Asp Ala Val Asn His Pro Thr Pro Met Ala Ala Ala Ala Asn

        515                 520                 525

Glu Val Tyr Lys Arg Ala Lys Ala Leu Asp Gln Ser Asp Asn Asp Met

    530                 535                 540

Ser Ala Val Tyr Arg Ala Tyr Ile His

545                 550

<210>2

<211>1662

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

ATGGCGGCTG TGAGTCTGCG GCTCGGCGAC TTGGTGTGGG GGAAACTCGG CCGATATCCT     60

CCTTGGCCAG GAAAGATTGT TAATCCACCA AAGGACTTGA AGAAACCTCG CGGAAAGAAA    120

TGCTTCTTTG TGAAATTTTT TGGAACAGAA GATCATGCCT GGATCAAAGT GGAACAGCTG    180

AAGCCATATC ATGCTCATAA AGAGGAAATG ATAAAAATTA ACAAGGGTAA ACGATTCCAG    240

CAAGCGGTAG ATGCTGTCGA AGAGTTCCTC AGGAGAGCCA AAGGGAAAGA CCAGACGTCA    300

TCCCACAATT CTTCTGATGA CAAGAATCGA CGTAATTCCA GTGAGGAGAG AAGTAGGCCA    360

AACTCAGGTG ATGAGAAGCG CAAACTTAGC CTGTCTGAAG GGAAGGTGAA GAAGAACATG    420

GGAGAAGGAA AGAAGAGGGT GTCTTCAGGC TCTTCAGAGA GAGGCTCCAA ATCCCCTCTG    480

AAAAGAGCCC AAGAGCAAAG TCCCCGGAAG CGGGGTCGGC CCCCAAAGGA TGAGAAGGAT    540

CTCACCATCC CGGAGTCTAG TACCGTGAAG GGGATGATGG CCGGACCGAT GGCCGCGTTT     600

AAATGGCAGC CAACCGCAAG CGAGCCTGTT AAAGATGCAG ATCCTCATTT CCATCATTTC     660

CTGCTAAGCC AAACAGAGAA GCCAGCTGTC TGTTACCAGG CAATCACGAA GAAGTTGAAA     720

ATATGTGAAG AGGAAACTGG CTCCACCTCC ATCCAGGCAG CTGACAGCAC AGCCGTGAAT     780

GGCAGCATCA CACCCACAGA CAAAAAGATA GGATTTTTGG GCCTTGGTCT CATGGGAAGT     840

GGAATCGTCT CCAACTTGCT AAAAATGGGT CACACAGTGA CTGTCTGGAA CCGCACTGCA     900

GAGAAATGTG ATTTGTTCAT CCAGGAGGGG GCCCGTCTGG GAAGAACCCC CGCTGAAGTC     960

GTCTCAACCT GCGACATCAC TTTCGCCTGC GTGTCGGATC CCAAGGCGGC CAAGGACCTG    1020

GTGCTGGGCC CCAGTGGTGT GCTGCAAGGG ATCCGCCCTG GGAAGTGCTA CGTGGACATG    1080

TCAACAGTGG ACGCTGACAC CGTCACTGAG CTGGCCCAGG TGATTGTGTC CAGGGGGGGG    1140

CGCTTTCTGG AAGCCCCCGT CTCAGGGAAT CAGCAGCTGT CTAATGACGG GATGTTGGTG    1200

ATCTTAGCGG CTGGAGACAG GGGCTTATAT GAGGACTGCA GCAGCTGCTT CCAGGCGATG    1260

GGGAAGACCT CCTTCTTCCT AGGTGAAGTG GGCAATGCAG CCAAGATGAT GCTGATCGTG    1320

AACATGGTCC AAGGGAGCTT CATGGCCACT ATTGCCGAGG GGCTGACCCT GGCCCAGGTG    1380

ACAGGCCAGT CCCAGCAGAC ACTCTTGGAC ATCCTCAATC AGGGACAGTT GGCCAGCATC    1440

TTCCTGGACC AGAAGTGCCA AAATATCCTG CAAGGAAACT TTAAGCCTGA TTTCTACCTG    1500

AAATACATTC AGAAGGATCT CCGCTTAGCC ATTGCGCTGG GTGATGCGGT CAACCATCCG    1560

ACTCCCATGG CAGCTGCAGC AAATGAGGTG TACAAAAGAG CCAAGGCGCT GGACCAGTCC    1620

GACAACGATA TGTCCGCCGT GTACCGAGCC TACATACATT AA                       1662