分析血红蛋白的毛细管电泳方法，用于毛细管电泳的试剂盒，和流动抑制剂在所述方法中的用途

发明领域

本发明涉及分离血红蛋白的毛细管电泳方法，适用于所述分离的缓冲成分，和通过毛细管电泳分析血红蛋白的试剂盒。

发明背景

分析血红蛋白A₂和血红蛋白变异体时，特别在生物液体例如血液内用于分析并尤其用于诊断目的，和由此通过电泳分离血红蛋白时，毛细管电泳(CE)技术的使用是已知的。术语“血红蛋白”意指任何正常或异常的血红蛋白和所述血红蛋白的变异体。毛细管电泳的优点之一在于仅需要极少量的生物液体供分析。进一步地，如果能够使用高电压，通过该技术的分离是非常迅速的，不需要在分离期间过分加热样品。

选择的技术是通过毛细管等电聚焦(CIEF)分析。在各种类型的血红蛋白(Hempe)(7)之间，这种方法能够产生高的分离度。然而，它难以自动操作，而且由于必须使用被涂渍的毛细管以防止电渗流，难以使其与连续实施的分析相容。

称为“动态双涂渍”的进一步的技术可以用Analis以“Analis HbA₂-CEkit”或“CEofix HbA₂-CE kit”出售的商业试剂盒实施。这种技术包括用含聚阳离子、pH为4.7的溶液初步清洗毛细管，接着用含聚阴离子、pH为8.7的分析缓冲液第二次清洗。在这种“双涂渍”方法中，位于毛细管内壁上的阴性电荷的数量高于裸露毛细管，因此电渗流也增大。然而，这种动态双涂渍法不能足够好地分离HbA₂、HbC和HbE组分，致使在有HbC或HbE变异体的情形下不可能定量分析HbA₂组分的。进一步地，由于HbS和HbD组分具有相同的电泳位置，必须在酸性介质中补充分析以测定样品内的变异体类型。最后，在每个样品分析之间必须再次产生双涂渍，致使该方法昂贵并且难以在批量生产的试验中采用。

进一步地，已经描述了自由溶液血红蛋白分离，但是它不满足能够使EC血红蛋白分析合理化的准确度、分离度或速度的预期标准。Ishoka(1)(1992)描述了血红蛋白的分离，采用pH为9.98的硼酸盐缓冲液(100mM)，迁移时间50分钟级，即与目前希望的分析血红蛋白的时间不相符。同样类型的缓冲液在类似pH和浓度条件下(Jenkins)(3)，(4)和(5)在HbA、HbF和HbS组分之间仅能产生不充分的分离。Sahin(2)描述了偏酸性的pH条件在HbA、HbF、HbS和HbA₂组分之间用较低浓度(20mM)的硼酸盐或者pH为8.5的巴比妥(50mM)得到不明显的分离结果，以及在pH 8.0的Tris缓冲液(1M)条件下HbA、HbS和HbA₂组分之间也得到不明显的分离结果。进一步地，已经使用了Tris/精氨酸组合(Shihabi)(6)并且即使它们允许HbA/HbS分离，但HbC/HbE和HbA₂组分未被分离。最后，美国专利US-A-5202006和US-A-5439825描述了巴比妥或乙基巴比妥的用途，它在重要的血红蛋白即HbA、HbF、HbS和HbC之间仅能产生低的分离度。

因此，对于分析血红蛋白并且特别是血红蛋白A₂的方法有需要，这种方法不用双涂渍可以单步骤分析，它能够自动并连续执行，并且它尤其保证在HbA₂、HbC、HbD、HbE、HbS、HbF和HbA型之间满意的分离。

发明内容

申请人现已证实，通过采用与流动抑制剂联合的两性离子分析缓冲剂，特别在自由溶液EC中，在单步骤中极大改善上述组分的分离是可能的，从而避免了补充分离并且不需要双涂渍，它简化了操作。优选地，实施自由溶液毛细管电泳法(FSCE)。

因此，本发明涉及在生物样品中通过毛细管电泳分离血红蛋白，在该方法中含所述血红蛋白的生物样品流过含有分析缓冲剂的毛细管，包括将样品引入含有分析缓冲溶液的毛细管的至少一个步骤，其中缓冲剂是两性离子型并与至少一种流动抑制剂联合。所述步骤通常继之以血红蛋白分离、各种变异体迁移和检测。

本发明使用的两性离子缓冲剂是在pH 8和10之间缓冲的两性离子缓冲剂，包括至少一个胺官能团和至少一个酸性官能团以及在相对于酸性官能团的位置的至少一个羟基官能团。这里使用的术语“酸性官能团”意指羧酸官能团或磺酸官能团。所述两性离子缓冲剂可由一种或两种分子形成：在没有酸性官能团的第一分子携带胺官能团情形下，所述第一分子联合携带酸性官能团特别是羧酸或磺酸官能团或氨基酸的第二分子。可被列举的氨基酸的例子是甘氨酸。

按照本发明，流动抑制剂是脂肪族或环族二胺或多元胺型。例如，它们选自脂肪族二胺或多元胺和/或环二胺或多元胺。优选脂肪族二胺或多元胺。可被列举的脂肪族二胺的例子是1，3-二氨基丙烷，1，4-二氨基丁烷，1，5-二氨基戊烷，1，6-二氨基己烷，N，N′-二甲基-1，6-己二胺，N，N，N′，N′-四甲基-1，4-丁二胺及其可接受的衍生物和盐。可被列举的脂肪族二胺的例子是二乙撑三胺，精胺，四亚乙基五胺及其可接受的衍生物和盐。流动抑制剂可用作混合物。

可被列举的可接受的盐是盐酸盐等等。可被列举的衍生物的例子是以上化合物的衍生物，其中脂肪链的一个或多个碳原子被一个或多个烷基基团取代和/或游离胺的氢之一被一个或多个烷基基团取代。

分析缓冲溶液还可包括其它的助剂，特别是其它用于促进各种血红蛋白分离的助剂。

进一步地，本发明涉及使用已知在自由溶液EC中具有电泳流动抑制活性的化合物与至少一种两性离子缓冲剂联合。

由以下实施例将显而易见，采用本发明的联合能够极大地促进血红蛋白和血红蛋白变异体的分离。因而与采用已知方法实施的分析相比，它能够改善变异体定性和定量分析的准确度和精确度。即使在有HbC或HbE的情形下，它也可量化HbA₂。

本发明的两性离子缓冲剂-流动抑制剂的联合特别用于在样品分析中检测和/或量化HbA₂、HbC、HbD、HbE、HbS、HbF和/或HbA型正常或变异的血红蛋白。

最后，本发明涉及适于通过EC分析生物样品内血红蛋白A₂和血红蛋白变异体的试剂盒，包括至少一种分析缓冲溶液，它含有至少一种两性离子型分析缓冲剂或两性离子缓冲剂和至少一种流动抑制剂，以及任选的pH调节剂。因此，按照本发明这种试剂盒可包括至少一种分析缓冲剂和流动抑制剂，和一种或多种清洗毛细管用溶液和/或用于待分析样品的稀释部分和/或一种(或多种)稀释剂。它们还可包括至少一种溶血溶液。在所述试剂盒中，缓冲剂和抑制剂和稀释剂或其它助剂可分别贮藏以便即时混合，或者作为混合物贮藏。这种试剂盒还任选包括实施分析的指令和/或软件支持信息。

附图说明

从有关附图所述的下列实施例显而易见本发明的其它优点和特征。

图1表示通过采用本发明缓冲溶液的毛细管电泳分析正常人血液(HbA，HbA₂)的电泳图；

图2至5各自表示通过采用同样缓冲溶液的毛细管电泳分析的血液电泳图。血液分别包括以下变异体：图2＝HbF和HbS；图3＝HbC；图4＝HbE；图5＝HbS和HbD-Los Angeles；

图6a、b、c、d各自表示通过采用基于四种不同流动抑制剂的四种不同缓冲溶液的毛细管电泳分析β-地中海贫血血液的电泳图。

图7a、b、c、d每个表示通过采用基于四种不同流动抑制剂的四种不同缓冲溶液的毛细管电泳分析含HbF和HbS的血液的电泳图。

实施毛细管电泳的条件是本领域已知的。它们通常包括以清洗溶液清洗毛细管，以分析缓冲溶液清洗，任选地稀释样品一次或多次，注射样品，迁移和检测。所述步骤可采用自动化机器实施。

实施毛细管电泳的样品条件是适于采用自动化毛细管仪器(SEBIA)的条件。

可被列举适用于本发明的两性离子缓冲剂的例子是具有若干羟基基团的“Tris”型缓冲剂，其具体的例子是下列缓冲剂：Tris(2-氨基-2-[羟甲基]-1，3-丙二醇)，tricine(N-三[羟甲基]甲基甘氨酸)，TAPS(N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸)，TABS(N-三[羟甲基]甲基-4-氨基丁磺酸)，或者AMPD(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)或双Tris丙烷(1，3-双[三(羟甲基)甲氨基]丙烷)，最后两种和Tris可能与氨基酸联合。

其它具有较少数目羟基基团的分子也可以是适合的，特别是例如AMPSO(3-[(1，1-二甲基-2-羟甲基)氨基]-2-羟基-丙磺酸)，bicine(N，N-双[2-羟乙基]甘氨酸)，HEPBS(N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[4-丁磺]酸)。

以上列举的那些中优选的两性离子缓冲剂是tricine。

这些缓冲剂是已知的和市售的。它们还可以用作混合物。

以上列举的那些中优选的流动抑制剂是1，4-二氨基丁烷(DAB)，1，5-二氨基戊烷，1，6-二氨基己烷，二乙撑三胺(DETA)和N，N，N′，N′-四甲基-1，4-丁二胺。这些抑制剂还可以用作混合物。

1，4-二氨基丁烷盐酸盐优选与tricine联合。

术语“本发明的样品”意指待分析的生物样品，即任何来自健康人或虚弱病人的含红细胞的生物液体。人生物液体可以是血液，它可以是正常或异常的，被洗涤，倾析，离心或者是完整的。进一步地，血液可以是已发生溶血的。

除了人生物样品之外，还可分析动物来源样品。样品还可以是合成来源的，并且本发明的方法之后旨在例如监测生产。

这种样品最初可以被适合的稀释溶液例如溶血溶液或分析缓冲溶液稀释。

采用本发明的两性离子缓冲剂/流动抑制剂联合的EC方法在分析血液和分离人样品内血红蛋白及其变异体中具有特别的用途。

按照本发明，分析缓冲溶液的pH在8至11的范围内，优选8至10的范围。

本发明的分析缓冲溶液还包括至少一种pH调节剂。可以使用的pH调节剂的例子是选自氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铷、氢氧化铯、氢氧化钫，或者在烷基部分含有1至8个碳原子的单-、二-、三-或四-烷基铵氢氧化物的化合物。

按照本发明，缓冲剂在常规条件和浓度下用于分析缓冲溶液，即20至500mM级，优选100至250mM。

流动抑制剂以约0.01至50mM的浓度用于缓冲溶液，优选约0.10至20mM。

进一步地，缓冲溶液还包括一种或多种调节离子强度的助剂。

例如，可被列举的这类化合物的例子是例如硫酸盐，氯化物的盐及其混合物。

溶血溶液能实现含血红蛋白A₂和血红蛋白变异体的红细胞的溶解。它还用于在EC分析之前稀释样品。根据其组成，采用额外的轻微机械运动(涡动，搅拌，...)可以让红细胞完全裂解。

溶血溶液包括如上所述的分析缓冲液(两性离子缓冲液)，常规的细胞裂解助剂，例如Triton X100和/或皂苷以及其它将对某些紧挨的血红蛋白之间的分离产生积极效果的任选的助剂。可被列举的例子是Sebia的“HydragelHémoglobine”溶血溶液。

溶血溶液的pH范围是8至11，优选8至10。

本发明的缓冲溶液以适于分析缓冲组合物的常规方法制备，即通过加入液体形式或者固体形式的组分至可接受的载体进行稀释。载体通常是水，它可以是蒸馏过的或软化过的。

毛细管所用材料是通常用于毛细管电泳的那些。可以使用熔融二氧化硅毛细管。它们的内径可以是5至2000μm。优选地，使用内径200μm，优于小于100μm的毛细管。优选地，使用未处理过的内表面的毛细管。本领域技术人员能够采用类型及其尺寸适合分析需要的毛细管。

像这样裸露的毛细管的用途组成本发明的优点。

以约200nm的波长分析已溶血血液的血红蛋白，该血液取自洗涤、倾析或离心过的血液。然而，为了避免血浆蛋白的干扰，它们优选以约415nm波长，使用已发生溶血的取自洗涤、倾析、离心过或全血的血液进行分析。

                           实施例

                         材料和方法

A)毛细管电泳

在装有25微米内径熔融二氧化硅毛细管的EC仪器上进行临床样品的毛细管电泳。

在优化条件下以约415nm进行检测。

样品置于毛细管仪器(SEBIA)内并通过水动注射自动进样。通过施加约550V/cm的电场在少于8分钟内分离样品。在每次分析之前毛细管以0.25M氢氧化钠清洗，接着以分析缓冲液清洗。

分析缓冲液：

使用的化学品是分析级产品。

通过在约900ml软化水中溶解35.84g tricine，接着加入2.32g 1，4-二氨基丁烷盐酸盐(DAB)制备200mM tricine-15mM 1，4-二氨基丁烷(A)缓冲液。用约38.3ml 5M NaOH在22℃调节pH至9.37，缓冲溶液的体积用软化水调节至1升。

通过在约900ml软化水中溶解35.84g tricine，接着加入2.62g 1，5-二氨基戊烷盐酸盐制备200mM tricine-15mM 1，4-二氨基戊烷(B)缓冲液。用约38.4ml 5M NaOH在22℃调节pH至9.40，缓冲溶液的体积以软化水调节至1升。

通过在约900ml软化水中溶解35.84g tricine，接着加入2.06g二乙撑三胺(DETA)制备200mM tricine-20mM二乙撑三胺(C)缓冲液。用约32.4ml5M NaOH在22℃调节pH至9.40，缓冲溶液的体积以软化水调节至1升。

通过在约900ml软化水中溶解35.84g tricine，接着加入1.15gN，N，N′，N′-四甲基-1，4-丁二胺制备200mM tricine-8mM N，N，N′，N′-四甲基-1，4-丁二胺(D)缓冲液。用约34.7ml 5M NaOH在22℃调节pH至9.19，缓冲溶液的体积以软化水调节至1升。

R)临床样品

在溶血溶液中稀释已倾析或离心的人血液至1/6^th用于EC。在约900ml软化水中溶解1.00g Triton X100、2.50g皂苷、3.63g Tris制备(稀释溶液)。在22.0℃调节pH至8.70并用软化水调整溶液的体积至1升。采用的化学品是分析级的。

实施例1至5

如上所述制备Tricine/DAB.2HCl分析缓冲液溶液。

采用以上方法对人血液进行电泳。

实施例1：正常人血液分析，HbA为主峰，HbA₂为较少组分(图1)。

实施例2：病人血液分析，它显示较小的HbA组分，增加的HbF组分，浓的HbS组分和正常的HbA₂组分。杂合的HbS是镰状细胞病(镰状细胞贫血)的起因(图2)。

实施例3：呈现A/C杂合性的病人血液分析。HbC组分正好在HbA₂组分之前，两者之间良好分离。合适的分离使可以进行A₂的量化，这意味着诊断能够定向于β-地中海贫血病例，即具有增加的HbA₂组分(图3)。

实施例4：呈现人血液A/E杂合性的分析。HbE组分正好在HbA₂组分之后，两者完全分离。因此，在有HbE的情形下量化HbA₂没有问题(图4)。

实施例5：呈现A/S杂合性血液和呈现A/D Los Angeles杂合性血液的混合物的分析。HbS和HbD组分部分分离，意味着它们彼此之间能够区分，不需要补充分析(图5)。

实施例6：β-地中海贫血人血液液分析，即具有增大百分比的HbA₂功能且具有少的HbF组分。

如上制备四种分析缓冲溶液A、B、C和D。

采用上述方法进行电泳。

图6a)表示采用缓冲液A(tricine/DAB.2HCl)的结果。图6b表示采用缓冲液B(tricine/1，5-二氨基戊烷.2HCl)的结果。图6c表示采用缓冲液C(tricine/DETA)的结果。图6d表示采用缓冲液D(tricine/N，N，N′，N′-四甲基-1，4-丁二胺)的结果。

这四个附图的比较表明在任何情况下，每种组分的分离良好，并且少的HbF和HbA₂组分被适当地聚焦。

实施例7：呈现镰状细胞(镰状红细胞)杂合性(HbS/HbA)的人血液分析。

如上制备四种分析缓冲溶液(A：tricine/DAB.2HCl；B：tricine/1，5-二氨基戊烷.2HCl；C：tricine/DETA；D：tricine/N，N，N′，N′-四甲基-1，4-丁二胺)(图7)。

采用以上描述的方法进行电泳。

附图的顺序对应于上述缓冲液。在此还观察到与使用缓冲液无关的类似的图。

参考文献

1.Noriaki Ishioka et al，Biomedical Chromatography，vol 6，224-226(1992).

2.Ahmet Sahin et al，Journal of Chromatography A，709(1995)121-125.

3.Margaret A Jenkins，Michael D Guerin，Journal of ChromatographyB，682(1996)，23-24.

4.Margaret A Jenkins，Jean Hendy，Ian L Smith，J CAP ELEC.004：3(1997)，137-143.

5.Margaret A Jenkins，Sujiva Ratnaike，Clinica Chimica Acta 289(1999)121-132.

6.Zak K Shihabi et al.，Electrophoresis，21(2000)，749-752.

7.James M Hempe，Randall D Craver，Electrophoresis，21(2000)743-748.