高羊茅高效农杆菌介导转化体系的建立方法

技术领域

本发明涉及基因工程，具体的说，涉及高羊茅高效农杆菌介导转化体系的建立方法。

背景技术

高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)又称苇状羊茅，是世界温带地区的多年生冷季型草种，原产欧洲西部，具有营养丰富、生长迅速、抗干旱、抗病、耐瘠薄、适应性广等优良特性，既可放牧又可建植草坪。是欧洲和北美重要的栽培牧草之一，并与草地早熟禾并列为最重要的草坪草种。我国20世纪70年代引进，之后成为北方暖温带地区建立人工草地和补播天然草场的重要草种。近年来，高羊茅作为草坪草在我国利用发展很快，黑龙江、北京、山东、江苏、武汉、江西等地都已引种栽培，在我国的草地建设、改良、城市绿化和运动草坪建植中发挥着越来越大的作用。但草质粗糙、适口性差、无匍匐茎、易遭杂草侵害以及不耐寒冷、耐盐性差等缺点使高羊茅的栽培具有一定的局限性。长期以来，同其他牧草和草坪草一样，高羊茅新品种培育基本上都是依靠常规育种方法，工作周期长，定向性不好。另外，高羊茅的遗传学和生殖生物学研究工作薄弱以致遗传改良的研究成功率不高。植物基因工程技术的发展为高羊茅的遗传改良提供了一种很有潜力的手段，利用基因工程技术可有效改善特定性状，为高羊茅耐盐耐旱和耐寒育种开辟新途径。

农杆菌介导的植物基因转化系统是目前已知的唯一天然存在的基因交换因子，已广泛应用于植物基因工程研究。根癌农杆菌细胞中有一种特殊的Ti质粒，该质粒的部分DNA片段可整合到宿主植物基因组中，与宿主基因组一起遗传和表达。由于整合进植物基因组的Ti质粒DNA片段携带有生长素、细胞分裂和合成冠瘿碱等基因，从而使被根癌农杆菌侵染过的植物组织产生冠瘿瘤，并大量合成冠瘿碱。冠瘿碱反过来又促进根癌农杆菌的繁殖和Ti质粒的转移，扩大侵染范围。农杆菌介导转化法比起其他转化方法具有以下优点：

a转化频率高，转化效果好，可转移较大的DNA片段；

b转移的外源基因常为单拷贝整合，很少会发生甲基化和基因沉默；

c遗传稳定，并且多数符合孟德尔遗传规律，转基因植株能较好地用做育种的中间材料；

d整合的外源基因有较明确的边界序列，通常是T-DNA左右界序列；

e价格低廉，对实验条件要求不高。

由于单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，曾认为农杆菌介导法不适于禾谷类等单子叶植株遗传转化(Narasimhulu et al.1996)。单子叶植物难于进行农杆菌转化的原因主要有两点：(1)单子叶植物很少或完全不能产生激活Ti质粒Vir区基因的信号分子；(2)单子叶植物转化的靶组织或细胞不能进行有效的细菌粘附，无明显的创伤反应，不能诱导创伤附近的细胞脱分化形成大量感受态细胞，而只是那些再生和整合转化能力强的感受态细胞才能得到转化植株。至今，以高羊茅胚性愈伤组织为受体的农杆菌介导法转化体系尚停留在实验室研究阶段。

发明内容

本发明的目的是提供高羊茅高效农杆菌介导转化体系的建立方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供了高羊茅高效农杆菌介导转化体系的建立方法，包括如下步骤：

1)高羊茅胚性愈伤组织的制备；

2)供体菌株的培养；

3)抑菌素浓度的确定；

4)农杆菌转化条件的优化；

5)转化胚性愈伤受体材料的筛选培养和植株再生。

步骤1)优选通过高频再生体系制备高羊茅胚性愈伤组织。

步骤2)中抑菌素的浓度筛选培养时为200mg/L，再生培养时浓度为200mg/L。

本发明高羊茅高效农杆菌介导转化体系的建立方法，目的在于克服现有农杆菌介导技术难以应用于禾本科植物遗传转化的缺陷。通过优化农杆菌转化时所涉及到的各项影响条件，包括菌液浓度、侵染时间、侵染条件、共培养时间、抑菌素的添加浓度等，提供了一种适用于高羊茅的农杆菌介导转化体系。克服了现有农杆菌介导技术难以应用于禾本科植物遗传转化的缺陷，建立起了以胚性愈伤为受体材料的高效高羊茅农杆菌介导转化体系。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1受体材料准备

供试高羊茅品种为猎狗5号(Houndog5)，交战II号(Crossfire II)，凌志(Barlexas)，千年盛世(Millennium)诱导的胚性愈伤组织，愈伤诱导培养基是指MS+9mg/L2，4-D+0mg/L6-BA+300mg/L水解酪蛋白；愈伤组织的继代培养基是指MS+9mg/L2，4-D+0.05mg/L6-BA+0.5mg/LKT+50XCu，用Parafilm封闭培养皿，26℃暗培养。挑取年龄3-5个月的胚性愈伤组织预培养7d待侵染。

实施例2抑菌素浓度的确定

农杆菌菌株LBA4404在含不同浓度抑菌素的YEP液体培养基中，28℃200-220rmp暗培养，测菌液OD₆₀₀值。待农杆菌生长至对数生长期，将菌液在常温4000rmp条件下离心10分集菌，在将菌用MS培养液溶解并稀释，使OD₆₀₀值为0.2-0.5，侵染愈伤组织20min，侵染过程中不断震荡，使农杆菌与愈伤充分接触，其中抽真空5min。取出植物材料，用滤纸吸干残留的菌液，转入含有不同浓度抑菌素的愈伤诱导培养基中，26℃暗培养。每天进行污染情况的纪录。

实施3供体菌株培养

从平板上挑取单菌落，接种到附加抗生素的细菌液体培养基中。28℃，200-220rmp恒温摇床上培养至OD₆₀₀为0.5-0.8，将菌液在常温4000rmp条件下离心10分集菌，在将菌用MS培养液溶解并稀释，使OD₆₀₀值为0.3左右进行转化，同时加入100μmol/L乙酰丁香酮(AS)。

侵染：将菌液倒入盛有胚性愈伤组织的无菌小烧杯中，侵染愈伤组织20min，侵染过程中轻轻摇晃使菌液与愈伤组织充分接触，其中抽真空浸泡5min。将侵染后的愈伤置于底层铺有若干灭菌滤纸的培养皿中，上层再次覆盖小块滤纸，并用镊子轻施压力，使愈伤上多余的菌液能够被充分的吸干。再将愈伤组织转入含有100μmol/L AS愈伤诱导培养基上，25℃暗培养，共培养2d。移出愈伤组织放在无菌小烧杯中，无菌水冲洗3-5次，把细菌全部洗去，再用500mg/L头饱霉素(cef)的无菌水浸洗5分钟。

实施例4选择培养

从小烧杯中移出洗过菌的愈伤组织置于底层铺有若干灭菌滤纸的培养皿中，上层再次覆盖小块滤纸，并用镊子轻施压力，使愈伤上多余的水分能够被充分的吸干。转移到含有200mg/Lcef和80mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上，26℃暗培养20d。将存活的愈伤转入到含有200mg/Lcef和80mg/L潮霉素的分化培养基(分化培养基是指1/2MS+0.2mg/L KT)上。将长出的小芽转入到不含筛选剂的分化培养基中待小苗长到3-4片叶时转入生根培养基(生根培养基是指1/2MS+0.5mg/LNAA+0.2mg/LKT)中，壮苗生根。

实施例5抗性植株的移栽

将根叶完全的壮苗室温下炼苗3d后，清洗掉基部的培养基，直接栽入到花盆(基质为沙∶土∶草炭＝1∶1∶1)中，自然光下生长。

实施例6抗性植株的分子检测

提取抗性植株DNA进行PCR检测，

DREB1A引物序列为：

引物F：5’＞AAA GGA TCC TTA CCC GGG TTC TGA TCA ATG AAC

TCA TTT TCT G＜3’，

引物R：5’＞AAA GGT ACC AAT CCC GGG GTT TTA ATA ACT CCA

TAA CGA TAC G＜3’

CMO引物序列为：

引物F：ATG ATG GCA GCAAGC GCAAGC GCAAC

引物R：TTACTT CAAAGTTTG TTG CAACCAGCAGTG G

BADH引物序列为：

引物F：aac GGATCCATG GCG TTC CCAATTCCT GC

引物R：acc GAG CTC TCAAGG AGA CTT GTA CCA TCC CC

取PCR阳性植株的DNA进行Southem印迹杂交鉴定，以目的基因的PCR产物做探针。

实施例7验证实验

取50株抗性植株DNA进行PCR检测，结果与实施例6相同。