Cry1F和Cry1Ac转基因棉花株系及其事件特异性鉴定

发明背景

棉花是重要的纤维农作物。已经将育种和生物技术应用于棉花来提高其农学性状和产物质量。此类农学性状之一抗虫性，抗虫性的优点是显而易见的。已经将编码杀虫蛋白质的基因引入棉花植物。为了减少如下担心，即某种类型昆虫对单一类型杀虫蛋白质产生抗性，经常将植物培育成能产生两种不同类型杀虫蛋白质。因此，昆虫能够对两种不同杀虫蛋白质产生抗性的可能性极其低。

Cry1Ac杀虫蛋白质和基因是本领域已知的。见例如美国专利号6,114,138、5,710,020、6,251,656和6,229,004。Cry1F杀虫蛋白质和基因也是本领域已知的。见例如美国专利号5,188,960、5,691,308、6,096,708和6,573,240。

外来基因在植物中的表达受到该外来基因所插入的染色体位置的影响。这可能源自染色质结构(例如异染色质)或者整合位点附近转录调控元件(例如增强子)的接近(Weising等人，Ann.Rev.Genet 22：421-477，1988)。例如，相同基因在相同类型的转基因植物(或其它生物)中表现出，随不同的事件而表达水平广泛变化。在表达的空间或时间模式上也可能存在差异。例如，转基因在多种植物组织中相对表达上的差异可能与从存在于所导入基因构建体中的转录调控元件所预期的模式不符。

因此，需要产生和筛选大量事件来鉴定任选地表达所导入目的基因的事件。为了商业目的，通常产生数百乃至数千的不同事件并在那些事件中筛选出具有预期转基因表达水平和模式的单一事件。具有预期转基因表达水平和/或模式的事件可用于使用常规育种方法通过两性异型杂交使转基因渗入不同遗传背景中。该杂交的后代保持着最初转化体的转基因表达特性。这个策略用来确保在大量的、良好适应当地生长条件的变种中的可靠基因表达。

可方便地检测特定事件的存在，以便确定两性杂交的后代是否包含目的转基因。此外，检测特定事件的方法将有助于例如遵守上市前批准规程和将来自重组农作物植物的食品标记的规程。可以通过众所周知的任何核酸检测方法检测转基因的存在，核酸检测方法如聚合酶链式反应(PCR)或利用核酸探针的DNA杂交。这些检测方法通常集中于频繁使用的遗传元件，例如启动子、终止子、标记基因等。结果，除非已知临近所插入DNA的染色体DNA序列(“侧翼DNA”)，否则此类方法可能对区别不同的转基因事件、尤其是用同一DNA构建体产生的那些事件是无效的。例如，Windels等人(Med.Fac.Landbouww，Univ.Gent 64/5b：459462，1999)讨论了事件特异性的PCR检测法。这涉及使用跨越插入序列与侧翼DNA间接头的一套引物通过PCR对草甘膦耐受大豆事件40-3-2的鉴定。更加具体而言，一条引物包含来自所插入序列的序列，而第二条引物包含来自侧翼DNA的序列。

美国专利申请20020120964A1和20040009504A1涉及棉花事件PV-GHGT07(1445)和组合物及其检测方法。WO 02/100163涉及棉花事件MONI5985和组合物及其检测方法。WO 2004/011601涉及玉米事件MON863植物和组合物及其检测方法。WO 2004/072235涉及棉花事件MON 88913和组合物及其检测方法。

然而，迄今为止，还不知道能用来特异性鉴定如下文所述积累Cry1F和/或Cry1Ac的棉花的此类方法和材料。

发明简述

本发明涉及植物育种和植物的防虫保护。更加具体而言，本发明包括包含一种或多种如本文所述的、已插入到棉花细胞基因组特异性位点的多核苷酸序列的棉花植物的新型转化事件。在高度优选的实施方案中，所述多核苷酸序列编码“积累的”鳞翅类昆虫抑制蛋白质Cry1F和Cry1Ac。然而，如本文所述，本发明包括具有单一Cry1F事件或Cry1Ac事件的植物。

此外，本发明提供了检测一个或多个本发明事件在样品中存在的测定法。本发明提供了检测棉花中某种抗虫事件存在的DNA及相关测定法。测定法基于插入棉花基因组的重组构建体的DNA序列和插入位点侧翼的基因组DNA序列。本发明还提供了测定时有用的试剂盒和条件。

因此，本发明部分涉及完整的cry1F插入序列、完整的cry1Ac插入序列及其边界区域(在转基因棉花株系中)的DNA序列的克隆和分析。这些序列是独特的。基于这些插入序列和边界序列，产生事件特异性引物。PCR分析表明，这些事件可以通过对使用这些事件特异性引物所产生的PCR扩增子进行分析来鉴定。因此，这些方法以及其它相关方法可以用来独特地鉴定包含一种或多种本发明事件的棉花株系。

附图简述

图1描述了棉花事件281-24-236插入的cry1F转基因和侧翼序列。该图还显示了本文所述的扩增子和引物。

图2描述了棉花事件3006-210-23插入的cry1AC转基因和侧翼序列。该图还显示了本文所述的扩增子和引物。

序列简述

SEQ ID NO：1为cry1F事件281-24-236插入序列及其边界序列的DNA序列。

SEQ ID NO：2为cry1Ac事件3006-210-23插入序列及其边界序列的DNA序列。

SEQ ID NO：3为和反向引物“281-15”一起用来扩增跨越cry1F事件281-24-236的侧翼区域和插入区域之间5’连接处的603bp扩增子的正向引物“281-14”的序列。

SEQ ID NO：4为和正向引物“281-14”一起用来扩增跨越cry1F事件281-24-236的侧翼区域和插入区域之间5’连接处的603bp扩增子的反向引物“281-15”的序列。

SEQ ID NO：5为使用引物SEQ ID NO：3和4产生的扩增子的603 bp序列。

SEQ ID NO：6为和反向引物“281-10”一起用来扩增跨越cry1F事件281-24-236的插入区域和侧翼区域之间3’连接处的562 bp扩增子的正向引物“281-9”的序列。

SEQ ID NO：7为和正向引物“281-9”一起用来扩增跨越cry1F事件281-24-236的侧翼区域和插入区域之间3’连接处的562 bp扩增子的反向引物“281-10”的序列。

SEQ ID NO：8为使用引物SEQ ID NO：6和7产生的扩增子的562 bp序列。

SEQ ID NO：9为和反向引物“3006-22”一起用来扩增跨越cry1Ac事件3006-210-23的侧翼区域和插入区域之间5’连接处的614 bp扩增子的正向引物“3006-20”的序列。

SEQ ID NO：10为和正向引物“3006-20”一起用来扩增跨越cry1Ac事件3006-210-23的侧翼区域和插入区域之间5’连接处的614 bp扩增子的反向引物“3006-22”的序列。

SEQ ID NO：11为使用引物SEQ ID NO：9和10产生的扩增子的614 bp序列。

SEQ ID NO：12为和反向引物“3006-12”一起用来扩增跨越cry1Ac事件3006-210-23的插入区域和侧翼区域之间3’连接处的662 bp扩增子的正向引物“3006-9”的序列。

SEQ ID NO：13为和正向引物“3006-9”一起用来扩增跨越cry1Ac事件3006-210-23的侧翼区域和插入区域之间3’连接处的662 bp扩增子的反向引物“3006-12”的序列。

SEQ ID NO：14为使用引物SEQ ID NO：12和13产生的扩增子的662bp序列。

SEQ ID NO：15为事件281-24-236的棉花基因组DNA片段(缺失53个碱基)。

SEQ ID NO：16为事件3006-210-23的棉花基因组DNA片段(缺失16个碱基)。

发明详述

本发明涉及植物育种和植物的防虫保护。更加具体而言，本发明包括包含一种或多种如本文所述的、已插入到棉花细胞基因组特异性位点的多核苷酸序列的棉花植物(例如陆地棉(Gossypium hirsutum)和海岛棉(Gossypium barbadense))的新型转化事件。在高度优选的实施方案中，所述多核苷酸序列编码“积累的”鳞翅类昆虫抑制蛋白质Cry1F和Cry1Ac。然而，如本文所述，本发明包括具有单一Cry1F事件或Cry1Ac事件的植物。

此外，本发明提供了检测样品中一个或多个本发明事件存在的测定法。本发明方面包括设计和/或产生本文举例说明或建议的任何辨别性核酸分子、尤其是那些完全或部分基于本发明侧翼序列的辨别性核酸分子的方法。

更加具体而言，本发明部分涉及两个转基因棉花事件(cry1F281-24-236和cry1Ac 3006-210-23)、包含这些事件的植物株系以及对这个cry1F插入序列、这些cry1Ac插入序列和/或其边界区域的DNA序列的克隆和分析。本发明的植物株系可以用本文公开和建议的序列进行检测。

在优选的实施方案中，本发明涉及产生两种“积累的”、已知为Cry1F和Cry1Ac的杀虫蛋白质的抗虫性棉花株系及其鉴定。在优选的实施方案中，本发明的植物株系包含cry1F事件281-24-236和cry1Ac事件3006-210-23。然而，本发明的植物可以包含任意一个或者优选地两个本文所讨论的事件。

如上文背景部分暗示，转基因导入及整合进入植物基因组涉及一些随机事件(因此特定插入用名称“事件”表示)。即使用多种转化技术，如农杆菌(Agrobacterium)转化、“基因枪”和WHISKERS时，无法预知转基因将插入到基因组的哪个地方。因此，鉴定插入序列两侧的侧翼植物基因组DNA对于鉴定具有特定插入事件的植物是重要的。例如，可以设计PCR引物来产生跨越插入序列和宿主基因组接头区域的PCR扩增子。该PCR扩增子可以用来鉴定独特或不同类型的插入事件。

由于“事件”是随机事件并且通常不能重复，所以作为本公开的一部分，在美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，Md.20852)保藏了包含cry1F事件281-24-236和cry1Ac事件3006-210-23的棉花株系的至少2500颗种子，公众可无任何限制地(但受限于专利权)获得。给定保藏号为ATCC保藏号PTA-6233。保藏物将无限制地在ATCC储藏所(公共储藏所)存放30年或最近请求后五年或本专利的有效使用期(取更长者)，并且如果保藏物在该期间变成无非存活性的，则需替换。

所保藏的种子是本发明的部分。显然，这些种子可以生长成为棉花植物，而该植物为本发明的部分。本发明还涉及包含在这些棉花植物中、对检测这些植物及其后代有用的DNA序列。本发明的检测方法和试剂盒可以直接鉴定这些事件中的任意一种、两种或者甚至所有三种事件，这取决于检测的最终目的。

本文提供了帮助描述本发明和指导本领域普通技术人员使用本发明的定义和实例。除非另外说明，相关领域普通技术人员将按照常规用途理解这些术语。使用在37CFR§1.822中所述的DNA碱基命名法。

转基因“事件”通过下述步骤产生，即用异源DNA(即包含目的转基因的核酸构建体)转化植物细胞、源自转基因插入到植物基因组的植物群体的再生、以及选择表征为在特定基因组位置具有插入序列的特定植物。术语“事件”指包含异源DNA的最初转化体和转化体的后代。术语“事件”也指通过转化体和包含基因组/转基因DNA的另一变种间的有性异型杂交产生的后代。即使在对回归亲本进行重复回交之后，插入的转基因DNA和来自所转化亲本的侧翼基因组DNA(基因组/转基因DNA)在杂交后代中也存在于相同的染色体位置。术语“事件”也指来自最初转化体及其后代的DNA，该DNA包含插入的DNA和紧邻插入DNA的侧翼基因组序列，由于包含所插入DNA的亲本株系(例如最初转化体和自交后代)和不含所插入DNA的亲本株系间的有性杂交，可以预期该DNA会转移到接受包括目的转基因在内的插入DNA的后代中。

“连接序列”跨越了插入到基因组的DNA与插入点侧翼的棉花自身基因组DNA相连的接点，在植物遗传物质中鉴定出或检测出不管哪一条连接序列则足以判断发生该事件。所包括的是跨越本文所述棉花事件中的插入序列和相似长度侧翼DNA的DNA序列。本文提供了此类鉴别性序列的具体实例；但是，跨越插入序列间连接序列或跨越插入序列和基因组序列间连接序列的其它序列也是鉴别性的，并且可以根据本发明使用。

本发明涉及此类侧翼序列、连接序列和插入序列的鉴定。本发明包括相关的PCR引物和扩增子。根据本发明，使用跨越插入DNA及其(Cry1F281-24-236和/或Cry1Ac 3006-210-23的)边界的扩增子的PCR分析方法可用来检测和鉴定从本专利转基因棉花株系衍生的商品化转基因棉花变种或株系。

这些插入序列中的每一片段的全长序列以及各自的侧翼序列在本文中以SEQ ID NO：1(Cry1F 281-24-236)和SEQ ID NO：2(Cry1Ac 3006-210-23)提供。表1提供了这些事件中插入序列和侧翼序列的坐标。

                                  表1

图1和2进一步阐述了这些插入事件及其更多组分。这些序列(尤其是侧翼序列)是独特的。基于这些插入序列和边界序列，产生事件特异性引物。PCR分析表明，通过对用这些事件特异性引物对产生的PCR扩增子进行分析可以鉴定这些棉花株系的不同棉花基因型。因此，这些方法以及其它相关方法可以用来独特地鉴定这些棉花株系。本文鉴定的序列是独特的。例如，对GENBANK数据库进行BLAST检索显示，所克隆的边界序列与数据库中的序列没有任何显著同源性。

本发明的检测技术与植物育种相联合可特别用确定：在包含目的事件的亲本植物与赋予后代一种或多种额外的目的性状的另一植物株系杂交之后，哪些后代植物包含特定事件。这些PCR分析方法利于棉花育种程序和质量控制，特别是对于商品化的转基因棉籽。现在也可以生产和使用用于这些转基因棉花株系的PCR检测试剂盒。这也利于产品注册和产品管理。

此外，侧翼的棉花序列可以用来特异地鉴定每个插入序列的基因组位置。该信息可以用来制备对每个事件特异的分子标记系统。这些可以用于加速育种策略和建立连锁资料。

此外，侧翼序列信息还可以用于研究和描述转基因整合过程、基因组整合位点特征、事件分类、转基因及其侧翼序列的稳定性和基因表达(尤其是涉及基因沉默、转基因甲基化模式、位置效应和潜在的表达相关性元件例如MARS[基质附着区]等)的特征。

根据全部的本发明公开，显而易见本发明包括ATCC保藏号PTA-6233的种子。本发明也包括从ATCC保藏(保藏号PTA-6233)的种子生长出的抗虫性棉花植物。本发明还包括所述植物的部分，例如叶、组织样品、由所述植物产生的种子、花粉等。

此外，本发明还包括从所保藏种子生长出的植物、优选抗虫性棉花植物的子代和/或后代植物，其中所述植物基因组包含如本文所述的可检测的野生型基因组DNA/插入DNA连接序列。如本文所用，术语“棉花”指陆地棉(Gossypium hirsutum)并且包括所有能用棉花繁殖的植物变种，其中包括海岛棉(Gossypium barbadense)。

本发明进一步包括使用本发明的植物作为至少一个亲本进行杂交的方法。例如，本发明包括具有本文例举的任意植物作为一个或两个亲本的F1杂种植物。由本发明的此类F1杂种产生的种子也处于本发明范围内。本发明包括通过将例证的植物与不同(例如近交亲本)植物杂交、随后收获杂交种子而产生F1杂种种子的方法。本发明包括所例证的或为母本或为父本的植物。可以通过仔细考察亲本植物来改良所得植物的性状。

抗虫性棉花植物可以如下繁殖，即先将由本文所提到的任意一个株系的种子生长出的棉花植物组成的第一个亲本棉花植物与第二个亲本棉花植物进行有性杂交，由此产生许多第一代后代植物；然后选择抗虫的第一代后代植物(或者具有至少一种本发明事件的后代植物)；接着使第一代后代植物自交，由此产生许多第二代后代植物；然后从第二代后代植物中选择抗虫性植物(或者具有至少一种本发明事件的植物)。这些步骤可以进一步包括第一代后代植物或第二代后代植物与第二个亲本棉花植物或第三个亲本棉花植物进行回交。此后，就可以种植包含本发明棉花种子的棉花农作物或其后代。

还应该理解，两种不同的转基因植物也可以杂交以产生包含两种独立地分离的所加入外来基因的后代。将适当后代自交可以产生对所加入的两个外来基因而言均为纯合的植物。因为是营养体繁殖，所以也可以考虑对亲本植物进行回交以及与非转基因植物进行异型杂交。本领域已知其它常用于不同性状和农作物的育种方法。回交育种已经用于将简单遗传的、高度可遗传性状的基因转移进入目的纯合栽培种或近交系(其为回归亲本)。待转移性状的来源称为供体亲体。预期所得到的植物具有回归亲本(例如栽培种)的特征和从供体亲体转移的期望性状。初次杂交后，选择具有供体亲体表型的个体并与回归亲本重复杂交(回交)。预期所得亲本具有回归亲本(例如栽培种)的特征和从供体亲本转移的期望性状。

本发明的DNA分子可以用作标记辅助性育种(MAB)方法中的分子标记。本发明的DNA分子可以用于本领域已知的鉴定遗传上连锁的农学上经济、有用性状的方法(例如AFLP标记、RFLP标记、RAPD标记、SNPs和SSRs)。可以使用MAB法，在与本发明棉花植物(或其后代和任意其它棉花栽培种或变种)杂交的后代中追踪抗虫性状。DNA分子是该性状的标记，而本领域熟知的MAB法可以用来在至少一种本发明的棉花株系或其后代为亲本或祖先的棉花植物中追踪抗虫性状。本发明的方法可以用来鉴定具有来自棉花株系281-24-236(cry1F)和/或3006-210-23(cry1Ac)的抗虫事件的任何棉花变种。

本发明的方法包括生产抗虫性棉花植物的方法，其中所述方法包括用本发明的植物进行育种。更加具体而言，所述方法可以包括将本发明的两种植物、或者本发明的一种植物和任意一种其它植物杂交。优选的方法还包括通过分析根据本发明可检测事件的所述后代来选择所述杂交的后代。

本发明优选的植物或种子在其基因组中包含至少一种如表I所标识的插入序列，以及如表I所标识的在插入序列两边的至少20-500个或更多临近侧翼核苷酸。除非另外说明，“cry1F棉花事件281-24-236”指SEQ IDNO：1，其包括插入到最初转化体中的异源DNA(SEQ ID NO：1的核苷酸2075-12,748)和紧邻插入DNA的全部或部分两侧侧翼基因组序列(SEQ IDNO：1的核苷酸残基1-2074和12,749-15,490)，可以预计插入DNA可因包括该事件的亲本株系的有性杂交而传递到接受该插入DNA的后代中。类似地，除非另外说明，“cry1Ac棉花事件3006-210-23”指SEQ ID NO：2，其包括插入到最初转化体中的异源DNA(SEQ ID NO：2的核苷酸528-8900)和紧邻插入DNA的全部或部分两侧侧翼基因组序列(SEQ ID NO：2的核苷酸残基1-527和8901-9382)，可以预计插入DNA可因包括该事件的亲本株系的有性杂交而传递到接受该插入DNA的后代中。

本发明包括本发明植物的可再生细胞的组织培养物。也包括从该组织培养物再生出的植物，特异是当所述植物能够表达所例证变种所有的形态学和生理学特性时。本发明的优选植物具有从所保藏种子生长出的植物的所有生理学或形态学特征。本发明还包含此类种子的后代和具有目的品质性状的种子。

对植物或种子或其部分的操作(例如突变、进一步转染以及进一步育种)可以产生称为“基本衍生的”变种。植物新品种保护国际联盟(theInternational Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV)已经提供了下列测定变种是否从受保护变种基本衍生的指导方针。

当存在如下情况时，则认为变种基本衍生自另一变种(“最初变种”)：

(i)它主要从最初变种衍生或从其自身主要从最初变种衍生的变种衍生，并且保留了源自最初变种基因型或基因型组合的基本特征的表达；

(ii)它可以清楚地与最初变种区别；以及

(iii)除了由于衍生行为引起的差别以外，其在源自最初变种的基因型或基因型组合的基本特性表达上与最初变种一致。

UPOV国际组织第六次会议，Geneva，1992年10月30日；文件由联盟办公室制备。

如本文所用，“株系”为一组在至少一个性状上个体之间显示很少或没有遗传变异的植物。此类株系可以通过几个世代的自花传粉和选择、或者使用组织或细胞培养技术从单一亲本进行营养繁殖来产生。

如本文所用，术语“栽培种”和“变种”同义，并且指用于商业生产的株系。

“稳定性”或“稳定的”意指对于特定组分而言，该组分在世代之间、并且优选地在至少三个世代间以基本相同的水平维持，例如优选±15％、更优选±10％、最优选±5％。稳定性可能受到温度、位置、压力和种植时间的影响。在田间条件下对连续世代的比较应当以相似方式产生组分。

“商业可用性”定义为具有良好的植物活力和高繁殖力，以便农作物能够由农民使用常规耕作设备进行生产，并且具有所述组分的油能够用常规破碎和提取设备从种子中提取。为了在商业上有用，按每英亩生产的种子重量、油含量和总油量测定的产量在相同区域生长的没有优质价值性状的其它可比较的商业化芸苔变种平均产量的15％之内。

“农学原种”意指具有期望的农学特征例如产量、成熟度、抗病性等以及本发明事件的抗虫性的株系。

本领域技术人员将认识到，根据本公开，检测试剂盒优选的实施方案可以包括定位于和/或包含“连接序列”或“过渡序列”(在此处棉花侧翼基因组序列与插入序列接触)的探针和/或引物。例如，这包括包含如表1所示的SEQ ID NO：1的残基2074-2075或12,748-12,749或者SEQ ID NO：2的残基527-528或8,900-8,901的序列的多核苷酸探针、引物或扩增子。为了鉴别这些特定事件，优选的“接头引物”应当包括至少～15个相邻侧翼序列的残基和至少～15个相邻插入序列的残基。通过这种排列，在侧翼或插入区域中的另一个引物可以用来产生表明本发明事件存在的可检测扩增子。然而，在优选的实施方案中，一条引物结合在侧翼区域，一条引物结合在插入区域，而且这些引物能够用来产生跨越(及包括)如上所述连接序列的扩增子。

本领域技术人员也将认识到，引物和探针可以设计用来在标准的杂交和/或PCR条件范围下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及其互补序列的片段杂交，其中引物或探针与所例证的序列不完全互补。即可以耐受一定程度的错配。例如，对于大约20个核苷酸的引物，如果错配碱基在与扩增子相反的引物的中间或末端，那么一般一个或两个核苷酸不需要与相反链结合。下文提供了多种合适的杂交条件。合成的核苷酸类似物例如肌苷也可以在探针中使用。除了DNA和RNA探针外，也可以使用核酸肽(PNA)探针。重要的是该探针和引物对于本发明事件的存在是鉴别性的(能够独特地鉴定和区分)。

还需要注意的是PCR扩增中可能发生错误，从而可能导致例如少量的测序错误。即除非另外说明，本文列出的序列如下测定，先从棉花基因组DNA产生长扩增子，然后将该扩增子克隆和测序。如果必需多个扩增循环来从基因组DNA产生足够测序的扩增子，那么在用这种方式产生和测定的序列中发现细微差别和少量不一致是常见的。例如，标出了在所测定事件-侧翼DNA序列和相应的已知/野生型/基因组DNA之间的下列差别。在本发明cry1F事件的5’侧翼，SEQ ID NO：1的2037位残基测定为/例为“G”，而已知的基因组序列的281-24-236基因座相应的残基为“A”(根据标准的IUPAC-IUB国际公约，R可以在共有序列中使用)。在这个事件的3’侧翼，SEQ ID NO：1的12,781位残基在本文中列为T，而在公开的基因组序列中的相应位置提供的是C(Y为共有代码)。SEQ ID NO：1的12,811位点为C，而基因组提供的是T(Y为一致代码)。SEQ ID NO：1的12,866位点为C，而基因组中出现的是T(Y为一致代码)。SEQ ID NO：1的12,882位点为G，而基因组出现的是A(R为一致代码)。SEQ ID NO：1的12,918位点为A，而基因组中出现的是G(R为一致代码)。SEQ ID NO：1的13,129位点为G，而基因组中出现的是A(R为一致代码)。SEQ ID NO：1的13,222位点为C，而基因组中出现的是T(Y为一致代码)。在SEQ ID NO：1的13,441位点为T，而基因组列表中没有相应残基。因此，与基因组序列相比，这个明显的插入将使SEQ ID NO：1下游相应编号移位。本领域技术人员应当认识并注意到，任何由于这种类型的常见测序错误或不一致而需要的调整都在本发明范围之内。

类似的差别也在本发明cry1Ac事件的5’侧翼出现。在SEQ ID NO：2的149、153、159、165和244位点，分别列出下列残基：C、G、C、C和C。在基因座3006-210-23的基因组序列中分别在相应位置出现下列残基：A、A、A、A和A。这些替代的一致代码分别是M、R、M、M和M。可以相应地对探针和引物进行调整，而且在跨越或包括任意上述残基的扩增子中可以注意到相应差别。

还应当注意的是，当在事件产生期间插入序列时一些基因组序列被删除，这是不常见的。这是本发明两个事件的情况。即，SEQ ID NO：1提供了对于事件281-24-236在插入期间被删除的棉花基因组DNA的53碱基片段。这个“内部片段”出现在非转化棉花基因组中SEQ ID NO：1的残基2074和残基12,749之间。类似地，SEQ ID NO：2提供了对于事件3006-210-23在插入期间被删除的棉花基因组DNA的16碱基片段。这个“内部片段”出现在非转化棉花基因组中SEQ ID NO：2的残基527和残基8,901之间。

如图1和2所示，每个“插入片段”的组分如下。本发明事件Cry1F281-24-236中包含的转基因遗传元件DNA分子由与产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT)(其与ORF25多腺苷酸化序列(Baker等人，Plant Molecular Biology 2：335-350，1983)有效连接)有效连接的玉米泛素1启动子、包含部分删除的并带有四个章鱼碱合成酶启动子的增强子元件的甘露碱合成酶启动子的、与苏云金芽孢杆菌鲇泽变种(Bacillus thuringiensisvar var.aizawai)的Cry1F(synpro)(其与ORF25多腺苷酸化序列(Baker等人，Plant Molecular Biology2：335-350，1983)有效连接)有效连接的嵌合体启动子[(4OCS)δMAS]和与部分pat序列非有效连接的玉米泛素1启动子组成。这些组分的DNA多核苷酸序列或片段可以用作本发明方法中的DNA引物或探针。

事件Cry1Ac 3006-210-23包含的转基因遗传元件DNA分子由与PAT(如上所述)(其与ORP25有效连接)有效连接的(4OCS)δMAS启动子和与苏云金芽孢杆菌库斯塔变种(Bacillus thuringiensisvar var.kurstaki)的Cry1Ac(synpro)(其与ORP25多腺苷酸化序列有效连接)有效连接的玉米泛素1启动子组成。这些组分的DNA多核苷酸序列或其片段可以用作本发明方法中的DNA引物或探针。

在本发明的一些实施方案中，提供了在植物和种子等中鉴定来自命名为WIDESTRIKE(包含Cry1F事件281-24-236和Cry1Ac事件3006-210-23)的棉花植物的转基因/基因组插入区域存在的组合物和方法。所提供的DNA序列包含在本文SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、其片段以及所例证序列及其任意片段的互补序列中提供的至少一种转基因/基因组插入区域连接序列。插入区域连接序列跨越插入基因组中的异源DNA和棉花细胞中插入位点侧翼的DNA之间的连接。该序列对一种或多种特定事件是鉴别性的。

基于这些插入片段和边界序列，产生事件特异性引物。PCR分析表明，可以通过对用这些事件特异性引物对产生的PCR扩增子进行分析来鉴定这些棉花株系(Cry1F 281-24-236和Cry1Ac 3006-210-23)的不同棉花基因型。这些方法以及其它相关方法可以用来独特地鉴定这些棉花株系。因此，从此类引物对衍生的PCR扩增子是独特的，并且能够用来鉴定这些棉花株系。

在一些实施方案中，包含至少一种新的转基因/基因组插入区域的DNA序列为这个发明的一个方面。所包括的是包含足够长度的转基因插入序列多核苷酸和足够长度的来自一种或多种上述三种棉花植物的棉花基因组序列多核苷酸的DNA序列，和/或用作产生扩增子产物(其对这些棉花植物中的一种或多种具有鉴别性)的引物序列的序列。

相关的实施方案涉及如下DNA序列，其包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或其互补序列的转基因部分DNA序列中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多连续核苷酸以及来自这些序列或其互补序列的相似长度的棉花侧翼DNA序列。该序列可用作DNA扩增方法中的DNA引物。用这些引物产生的扩增子对于本文提到的任何棉花事件都是鉴别性的。因此，本发明也包括通过此类DNA引物和同源引物产生的扩增子。

下表2总结了本发明的特定实施方案。

                       表2.在事件特异性PCR扩增中使用的引物及其序列列表

本发明也包括在对应至少一种本文提到的棉花事件的样品中检测DNA存在的方法。此方法包括：(a)当引物对用来从至少一种这些棉花事件的DNA进行核酸扩增反应时，将引物对与包含DNA的样品接触，从而产生对所述事件为鉴别性的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，从而产生扩增子；以及(c)检测扩增子。

本发明更多的检测方法包括在对应至少一种所述事件的样品中检测DNA存在的方法，其中所述方法包括：(a)将包含DNA的样品与在严格杂交条件下与来自至少一种所述棉花事件的DNA杂交但在严格杂交条件下不与对照棉花植物(非目的事件DNA)杂交的探针接触；(b)将样品和探针置于严格的杂交条件下；以及(c)检测探针和DNA的杂交。

在更多的实施方案中，本发明还包括产生包含本发明cry1F和/或cry1Ac事件的棉花植物的方法，其中所述方法包括下列步骤：(a)将第一个亲本棉花株系(包含本发明的表达盒，其赋予所述株系植物所述抗虫性状)和第二个亲本棉花株系(缺少该抗虫性状)有性杂交，从而产生许多子代植物；以及(b)通过使用分子标志筛选子代植物。此方法可以任选地包括另一个步骤：将子代植物和第二个亲本棉花株系回交以产生包含所述抗虫性状的纯种棉花植物。

根据本发明的另一方面，提供了确定与所述三种事件中任意一种(或多种)事件植物杂交的后代的接合性的方法。所述方法可以包括将包含棉花DNA的样品与本发明的引物对接触。当所述引物用来与至少一种所述棉花事件的基因组DNA进行核酸扩增反应时，其产生对至少一种所述棉花事件为鉴别性的第一个扩增子。该方法还包括进行核酸扩增反应，从而产生第一个扩增子；检测第一个扩增子；将包含棉花DNA的样品与所述引物对(当所述引物对用来自与棉花植物基因组DNA进行核酸扩增反应时，其产生第二个扩增子，其中该第二个扩增子包含与所述棉花事件之一所标识转基因插入序列的棉花基因组区域同源的天然棉花基因组DNA)接触；以及进行核酸扩增反应，从而产生第二个扩增子。该方法还包括检测第二个扩增子，以及比较样品中的第一个和第二个扩增子，其中两个扩增子都存在则表明样品对于转基因插入是杂合的。

可以使用本文公开的组合物和DNA检测领域众所周知的方法研发DNA检测试剂盒。试剂盒用于鉴定样品中本发明棉花事件DNA，并且可以应用于培育包含该DNA的棉花植物的方法。试剂盒包含与例如本文所公开扩增子同源或互补的DNA序列或者与本发明事件转基因遗传元件所包含的DNA同源或互补的DNA序列。这些DNA序列可以用于DNA扩增反应或者用作DNA杂交方法中的探针。试剂盒还包含开展检测方法所必需的试剂和材料。

“探针”是带有常规可检测标签或报告分子(例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶)的分离的核酸分子。该探针与靶核酸链互补，在本发明中探针与来自所述棉花事件之一的基因组DNA的一条链(不管是来自棉花植物还是来自包括源自事件的DNA的样品)互补。根据本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异结合靶DNA序列并且能够用来检测靶DNA序列存在的聚酰胺和其它探针材料。

“引物”为通过核酸杂交与互补靶DNA链退火以便在引物和靶DNA链之间形成杂交体，然后通过聚合酶如DNA聚合酶沿着靶DNA链被延伸的分离的核酸。本发明的引物对涉及其通过例如聚合酶链式反应(PCR)或其它常规核酸扩增方法扩增靶核酸序列的用途。

探针和引物的长度通常为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500个多核苷酸或更多。此类探针和引物在高严格杂交条件下与靶序列特异性杂交。尽管可以通过常规方法设计不同于靶序列但保持与靶序列杂交能力的探针，但优选地，根据本发明的探针和引物具有类似于靶序列的完整序列。

制备和使用探针和引物的方法描述于例如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，第1-3卷，Sambrook等人编辑，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989。PCR引物对可以通过例如使用旨在用于该目的的计算机程序从已知序列衍生。

基于本文所公开侧翼DNA和插入序列的引物和探针可以用来通过常规方法(如通过对该序列进行再克隆和测序)证实(和纠正(如果需要))所公开序列。

本发明的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用来鉴定样品中源自转基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段能够在某些情况下特异地与其它核酸分子杂交。如本文所用，如果两个分子能够形成反向平行的双链核酸结构，则它们就被表述为能够彼此特异性杂交。如果核酸分子和另一核酸分子呈现完全的互补性，则该核酸分子就被表述为是另一核酸分子“互补序列”。如本文所用，当两个分子至一的每个核苷酸均与另一分子的核苷酸互补时，则两个分子被表述为呈现“完全互补性”。如果两个分子能够以足够的稳定性彼此杂交从而允许它们至少在常规的“低严格性”条件下保持彼此退火，则两个分子被表述为是“最低程度互补的”。类似地，如果分子能以足够的稳定性彼此杂交从而允许它们在常规的“高严格性”条件下保持彼此退火，则它们就被表述为是“互补的”。常规的严格条件描述于Sambrook等人，1989。因此，偏离完全互补性是允许的，只要这种偏离不影响分子形成双链结构的能力即可。为了使核酸分子用作引物或探针，仅需要其在序列上具有足够的互补性以便能够在所采用的特定溶剂和盐条件下形成稳定的双链结构。

如本文所用，基本同源的序列为在高严格性条件下与所比较核酸序列的互补序列特异性杂交的核酸序列。关于核酸探针与靶核酸杂交(即与特定的目的核酸序列杂交)的术语“严格条件”由在Sambrook等人，1989，9.52-9.55中所述特定杂交方法进行功能性定义。还参见Sambrook等人，1989，9.47-9.52。因此，可以利用本发明核苷酸序列的、能与DNA片段的互补序列形成双链体分子的能力。

取决于预期应用，可以使用不同的杂交条件来实现探针对靶序列的不同程度的选择性。对于需要高选择性的应用，一般采用相对严格的条件来形成杂交体，例如选择相对低的盐和/或高的温度条件，如由大约50℃至大约70℃温度下大约0.02M至大约0.15M NaCl所提供的条件。严格条件例如可以包括用高严格性洗涤缓冲液(0.2×SSC，0.1％SDS，65℃)洗涤杂交滤器至少两次。本领域技术人员已知促进DNA杂交的近似严格条件，例如大约45℃、6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，然后用在50℃用2.0×SSC洗涤，6.3.1-6.3.6。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以从50℃、大约2.0×SSC的低严格性至50℃、大约0.2×SSC的高严格性中选择。此外，洗涤步骤的温度可以从低严格条件的室温大约22℃升高至高严格条件的大约65℃。温度和盐都可以改变，或者温度或盐浓度保持恒定而改变另外的变量。此类选择性条件耐受探针和模板或靶链之间少量的(如果存在的话)错配。通过杂交作用检测DNA序列为本领域技术人员所熟知，并且美国专利号4,965,188和5,176,995的教导为杂交分析方法的范例。

在特别优选的实施方案中，本发明的核酸在高严格性条件下与一种或多种本文所例证或建议的引物(或扩增子或其它序列)，包括互补序列或片段特异性杂交。在本发明的另一方面，本发明的标记核酸分子具有SEQ IDNO：3-14中所述核酸序列或其互补序列和/或片段。

在本发明的另一方面，本发明的标记核酸分子与该核酸序列具有80％-100％或90％-100％的序列同一性。在本发明的另一方面，本发明的标记核酸分子与该序列具有95％-100％的序列同一性。该序列可以用作植物育种方法中的标记以鉴定遗传杂交的后代。探针与靶DNA分子的杂交可以通过本领域技术人员已知的任意方法检测，这些方法可以包括但不局限于荧光标签、放射性标签、基于抗体的标签和化学发光标签。

对于使用特定的扩增引物对对靶核酸序列扩增(例如通过PCR)，“严格条件”为允许引物对只与靶核酸序列杂交的条件，其中具有相应野生型序列(或其互补序列)的引物将优选结合以产生独特的扩增产物-扩增子。

术语“(靶序列)特异性的”表示探针或引物在严格杂交条件下只与包含靶序列的样品中的靶序列杂交。

如本文所用，“扩增的DNA”或“扩增子”指靶核酸序列(为部分核酸模板)的核酸扩增产物。例如，为了测定源自有性杂交的棉花植物是否包含来自本发明棉花植物的转基因事件的基因组DNA，可以从棉花植物组织样品中提取DNA进行核酸扩增方法，以便产生鉴别事件DNA存在的扩增子，其中使用的引物对包括从植物基因组中邻近所插入异源DNA的插入位点的侧翼序列衍生的引物和从所插入异源DNA衍生的第二个引物。该扩增子的长度和序列对于事件而言也是鉴别性的。扩增子长度可以在引物对长度加上一个核苷酸碱基对的组合长度和/或引物对加上大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500、750、1000、1250、1500、1750、2000或更多核苷酸碱基对的组合长度内变化(加上或减去上文列出的任意增量)。备选地，引物对可以衍生自所插入的DNA两侧的侧翼序列以便产生包括整个插入片段核苷酸序列的扩增子。许多衍生自植物基因组序列的引物对可以距所插入DNA序列一段距离。该距离可以在从一个核苷酸碱基对至大约两万个核苷酸碱基对内变化。特别地，所使用的术语“扩增子”不包括在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。

核酸扩增可以通过本领域已知的多种核酸扩增方法(包括聚合酶链式反应(PCR))来实现。多种扩增方法是本领域已知的并且尤其描述于美国专利号4,683,195和4,683,202中。已经开发出能扩增高达22kb基因组DNA的PCR扩增方法。这些方法以及DNA扩增领域已知的其它方法可以用于本发明的实践。来自本发明棉花事件的异源转基因DNA插入序列或侧翼基因组序列可以如下证实(和纠正(如果需要))，即通过使用从本文所提供序列衍生的引物扩增从事件中扩增此类序列，随后对PCR扩增子或所克隆DNA进行标准的DNA测序。

通过这些方法产生的扩增子可以通过许多技术检测。琼脂糖凝胶电泳和用溴化乙锭染色是检测DNA扩增子的众所周知的常用方法。另一种此类方法是Genetic Bit Analysis，其中DNA寡核苷酸设计为与邻近侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列均重叠。将寡核苷酸固定在微孔板的孔中。在对目的区域进行PCR(使用位于插入序列中的一个引物和位于邻近侧翼基因组序列中的另一个引物)之后，单链PCR产物可以与固定的寡核苷酸杂交，并可以作为模板用于使用DNA聚合酶和所预期的下一个碱基特异性的标记ddNTP进行单碱基延伸反应。所读出信号可以是荧光信号或基于ELISA的信号。由于成功扩增、杂交和单碱基延伸，所以信号的存在表明插入/侧翼序列的存在。

另一方法是Winge(Innov.Pharma.Tech.00：18-24，2000)描述的焦磷酸测序技术。在这个方法中，寡核苷酸设计为与邻近基因组DNA和插入DNA连接处重叠。寡核苷酸与来自目的区域的单链PCR产物(使用位于插入序列中的一个引物和位于侧翼基因组序列中的一个引物)杂交，并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷5’磷酸硫酸和荧光素存在下孵育。单独加入DNTP，掺入后产生待检测的光信号。由于成功扩增、杂交和单或多碱基延伸，所以光信号的存在表明转基因插入/侧翼序列的存在。

荧光偏振是另外一种可以用来检测本发明扩增子的方法。按照该方法，寡核苷酸被设计为与基因组侧翼和插入DNA连接处重叠。寡核苷酸与来自目的区域的单链PCR产物(使用位于插入序列中的一个引物和位于侧翼基因组序列中的一个引物)杂交，并在DNA聚合酶和荧光标记ddNTP存在下孵育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。掺入可以用荧光计测定为偏振的改变。由于成功扩增、杂交和单碱基延伸，所以偏振的改变表明转基因插入/侧翼序列的存在。

TAQMAN(PE Applied Biosystems，Foster City，Calif.)是检测和定量DNA序列存在的一种方法。简言之，FRET寡核苷酸探针被设计成与基因组侧翼和插入DAN连接处重叠。使用FRET探针和PCR引物(一个引物位于插入DNA序列中，一个位于侧翼基因组序列中)在热稳定聚合酶和dNTP存在下进行循环。FRET探针的杂交导致荧光部分断裂和释放而离开FRET探针上的淬灭部分。由于成功扩增和杂交，所以荧光信号的存在表明侧翼/转基因插入序列的存在。

已经描述了分子灯塔(Molecular Beacons)在序列检测中的应用。简言之，FRET寡核苷酸探针被设计成与侧翼基因组DNA和插入DAN连接处重叠。FRET探针的独特结构使其包含保持荧光和淬灭部分紧密靠近的二级结构。使用FRET探针和PCR引物(一个引物位于插入DNA序列中，一个位于侧翼基因组序列中)在热稳定聚合酶和dNTP存在下进行循环。随着成功PCR扩增，FRET探针与靶序列的杂交导致探针二级结构的去除，并导致荧光部分和淬灭部分在空间上分离。从而产生荧光信号。由于成功扩增和杂交，所以荧光信号的存在表明侧翼基因组序列/转基因插入序列的存在。

已经公开了棉花基因组中对插入而言优良的两个大体位置，本发明还包括在这一个或两个位置附近包含至少一种非cry1F和非cry1Ac插入序列的棉花种子和/或棉花植物。一种选择是用不同的插入序列替代本文例证的cry1F和/或cry1Ac插入序列。出于这种一般考虑，例如根据本发明可以使用靶向同源重组。该类型技术为例如WO03/080809A2和相应公布的美国申请(USPA 20030232410)的主题。

本文提及或引用的全部专利、专利申请、临时申请和公布在此处整体引入作为参考，直到它们与本说明书清楚的教导不一致的程度。

下列实施例用来说明实践本发明的方法和阐述本发明的某些优选实施方案。这些实例不应解释为限制性的。本领域技术人员应当意识到，下列实施例中公开的技术代表用来阐述其优选实施方式的特殊方法。但是，根据本公开，本领域技术人员应当意识到，可以对这些具体实施方案在不脱离本发明的主旨和范围下进行任何改动而仍然能得到相似或类似结果。除非另外说明，所有的百分比都是重量百分比；除非另外注明，所有溶剂混合物比例都是体积比。

实施例1-保藏种子的产生

棉花的WideStrike^TM类型抗虫性是Dow AgroSciences研发转基因性状，其提供针对鳞翅目昆虫植物内抗性。其包含两个分别衍生自苏云金芽胞杆菌库斯塔亚种和苏云金芽胞杆菌鲇泽亚种的昆虫耐受基因，cry1Ac和cry1F。苏云金芽胞杆菌(B.t.)为常见的革兰氏阳性土壤细菌。在其孢子形成阶段，其产生几种杀虫蛋白质晶体(已知为δ-内毒素)，其中包括Cry1Ac和Cry1F。这些蛋白质对于某些鳞翅目昆虫是有毒的。在敏感性昆虫中，它们与存在于中肠上皮细胞的特异受体结合，形成破环渗透平衡的孔洞，并最终导致细胞溶解和死亡。已经表明，Cry1Ac和Cry1F对没有δ-内毒素结合位点的人、家畜和有益昆虫是无毒的。由于两种Cry蛋白质比单独一种提供更广谱的控制范围，以及对它们所有效对抗的鳞翅目害虫具有不同活性，所以使用两种δ-内毒素而非一种δ-内毒素将提供改进的抗虫性。更加重要地，其可以延缓抗性昆虫的抗性产生。

WideStrike中的cry1Ac和cry1F基因通过农杆菌介导的转化在两个单独的转化事件3006-210-23和281-24-236中引入GC-510棉花(陆地棉)植物。杂交后进入原种棉花变种，这些事件可通过常规育种来组合以产生具WideStrike抗虫性状的棉花。WideStrike还包含来自常见需氧土壤细菌绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的pat基因。pat基因编码膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)，该酶通过乙酰化作用使草铵膦解毒成为无效化合物。之所以包含pat基因是为了对已转化的棉花植物进行筛选。

实施例2-Cry1F棉花事件281-24-236的鉴别性检测

使用QIAGEN的Plant DNeasy试剂盒(目录号69181，Qiagen，Valencia，CA，USA)从棉花叶子中提取Cry1F事件281-24-236和Cry1Ac事件3006-210-23以及非转基因棉花PCS355的DNA。按照制造商建议的方法进行。简言之，使用碳化钨珠(直径0.125mm)和Retsch MM3000 Mixer Mill在补加RNA酶的预热缓冲液中将叶片破碎。在室温下将混合物离心，随后通过流经DNeasy96孔板得到上清。用洗脱缓冲液洗脱DNA，并冻存直至使用。

从棉花叶子组织中提取的DNA用于Cry1F事件281-24-236中5’侧翼基因组序列/转基因插入序列和3’侧翼基因组序列/转基因插入序列DNAPCR扩增，在5’侧翼基因组序列/转基因插入序列的扩增中使用引物281-14(SEQ ID NO：3，5’TGTCGGCTGAAGGTAGGGAGG3′)和引物281-15(SEQ ID NO：4，5′CCGGACATGAAGCCATTTAC3′)，在3’侧翼基因组序列/转基因插入序列中使用引物281-9(SEQ ID NO：6，5’TCTCTAGAGAGGGGCACGACC3′)和引物281-10(SEQ ID NO：7，5′CGAGCTGGAGAGACCGGTGAC3’)。用从棉花事件Cry1F 281-24-236和非转基因棉花株系PCS355中提取的基因组DNA进行PCR DNA扩增分析。对于5’侧翼基因组序列的扩增反应用QIAGEN HotStarTaq PCR试剂盒(目录号203203或203205，QIAGEN，Valencia，CA，USA)进行，其中在50μl反应体积中引物281-14和引物281-15的终浓度为0.4μM。反应使用GenAmp PCR System 9600(Applied Biosystem，Foster City，CA)进行，循环条件如下：95℃15分钟，1个循环；94℃30秒、57℃30秒、72℃60秒，35个循环；72℃10分钟，1个循环。针对3’侧翼基因组序列的PCR使用Takara ExTaq PCR试剂盒(目录号RR001A，Panvera，Madison，WI)进行，其中在50μl反应体积中含有0.4μM终浓度的引物281-9和引物281-10。反应使用GenAmp PCR System 9600(Applied Biosystem，Foster City，CA)进行，循环条件如下：95℃5分钟，1个循环；94℃30秒、60℃30秒、72℃60秒，35个循环；72℃10分钟，1个循环。PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳(100V，大约1小时)分离，并通过溴化乙锭染色显色。

经测序，5’PCR产物的DNA序列为603个核苷酸碱基对，其代表着棉花Cry1F事件281-24-236的5’侧翼基因组序列/转基因插入序列并标识为SEQ ID NO：5。经测序，3’PCR产物的DNA序列为562个核苷酸碱基对，其代表着棉花Cry1F事件281-24-236的3’侧翼基因组/转基因插入序列并标识为SEQ ID NO：8。

基因组/转基因连接序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8为Cry1F事件281-24-236中的新的DNA序列，其可以鉴别棉花植物Cry1F事件281-24-236及其后代。

实施例3-Cry1Ac棉花事件3006-210-23的鉴别性检测

从棉花叶子组织中提取的DNA用于Cry1Ac事件3006-210-23中5’侧翼基因组序列/转基因插入序列和3’侧翼基因组序列/转基因插入序列DNAPCR扩增，在5’侧翼基因组序列/转基因插入序列的扩增中使用引物3006-20(SEQ ID NO：9，5’TTCCAACCTTTAACTATTATCCTGC3′)和引物3006-22(SEQ ID NO：10，5′GCTGCGGACATCTACATTTT3′)。在3’侧翼基因组序列/转基因插入序列中使用引物3006-9(SEQ ID NO：12，5′GACATGCAATGCTCATTATCTCTA3′)和引物3006-12(SEQ ID NO：13，5’AAGTCTCTGCCTTCTACCCTGG3′)。用从棉花事件Cry1Ac3006-210-23和非转基因棉花株系PCS355中提取的基因组DNA进行PCRDNA扩增分析。对于5’侧翼基因组序列的扩增反应用QIAGENHotStarTaq PCR试剂盒(目录号203203或203205，QIAGEN，Valencia，CA，USA)进行，其中在50μl反应体积中引物3006-20和引物3006-22的终浓度为0.4μM。反应使用GenAmp PCR System9600(Applied Biosystem，Foster City，CA)进行，循环条件如下：95℃15分钟，1个循环；94℃30秒、53℃30秒、72℃60秒，35个循环；72℃10分钟，1个循环。对于3’侧翼基因组序列的扩增反应用QIAGEN HotStarTaq PCR试剂盒(目录号203203或203205，QIAGEN，Valencia，CA，USA)进行，其中在50μl反应体积中含有0.4μM终浓度的引物3006-9和引物3006-12。反应使用GenAmp PCR System 9600(Applied Biosystem，Foster City，CA)进行，循环条件如下：95℃5分钟，1个循环；94℃30秒、56℃30秒、72℃60秒，30个循环；72℃10分钟，1个循环。PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳(100V，大约1小时)分离，并通过溴化乙锭染色显色。

经测序，5’PCR产物的DNA序列为614个核苷酸碱基对，  其代表着棉花Cry1Ac事件3006-210-23的5’侧翼基因组序列/转基因插入序列(在此标识为SEQ ID NO：11)。经测序，3’PCR产物的DNA序列为662个核苷酸碱基对，其代表着棉花Cry1Ac事件3006-210-23的3’侧翼基因组/转基因插入序列(在此标识为SEQ ID NO：14)。

基因组/转基因连接序列SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：14为Cry1Ac事件3006-210-23中的新的DNA序列，其可以鉴别棉花植物Cry1Ac事件3006-210-23及其后代。

实施例4-更多鉴别性检测

DNA事件引物对用来产生对于Cry1F事件281-24-23和Cry1Ac事件3006-210-23而言为鉴别性的扩增子。这些事件引物对包括但不局限于SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。当在DNA扩增方法(PCR)中使用时，这些引物产生对于Cry1F事件281-24-236和/或Cry1Ac事件3006-210-23及其后代而言为鉴别性的扩增子。除了这些引物对以外，本发明的更多方面包括从扩增子产物SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQID NO：11和/或SEQ ID NO：14衍生的任何引物对，其中所述引物对在DNA的扩增反应中会产生对于Cry1F事件281-24-236、Cry1Ac事件3006-210-23及其后代为鉴别性的扩增子。考虑到本公开的利益，涉及使用DNA引物以产生对于Cry1F事件281-24-236、Cry1Ac事件3006-210-23及其后代而言为鉴别性的扩增子的任何修改都属本领域普通技术。对来自Cry1F事件281-24-236、Cry1Ac事件3006-210-23及其后代的植物组织样品的分析应当包括来自这些事件的阳性组织对照、来自不是这些事件中任意事件的棉花植物的阴性对照、以及不包含模板棉花DNA的阴性对照。另外的引物序列可以由DNA扩增方法领域的技术人员从SEQ ID NO：1和/或SEQ IDNO：2中衍生。产生扩增子的优化条件可以与上述实施例中描述的方法不同。这些DNA引物序列在用于实施例中所述方法的修改方法中的用途属于本发明的范畴。衍生自SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2、对于Cry1F事件281-24-236和/或Cry1Ac事件3006-210-23及其后代为鉴别性的扩增子和引物为本发明的几个方面。对Cry1F事件281-24-236、Cry1Ac事件3006-210-23及其后代的扩增子的检测可以通过使用Stratagene Robocycler，MJ，Engine或Eppendorf Mastercycler梯度热循环仪或通过本领域技术人员已知的方法和装置进行。

已经阐明和描述了本发明的原理，对本领域技术人员显而易见，可以在安排和细节上对本发明进行修改而不脱离该原理。我们要求对在后附权利要求的精神和范围内的所有修改进行专利保护。

序列表

<110>美国陶氏益农公司(Dow AgroSciences LLC)

<120>Cry1F和Cry1Ac转基因棉花株系及其事件特异性鉴定

<130>DAS-117CXC1

<150>US 60/556,586

<151>2004-03-26

<150>US 60/613,851

<151>2004-09-27

<160>16

<170>PatentIn版本3.2

<210>1

<211>15490

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Cry1F事件281-24-236的插入片段及其边界序列

<400>  1

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gtctcagcgc cggctttaag ctcaatccca tcccaatctg aatatcctat cccgcgccca  5580

gtccggtgta agaacgggtc tgtccatcca cctctgttgg gaattctgat cttggcggta  5640

cccggggatc ctcattcctc catcagaagt aactccacgc tatcaacaat gaatgttcct  5700

tccgtttctc caatctcaat ccaaaccttg tcggtttctg gaaagtactc taactctttg  5760

gtgacatagc cggctggtaa cggtgtgtag tccccatagc ctctgttaga ttcgcaagga  5820

ttgtccctac gtccatcggt gtaagccttc tcctcatagg ctgatgcata gtcagcgggt  5880

acagaagagt tgctctcata ggctccatcg tatcctcgat tgcgagaagt gtaagtaccc  5940

tcatactcct cttgagtcgc agtgtagtca ttgcaagtta cggtgttgtt tgggtagact  6000

tcctcctcga cgcagttgct gaacttcagc tcgtcggtgt tgttctcaat ctcgtgtatg  6060

gtgacgcaac cttctccgta tccttctttg tacgcggtaa cacgaagaat gtagccacga  6120

ccaggacaga cacgaacttc ttgtgaaact tctgcttccc actcaggaac aacaaggaca  6180

gagcggtgat tgttctgttc ttctacatct acgtgccctt tcacattcca gcaggatagg  6240

ccattgttga agtcaccatt cttgatgaca ttcctcgcat catacaagga gaatgcagtg  6300

aagatgcgcc cttctaactc ttcaaagata gcagcattga cacccggaat cacgctaagt  6360

tcaggaaggt aagcttcccg aatgctatga acgcgtttgt ctgcagcatg aatcatagct  6420

atgttggtat cagcttggag cctatcatac tgagagttca caaacagagc gtcaacgctt  6480

tctttggctt ctttgtacac aatgtttgtt tcccattcca acttctctct cttgtccctc  6540

cacttcttct cagccctctt cactctagcg agggcttctc caacaagtgg tttctcttct  6600

agaaactcca gattgcctag cctggcatgg ccatcttgag tcttgatctt gaagatcacc  6660

cacacaccga ggtcttcgtt caggtcggta cagccaacgt ctatgtccaa ggagaagtgg  6720

tgtgagtgat gggcacactt gccgatggga cttggggctg aaagtggcca gagtgaaccc  6780

gtcccaggca cattgactgt ctcatgtttg gcgttgtatc tgatgaggta gatctcaagg  6840

tcttgactgt cctcgatgta acctctcaac tggtatcttg tgtaggcttt gagtttcgat  6900

tcatctatct tctggtacag gtatgttgga tagcactcat caaaggtacc caagagcgta  6960

acatagttct ccttgaacac atcatcacct ccttgaatgg tgatgtccgt acttcccctc  7020

catccacgat ctagttgcct gttgatcccg cgaaagttgg gatcttgaag caagttccgc  7080

tcatcactaa gtcgcttagc atgtttgacc ttctcggaca actccttctt ctcatccaaa  7140

cagaactcat cagagaggca ctcaacaagg ttggaaacgc gatcgatgtg atagtcagtc  7200

acatctgtct tgagcccaat ctgattggac gaagtgaaca gagcattcac cgccttctgt  7260

gctctttcca agtcagactc tgcctcgagt gtggcagtaa ctggaatcaa ctcaaacctg  7320

tcaatgtaca cttcgttgcc tgaactgaag gtatcagcac ctactgtgaa actgctctgg  7380

ctcattggaa aggtgaacgc ggtgttgata gtggcgtagg agaaagattg gaatgtaagt  7440

ggatcaccgg tatccattgt cttgttgaac tgaccagcaa agatccgttc acctgcaacc  7500

gtaacgtaga ttcttagatt ggtagtagag gcatagcgta tcctggcacg atacctttgg  7560

ggaagttgcc cattgatgtt gacaatggtg tacgcgaatg gtcctccact agtgcgtcga  7620

agaatgtctc ctcccgtgaa ccccggccct cttacaactg tagttcctga ctgaagtgtg  7680

tgtgccttca ccaagggaat ctgagtgatt ctctctggat caatggtgtt tgtgggggta  7740

gcgctacgat gcgtccaaga gaacattggt gctctccatg agtcggaacc tgagatctca  7800

cctggccagc gcacaaaggt aacatgattc agcacatggg agtagtcatt ccaaggtgcg  7860

ccgctgttgt cttgaggtgg tatctcatct agagagtcaa tggtcccgga gttcctgaat   7920

gtgcgggtgt gattcgtacc agtttgttga aaggccactc ccctaagacc gagtacatag   7980

tgaggattgc caaagcctcc tcggacgaag acaggatctg acaaggtccg atagaaagga   8040

cgtggatctt catctgcaat ccagatggcg cccccgggat tgaagacccc gtaactagga   8100

aagttgatac gattgccagc cgtgttgcgt gagctaacta agtgtcctcc ccacacagtt   8160

tgggatctaa cagtctctgc agtcacaaac aaagagttca tgaagtccat gagatggggt   8220

ggtctgactc caaactcagc cctgttgaaa ccattgggta tgttcgcaga aactggagag   8280

tcttcaatga ctgaactggt gtagatctcc cttgtaagtt gggatgacgt ttgaatcgga   8340

taggtacgaa catcgtagtt cggaaagaga gcaactatgt ctaacacagt aagtgtaagg   8400

tctctcctga actgattgaa cctggcccat tggcgagtgt tagtacctct caggttctcc   8460

aatccctgat tgtaggtatc caaacaatgt ttcgtgtatc gatgaatcag attgatgagt   8520

ctgttgtagt gattgttgac agtagctatg tccagtcccc aaccttgccc aaacgacaca   8580

gcgtcgcgca gtagtgacaa gtgcaggtta gcagcttgaa catagaccga gagaagaggg   8640

atctcgaagc tggtaagggt gaagttgttg atggctgtga tcaaagcatc atctgtgtta   8700

gcaaagcgta tacgcacatc ttctctcagt tgggcattgt taggattggc ttcccactct   8760

cttagtgctt caatgtagat ctcatagctg tctgctaagc cacgaagggt agtgatggcc   8820

cgattccttt ccaaggtctc aatcctttgt tcaatcaact gttcaatctg gagaagaaag   8880

aggctccaat cagatggagt gatgaagccc cagatgaggt cgaagaggcc aaacgcaact   8940

cccacacctg gaacaaactc agacaacagg agacgtgtaa gggacaggga gatgtctaac   9000

ggcaatctgc cagtcgacct ctcttcgttg agaatctcta cttcaggatt gttgaggcag   9060

ttgtagggga cgcactgatt ctgtatgttg ttctccattg ttggatccgc gatttggtgt   9120

atcgagattg gttatgaaat tcagatgcta gtgtaatgta ttggtaattt gggaagatat   9180

aataggaagc aaggctattt atccatttct gaaaaggcga aatggcgtca ccgcgagcgt   9240

cacgctctag tcgaccatgt acgtaagcgc ttacgttttt ggtggacccc ctcgaccatg   9300

tacgtaagcg cttacgtttt tggtggaccc cctcgaccat gtacgtaagc gcttacgttt   9360

ttggtggacc ccctcgacca tgtacgtaag cgcttacgtt tttggtggac cccctcgacg   9420

gatcccccct cgaccctaga cgtatctatt caaaagtcgt taatggctgc ggatcaagaa   9480

aaagttggaa tagaaacaga atacccgcga aattcaggcc cggttgccat gtcctacacg   9540

ccgaaataaa cgaccaaatt agtagaaaaa taaaaactga ctcggatact tacgtcacgt   9600

cttgcgcact gatttgaaaa atctcaatat aaacaaagac ggccacaaga aaaaaccaaa   9660

acaccgatat tcattaatct tatctagttt ctcaaaaaaa ttcatatctt ccacaccctc   9720

gagatctaga tatcgatgaa ttttggcgcg ccttaattaa ggaattcctc gagtttaaac   9780

ggatccctga aagcgacgtt ggatgttaac atctgcaaat tgccttttct tatcgaccat   9840

gtacgtaagc gcttacgttt ttggtggacc cttgaggaaa ctggtagctg ttgtgggcct   9900

gtggtctcaa gatggatcat taatttccac cttcacctac gatggggggc atcgcaccgg   9960

tgagtaatat tgtacggcta agagcgaatt tggcctgtag acctcaattg cgagctttct  10020

aatttcaaac tattcgagct ttctaattga atatatccag ggcccagcgt aagcaatacc  10080

agccacaaca ccctcaacct cagcaaccaa ccaagggtat ctatcttgca acctctctag  10140

atcatcaatc cactcttgtg gtgtttgtgg ctctgtccta aagttcactg tagacgtctc  10200

aatgtaatgg ttaacgatat cacaaaccgc ggccatatca gctgctgtag ctggcctaat  10260

ctcaactggt ctcctctccg gagacatgtc gacctgcaga agtaacacca aacaacaggg  10320

tgagcatcga caaaagaaac agtaccaagc aaataaatag cgtatgaagg cagggctaaa  10380

aaaatccaca tatagctgct gcatatgcca tcatccaagt atatcaagat caaaataatt  10440

ataaaacata cttgtttatt ataatagata ggtactcaag gttagagcat atgaatagat  10500

gctgcatatg ccatcatgta tatgcatcag taaaacccac atcaacatgt atacctatcc  10560

tagatcgata tttccatcca tcttaaactc gtaactatga agatgtatga cacacacata  10620

cagttccaaa attaataaat acaccaggta gtttgaaaca gtattctact ccgatctaga  10680

acgaatgaac gaccgcccaa ccacaccaca tcatcacaac caagcgaaca aaaagcatct  10740

ctgtatatgc atcagtaaaa cccgcatcaa catgtatacc tatcctagat cgatatttcc  10800

atccatcatc ttcaattcgt aactatgaat atgtatggca cacacataca gatccaaaat  10860

taataaatcc accaggtagt ttgaaacaga attctactcc gatctagaac gaccgcccaa  10920

ccagaccaca tcatcacaac caagacaaaa aaaagcatga aaagatgacc cgacaaacaa  10980

gtgcacggca tatattgaaa taaaggaaaa gggcaaacca aaccctatgc aacgaaacaa  11040

aaaaaatcat gaaatcgatc ccgtctgcgg aacggctaga gccatcccag gattccccaa  11100

agagaaacac tggcaagtta gcaatcagaa cgtgtctgac gtacaggtcg catccgtgta  11160

cgaacgctag cagcacggat ctaacacaaa cacggatcta acacaaacat gaacagaagt  11220

agaactaccg ggccctaacc atggaccgga acgccgatct agagaaggta gagagggggg  11280

gggggggggg aggacgagcg gctgtacctt gaagcggagg tgccgacggg tggatttggg  11340

ggagatctgg ttgtgtgtgt gtgcgctccg aacaacacga ggttggggaa agagggtgtg  11400

gagggggtgt ctatttatta cggcgggcga ggaagggaaa gcgaaggagc ggtgggaaag  11460

gaatcccccg tagctgccgg tgccgtgaga ggaggaggag gccgcctgcc gtgccggctc  11520

acgtctgccg ctccgccacg caatttctgg atgccgacag cggagcaagt ccaacggtgg  11580

agcggaactc tcgagagggg tccagaggca gcgacagaga tgccgtgccg tctgcttcgc  11640

ttggcccgac gcgacgctgc tggttcgctg gttggtgtcc gttagactcg tcgacggcgt  11700

ttaacaggct ggcattatct actcgaaaca agaaaaatgt ttccttagtt tttttaattt  11760

cttaaagggt atttgcttaa tttttagtca ctttatttta ttctatttta tatctaaatt  11820

attaaataaa aaaactaaaa tagagtttta gttttcttaa tttagaggct aaaatagaat  11880

aaaatagatg tactaaaaaa attagtctat aaaaaccatt aaccctaaac cctaaatgga  11940

tgtactaata aaatggatga agtattatat aggtgaagct atttgcaaaa aaaaaggaga  12000

acacatgcac actaaaaaga taaaactgta gagtcctgtt gtcaaaatac tcaattgtcc  12060

tttagaccat gtctaactgt tcatttatat gattctctaa aacactgata ttattgtagt  12120

actatagatt atattattcg tagagtaaag tttaaatata tgtataaaga tagataaact  12180

gcacttcaaa caagtgtgac aaaaaaaata tgtggtaatt ttttataact tagagatgca  12240

atgctcatta tctctagaga ggggcacgac cgggtcacgc tgcactgcag ccaagtggcc  12300

cccatttgga cgtgaatgta gacacgtcga aataaagatt tccgaattag aataatttgc  12360

ttattgcttt cgcctataaa tacgacggat cgtaatttgt cgctttatca gaatgtactt  12420

tcattttata ataacgctgc ggacatctac atttttgaat tgaaaaaaaa ttggtaatta  12480

ctctttcttt ttctccatat tgaccatcat actcattgct gatccatgta gatttccctt  12540

acttgtctcc ctctaatctg actttattaa cccaaagcaa ttgcttattt gttccccacg  12600

cccacaaagc ccagcattgt ccctaaggta ttaatttgtt gttcgattct tgttcttgaa  12660

cccatttgga gaatgcaaca agggttttca tgtcagcacg gtaatggttc tgtgtaaatt  12720

ccagtagtgc tgcccaagta aagtctgggt atttcctcga atttgcggca ttaactaagc  12780

tagctgctgg tgtcaccggt ctctccagct cgggacatag aaagaatgca agtgattttc  12840

tcaccgtttc agtattcact actgcccaag cagctcttgt agataccgtt tgtcaaagcc  12900

tgtattcaaa caccacaacc tcattttcgt taaaattttt tgtatatacg tatgcatata  12960

tgttcagaat gtttattacc atgaatgtat cgcaatgttg acaacgaaag ctcctgggat  13020

atgagcaacg gagtgccact tttcatcggc aaacacttga aggcctccaa cttgatcctg  13080

atgaaggatt gtcaaggaag tgggatcggt gtggggaccg gttcccaggg tcaactcagg  13140

cttttcgcat ggagagtagt gattcagtct caggattgaa tcattttgtt cgaaaaagtc  13200

tttgaagtag gcttggtcaa gccctagact tatccctagc agccccatta tctctttgga  13260

aaccttgttc ctggcttcac aatattcctg gtaaagcctc ctgtcaagta cgaaaagcaa  13320

aatcgagtgt tagattccta tcctatggta aaacttgtcg caacattcta caaattaaca  13380

taggttataa aagagaaacg caaagtcaaa aaaggccatc cagttataat gtgtattttt  13440

tgttttagga gaaggggtat ttaagcaatc catgttgaat ggacttaggg ttcggtcaat  13500

gcaaggaatg atgtctattg aatttgtcac cccatctctt tcaaacctaa aaaagatgta  13560

tatccaattg tcactatttg tacaaggctt gaaatacaca tggggttaac aaatacgctg  13620

aaactgcaac atgtattttt tgcattttgg agactaaatc ttgacgtaaa aataagctga  13680

tcatctcgta tattgactga atgcaaatta gcatttctcc tatttaatta ggaatggaag  13740

ggtgagaaga atttatttac ccaaaatctc taaaatcttc agtgccgaaa agacagtgtt  13800

tctttccatg gcaacttgga ggaaaacctg ccaacgaaac tgcttgcata cccatagctt  13860

tctcctactt ttctcttagc cttttgcttc tcagagagtt gcaggctgaa gaagcggtcc  13920

atgtactgat gagcttacaa ccaaaaaaaa cccatgcttc ttgcatgcct cattcaccgc  13980

ccctgccact tttgatacag caagagagcc cccaagcaag aaagctccca agtcaatggc  14040

ttgaattaca agttccgggt catccaggca tggcttatcg tcgtcaggcc atatgaactg  14100

agagggtata ttggattcag atccaaggat tgatgcatcg aaagctaaag ggcgatgctc  14160

attctttgcg acagcagcag ttggcggaag catcggcttc tcttgaatga cagaaactat  14220

tggcagacaa tgtaccattt tctgtttctt gttttaggtg gtcggagagg aaaaagaaga  14280

caagatatag aggagcaaaa ctaagagggt ttaaataaga gaagtagaaa accaataata  14340

tttggaatct aattgtttgt tttgaactgt tgcctcattt cccctttaat ttgtgttgtg  14400

ttggcagctt aacgcttcct ttgggttcga ttgcaatata gtgcgttgaa atttttacct  14460

tgattttcaa tctcactaca ccacagtgac ttgcttggtt gtttggataa tttttacctt  14520

gattttcaat ctcactacac cacagtgact tgcttggttg tttggataat ttttaccttg  14580

attttcaatc tcactacacc acagtgactt gcctggttgt ttggatatct tggtttccag  14640

cacagtgaga caagcctgct gcactcgaca accttatctt cactggtgct aaaagctcca  14700

gtcagctcta gctagggcaa taggtatttt tggatgacaa aaatacccat actttaattt  14760

attattttac cattttatcc ttagatgtta aactaatttc tttcccaatc ttatttgttt  14820

tcagatttgg gaataaaaca atagtttctc ccttgttctt gctggtttct cccttgttct  14880

tgctggtttc tcccctcttt tttgctttgt tcttggttgt gggagcttag gatattcttt  14940

ttcttcaatc agactaacaa gttagagata tcttgtgttt tttcacttta ttttctcatg  15000

ctcaacattt accctttttc tcaattaaca ggggaagtct acattaatta gtgcactctc  15060

agatagtaat ctgtatagtg atgcaatgta tatatattct ttaaaacagt ttttcctcga  15120

agttaaattc tttgttaaaa gtaaaaggct ggatgttttt acctaattgg aggtaatgtc  15180

tttgtgtaga ttgtttgcaa cattggatgg ttgattaaaa agtgttgttc ttccttcaag  15240

gtgagatggt ttgctgtcac tcactattat tattgttgtt attgttattg cttttccatt  15300

gaatagcctg gttctaaatg atatacttac cttatcccat aggcagcaac attttatctt  15360

ttgatctttg gacctatcat ttagcatgct ttacactcta tttagtaata ttattactaa  15420

ctataatttt aagtcataca caatgaaatt acctaaacat ctaaactcaa aaaattataa  15480

cttaaagctt                                                         15490

<210>2

<211>9382

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Cry1Ac事件3006-210-23的插入片段及其边界序列

<220>

<221>misc feature

<222>(556)..(556)

<223>n是a、c、g或t

<400>2

accaattatt atcgtctttt ttaattattc caacctttaa ctattatcct gccttaaaat   60

tcgaatacat ttattatcta taaactatcc gaatattatt atctaaatcc taattaaata  120

ctatttttta tcgagtattc gtatccgcca aggaaatcca tctccaaatt ttcaattatt  180

tttcagatat ctaaatctgt aaaatttcaa attcaagtac gttacaattc tttataaata  240

atccaaatta taaatatttt ataactatta attcataaat taaaatttat tattcaaata  300

ttcgaataat ctatttttaa gacgtaaagt attacatcga agggttactt tcaaagggta  360

gtgtatttcc atttcaatta ttcagaacgt tgtcgttttg ttccggtcat agaaaagggc  420

tctggaagag aagaaaatga cttgactttt caatttcatg ctcatccact cgtttcaatt  480

actgtttact aaaaaaataa taaaataaaa tattaacaat gcattgagta tgatgtccgg  540

gaaatctaca tggatnagca atgagtatga tggtcaatat ggagaaaaag aaagagtaat    600

taccaatttt ttttcaattc aaaaatgtag atgtccgcag cgttattata aaatgaaagt    660

acattttgat aaaacgacaa attacgatcc gtcgtattta taggcgaaag caataaacaa    720

attattctaa ttcggaaatc tttatttcga cgtgtctaca ttcacgtcca aatgggggcc    780

acttggctgc agccaagctt tcgcgagctc gagatccccg acatatgccc cggtttcgtt    840

gcgactaaca tgagttcttg gacaaatttg attggacctg atgagatgat ccaacccgag    900

gatatagcaa agctcgttcg tgcagcaatg gaacggccaa accgtgcttt tgtccccaag    960

aatgaggtgc tatgcatgaa ggaatctacc cgttgatgtc caacagtctc agggttaatg   1020

tctatgtatc ttaaataatg ttgtcggtat tttgtaatct catatagatt ttcactgtgc   1080

gacgcaaaaa tattaaataa atattattat tatctacgtt ttgattgaga tatctagatc   1140

tcgaggtgtg gaagatatga atttttttga gaaactagat aagattaatg aatatcggtg   1200

ttttggtttt ttcttgtggc cgtctttgtt tatattgaga tttttcaaat cagtgcgcaa   1260

gacgtgacgt aagtatccga gtcagttttt atttttctac taatttggtc gtttatttcg   1320

gcgtgtagga catggcaacc gggcctgaat ttcgcgggta ttctgtttct attccaactt   1380

tttcttgatc cgcagccatt aacgactttt gaatagatac gtctagggtc gaggggggat   1440

ccgtcgaggg ggtccaccaa aaacgtaagc gcttacgtac atggtcgagg gggtccacca   1500

aaaacgtaag cgcttacgta catggtcgag ggggtccacc aaaaacgtaa gcgcttacgt   1560

acatggtcga gggggtccac caaaaacgta agcgcttacg tacatggtcg actagagcgt   1620

gacgctcgcg gtgacgccat ttcgcctttt cagaaatgga taaatagcct tgcttcctat   1680

tatatcttcc caaattacca atacattaca ctagcatctg aatttcataa ccaatctcga   1740

tacaccaaat cgcggatccg tcgacctgca ggtcgacatg tctccggaga ggagaccagt   1800

tgagattagg ccagctacag cagctgatat ggccgcggtt tgtgatatcg ttaaccatta   1860

cattgagacg tctacagtga actttaggac agagccacaa acaccacaag agtggattga   1920

tgatctagag aggttgcaag atagataccc ttggttggtt gctgaggttg agggtgttgt   1980

ggctggtatt gcttacgctg ggccctggaa ggctaggaac gcttacgatt ggacagttga   2040

gagtactgtt tacgtgtcac ataggcatca aaggttgggc ctaggatcca cattgtacac   2100

acatttgctt aagtctatgg aggcgcaagg ttttaagtct gtggttgctg ttataggcct   2160

tccaaacgat ccatctgtta ggttgcatga ggctttggga tacacagccc ggggtacatt   2220

gcgcgcagct ggatacaagc atggtggatg gcatgatgtt ggtttttggc aaagggattt   2280

tgagttgcca gctcctccaa ggccagttag gccagttacc cagatctgag tcgacggatc   2340

cccgacatat gccccggttt cgttgcgact aacatgagtt cttggacaaa tttgattgga   2400

cctgatgaga tgatccaacc cgaggatata gcaaagctcg ttcgtgcagc aatggaacgg   2460

ccaaaccgtg cttttgtccc caagaatgag gtgctatgca tgaaggaatc tacccgttga   2520

tgtccaacag tctcagggtt aatgtctatg tatcttaaat aatgttgtcg gtattttgta   2580

atctcatata gattttcact gtgcgacgca aaaatattaa ataaatatta ttattatcta   2640

cgttttgatt gagatatcat caatattata ataaaaatat ccattaaaca cgatttgata   2700

caaatgacag tcaataatct gatttgaata tttattaatt gtaacgaatt acataaagat   2760

cgaatagaaa atactgcact gcaaatgaaa attaacacat actaataaat gcgtcaaata   2820

tctttgccaa gatcaagcgg agtgagggcc tcatatccgg tctcagttac aagcacggta   2880

tccccgaagc gcgctccacc aatgccctcg acatagatgc cgggctcgac gctgaggaca   2940

ttgcctacct tgagcatggt ctcagcgccg gctttaagct caatcccatc ccaatctgaa   3000

tatcctatcc cgcgcccagt ccggtgtaag aacgggtctg tccatccacc tctgttggga   3060

attctgatct tggcgcgcat gcggatcctc attcctccat cagaagtaac tccacgctat   3120

caacaatgaa tgttccttcc gtttctccaa tctcaatcca aaccttgtcg gtttctggaa   3180

agtactctaa ctctttggtg acatagccgg ctggtaacgg tgtgtagtcc ccatagcctc   3240

tgttagattc gcaaggattg tccctacgtc catcggtgta agccttctcc tcataggctg   3300

atgcatagtc agcgggtaca gaagagttgc tctcataggc tccatcgtat cctcgattgc   3360

gagaagtgta agtaccctca tactcctctt gagtcgcagt gtagtcattg caagttacgg   3420

tgttgtttgg gtagacttcc tcctcgacgc agttgctgaa cttcagctcg tcggtgttgt   3480

tctcaatctc gtgtatggtg acgcaacctt ctccgtatcc ttctttgtac gcggtaacac   3540

gaagaatgta gccacgacca ggacagacac gaacttcttg tgaaacttct gcttcccact   3600

caggaacaac aaggacagag cggtgattgt tctgttcttc tacatctacg tgccctttca   3660

cattccagca ggataggcca ttgttgaagt caccattctt gatgacattc ctcgcatcat   3720

acaaggagaa tgcagtgaag atgcgccctt ctaactcttc aaagatagca gcattgacac   3780

ccggaatcac gctaagttca ggaaggtaag cttcccgaat gctatgaacg cgtttgtctg   3840

cagcatgaat catagctatg ttggtatcag cttggagcct atcatactga gagttcacaa   3900

acagagcgtc aacgctttct ttggcttctt tgtacacaat gtttgtttcc cattccaact   3960

tctctctctt gtccctccac ttcttctcag ccctcttcac tctagcgagg gcttctccaa   4020

caagtggttt ctcttctaga aactccagat tgcctagcct ggcatggcca tcttgagtct   4080

tgatcttgaa gatcacccac acaccgaggt cttcgttcag gtcggtacag ccaacgtcta   4140

tgtccaagga gaagtggtgt gagtgatggg cacacttgcc gatgggactt ggggctgaaa   4200

gtggccagag tgaacccgtc ccaggcacat tgactgtctc atgtttggcg ttgtatctga   4260

tgaggtagat ctcaaggtct tgactgtcct cgatgtaacc tctcaactgg tatcttgtgt   4320

aggctttgag tttcgattca tctatcttct ggtacaggta tgttggatag cactcatcaa   4380

aggtacccaa gagcgtaaca tagttctcct tgaacacatc atcacctcct tgaatggtga   4440

tgtccgtact tcccctccat ccacgatcta gttgcctgtt gatcccgcga aagttgggat   4500

cttgaagcaa gttccgctca tcactaagtc gcttagcatg tttgaccttc tcggacaact   4560

ccttcttctc atccaaacag aactcatcag agaggcactc aacaaggttg gaaacgcgat   4620

cgatgtgata gtcagtcaca tctgtcttga gcccaatctg attggacgaa gtgaacagag   4680

cattcaccgc cttctgtgct ctttccaagt cagactctgc ctcgagcgtt gcagtaacgg   4740

gaatgaattc gaagcggtcg attatcactc cggcggttcc ggagaaattt ctaacaccta   4800

ctatgttacc tagggaagag gtgaaggcat tggcactttc gaagtaaccg aaatcgctag   4860

attggagatt atccaaggat gtagctgtcg ctggtactgt attggaaaag atggaggaat   4920

taccccaatt gacgttgagg tgaatagggg taacagaggc ataccttaca cgaacacgat   4980

atctggtaga tgtcgatggg aagtgaatgg gcacttcaat ataccctcta ttctggatgt   5040

tgttgccgga agaattcagc ctaaccaagt cgcctccagt gaatcctggt cctgaaatga   5100

cagaaccatt aaagagaaag ttccccttga cagctgggat ctgagtaatg ctatcggatg   5160

caattatgtt gttaaactca gcactacgat gtatccaaga gaacatcgga gctctgatga   5220

tactaacgct gctattacta aagcctgaac ggaacatgga cacatggcta aggcgatggc   5280

taaacccttg cctaggtgga acgttgttgt tctgtggagg gatctcatcc aagctatcaa   5340

ctgttccgct ctttctgtag acagcggatg gcagatttga ggaggttcca taggcaaatt   5400

ctgtcccgtc aagcacagac aattgttgat tgttgatgcc gatgttgaaa ggtctcctat   5460

atagagtgct ggacaaggtt ctatacacgc cctgaccgag ttgagcaaca atacgttgtt   5520

gtggagctgc attgcccata gtcccgtaaa gtgggaaagt gaattctggt ccagagaacc   5580

caacgggtga tgccatgatc tgatgccctg accagtagta ataaccgcgg tgcgcatcgg   5640

tgtagatcgt gatactgttc aatatgtcca tcaggtgtgg agacctgatg cttctctcta   5700

tgccctgagc cgagcctcga aagctaccgt cgaagttctc gaggactggg tttgtgtaga   5760

tttcccgggt caattgtgac acagtacgga ttgggtagcg cctagagtcg tagttgggaa   5820

agagagcgac aatgtctagg acagttagtg tcaactctcg cctgaactgg ttgtacctga   5880

cccaatctct agaatccggt ccccagacac gttcgagacc cgtgttgtac cagcgaacag   5940

cataatcggt atagttgcca ataagcctag tcagatcatt ataacgacta ttgatagttg   6000

cggcatcaaa gccccaccgt tgtccgaaca cggagacatc gcggagcacc gacaagtgca   6060

ggttggcagc ctgcacgtac acggataaaa gaggaacttg gtaattctga acggcgaaga   6120

gcggaattgc ggtcgtcagc gcgctgttca tgtcattgaa ttgaatgcgc atctcctctc   6180

ttaaggcagg attggtcggg tctgcttccc actctcgaaa agattctgcg taaatctggt   6240

aaaggttgct gaggccttct aaccttgaga tggcttggtt cctagcgaat tcttctattc   6300

tttggttaat taactgctct atctgtacaa gaaaggcgtc ccattgagag ggaccaaaga   6360

ttccccaaat gatatcgaca agtccaagca cgaatccagc accgggcacg aactctgaca   6420

aaaggaattg ggtaagtgac aacgagatgt cgataggtgt gtaaccagtc tcaatccgtt   6480

ctccacccag cacctcaacc tcagggttgc tcaggcagtt gtaaggaatg cactcgttga   6540

tgttgggatt gttgtccatt gttggatcct ctagagtcga cctgcagaag taacaccaaa   6600

caacagggtg agcatcgaca aaagaaacag taccaagcaa ataaatagcg tatgaaggca   6660

gggctaaaaa aatccacata tagctgctgc atatgccatc atccaagtat atcaagatca   6720

aaataattat aaaacatact tgtttattat aatagatagg tactcaaggt tagagcatat   6780

gaatagatgc tgcatatgcc atcatgtata tgcatcagta aaacccacat caacatgtat   6840

acctatccta gatcgatatt tccatccatc ttaaactcgt aactatgaag atgtatgaca   6900

cacacataca gttccaaaat taataaatac accaggtagt ttgaaacagt attctactcc   6960

gatctagaac gaatgaacga ccgcccaacc acaccacatc atcacaacca agcgaacaaa   7020

aagcatctct gtatatgcat cagtaaaacc cgcatcaaca tgtataccta tcctagatcg   7080

atatttccat ccatcatctt caattcgtaa ctatgaatat gtatggcaca cacatacaga   7140

tccaaaatta ataaatccac caggtagttt gaaacagaat tctactccga tctagaacga   7200

ccgcccaacc agaccacatc atcacaacca agacaaaaaa aagcatgaaa agatgacccg   7260

acaaacaagt gcacggcata tattgaaata aaggaaaagg gcaaaccaaa ccctatgcaa   7320

cgaaacaaaa aaaatcatga aatcgatccc gtctgcggaa cggctagagc catcccagga   7380

ttccccaaag agaaacactg gcaagttagc aatcagaacg tgtctgacgt acaggtcgca   7440

tccgtgtacg aacgctagca gcacggatct aacacaaaca cggatctaac acaaacatga   7500

acagaagtag aactaccggg ccctaaccat ggaccggaac gccgatctag agaaggtaga   7560

gagggggggg gggggaggac gagcggcgta ccttgaagcg gaggtgccga cgggtggatt   7620

tgggggagat ctggttgtgt gtgtgtgcgc tccgaacaac acgaggttgg ggaaagaggg   7680

tgtggagggg gtgtctattt attacggcgg gcgaggaagg gaaagcgaag gagcggtggg   7740

aaaggaatcc cccgtagctg ccggtgccgt gagaggagga ggaggccgcc tgccgtgccg   7800

gctcacgtct gccgctccgc cacgcaattt ctggatgccg acagcggagc aagtccaacg   7860

gtggagcgga actctcgaga ggggtccaga ggcagcgaca gagatgccgt gccgtctgct   7920

tcgcttggcc cgacgcgacg ctgctggttc gctggttggt gtccgttaga ctcgtcgacg   7980

gcgtttaaca ggctggcatt atctactcga aacaagaaaa atgtttcctt agttttttta   8040

atttcttaaa gggtatttgt ttaattttta gtcactttat tttattctat tttatatcta   8100

aattattaaa taaaaaaact aaaatagagt tttagttttc ttaatttaga ggctaaaata   8160

gaataaaata gatgtactaa aaaaattagt ctataaaaac cattaaccct aaaccctaaa   8220

tggatgtact aataaaatgg atgaagtatt atataggtga agctatttgc aaaaaaaaag   8280

gagaacacat gcacactaaa aagataaaac tgtagagtcc tgttgtcaaa atactcaatt   8340

gtcctttaga ccatgtctaa ctgttcattt atatgattct ctaaaacact gatattattg   8400

tagtactata gattatatta ttcgtagagt aaagtttaaa tatatgtata aagatagata   8460

aactgcactt caaacaagtg tgacaaaaaa aatatgtggt aattttttat aacttagaca   8520

tgcaatgctc attatctcta gagaggggca cgaccgggtc acgctgcact gcaggcatgc   8580

gcgccttaat taaggaattc ctcgagttta aacggatccc tgaaagcgac gttggatgtt   8640

aacatctaca aattgccttt tcttatcgac catgtacgta agcgcttacg tttttggtgg   8700

acccttgagg aaactggtag ctgttgtggg cctgtggtct caagatggat cattaatttc   8760

caccttcacc tacgatgggg ggcatcgcac cggtgagtaa tattgtacgg ctaagagcga   8820

atttggcctg tagacctcaa ttgcgagctt tctaatttca aactattcgg gcctaacttt   8880

tggtgtgatg atgctgactg gcttacgtgt ggaaaaaatt tgcaatctat gtagtcttta   8940

actaatgttt ttttctttaa aaaaaaagtc attatttttg gtttgattaa tatatttggt   9000

ttaaattaaa taaaatatta aaaagtttag ttaaatcatc tatttaaacg atttgtactg   9060

atttgtgatc tattaatttt ttaacttaat ctagaccagg gtactagttg gtccgatccc   9120

atcttgaaaa cactatcttt agcttgctgg taggttccag ggtagaaggc agagactttt   9180

ttggagggtt tttattatta aatttatatt tttataattt ttaaatgatt aaaataaaaa   9240

tttattattt taagaggaga taaagtgcaa ttttaccata tattaattta aaattttata  9300

aatttaaaaa agaaaaaaac taaaatttta attttatagg ttctaaaata ataaatataa  9360

cttactgagt ttttttaagc tt                                           9382

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物281-14

<400>3

tgtcggctga aggtagggag g                                              21

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物281-15

<400>4

ccggacatga agccatttac                                                20

<210>5

<211>603

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>使用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4产生的扩增子的603bp的序列

<400>5

tgtcggctga aggtagggag gaattaatca atcacagttg cttgtttctg agtctataga   60

atcatgaatt ttaaatttat ggaatgcatt ttttcgaaga tattgtatgc attaagtgta  120

attttagttt caatatgaaa tttgagattt atatatatac ttacataaaa ccctccttta  180

ctgaattagt gccatggata aaagaccaat taagcaatcc ttccaacacg tgcatgcact  240

ggattttcat cgcctcgtcc attgttaaat tgataggtta ataagaacaa ttagttggct  300

actgattata tggattctgg gttaaaagta tttaggttta ctgttacata catggaggat  360

ctacatctat tttcactttt gtttaattaa tttaagttag ttttgatgag tttaaggatt  420

gtactagcca atagtagtac ataaaggaga tagagtacca aaacaaagaa aaagccgaaa  480

ggtgttaatg ctaaattgta aaagaaagtt aaaataagag actcgaatta taatatgatt   540

ctctggcgca ctaattaagc tactatatat tgtcaatagt attgtaaatg gcttcatgtc   600

cgg                                                                 603

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物281-9

<400>6

tctctagaga ggggcacgac c                                              21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物281-10

<400>7

cgagctggag agaccggtga c                                             21

<210>8

<211>562

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>使用引物SEQID NO：6和SEQID NO：7产生的扩增子的562bp的序列

<400>8

tctctagaga ggggcacgac cgggtcacgc tgcactgcag ccaagtggcc cccatttgga   60

cgtgaatgta gacacgtcga aataaagatt tccgaattag aataatttgc ttattgcttt  120

cgcctataaa tacgacggat cgtaatttgt cgctttatca gaatgtactt tcattttata  180

ataacgctgc ggacatctac atttttgaat tgaaaaaaaa ttggtaatta ctctttcttt  240

ttctccatat tgaccatcat actcattgct gatccatgta gatttccctt acttgtctcc  300

ctctaatctg actttattaa cccaaagcaa ttgcttattt gttccccacg cccacaaagc  360

ccagcattgt ccctaaggta ttaatttgtt gttcgattct tgttcttgaa cccatttgga  420

gaatgcaaca agggttttca tgtcagcacg gtaatggttc tgtgtaaatt ccagtagtgc  480

tgcccaagta aagtctgggt atttcctcga atttgcggca ttaactaagc tagctgctgg  540

tgtcaccggt ctctccagct cg                                             562

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物3006-20

<400>9

ttccaacctt taactattat cctgc                                           25

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物3006-22

<400>10

gctgcggaca tctacatttt                                                 20

<210>11

<211>614

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>使用引物SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10产生的扩增子的614bp的序列

<400>11

ttccaacctt taactattat cctgccttaa aattcgaata catttattat ctataaacta     60

tccgaatatt attatctaaa tcctaattaa atactatttt ttatcgagta ttcgtatccg    120

ccaaggaaat ccatctccaa attttcaatt atttttcaga tatctaaatc tgtaaaattt    180

caaattcaag tacgttacaa ttctttataa ataatccaaa ttataaatat tttataacta    240

ttaattcata aattaaaatt tattattcaa atattcgaat aatctatttt taagacgtaa    300

agtattacat cgaagggtta ctttcaaagg gtagtgtatt tccatttcaa ttattcagaa    360

cgttgtcgtt ttgttccggt catagaaaag ggctctggaa gagaagaaaa tgacttgact    420

tttcaatttc atgctcatcc actcgtttca attactgttt actaaaaaaa taataaaata    480

aaatattaac aatgcattga gtatgatgtc cgggaaatct acatggatca gcaatgagta    540

tgatggtcaa tatggagaaa aagaaagagt aattaccaat tttttttcaa ttcaaaaatg    600

tagatgtccg cagc                                                      614

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物3006-9

<400>12

gacatgcaat gctcattatc tcta                                            24

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物3600-12

<400>13

aagtctctgc cttctaccct gg                                              22

<210>14

<211>662

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>使用引物SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13产生的扩增子的662bp的序列

<400>14

gacatgcaat gctcattatc tctagagagg ggcacgaccg ggtcacgctg cactgcaggc     60

atgcgcgcct taattaagga attcctcgag tttaaacgga tccctgaaag cgacgttgga    120

tgttaacatc tacaaattgc cttttcttat cgaccatgta cgtaagcgct tacgtttttg    180

gtggaccctt gaggaaactg gtagctgttg tgggcctgtg gtctcaagat ggatcattaa    240

tttccacctt cacctacgat ggggggcatc gcaccggtga gtaatattgt acggctaaga    300

gcgaatttgg cctgtagacc tcaattgcga gctttctaat ttcaaactat tcgggcctaa    360

cttttggtgt gatgatgctg actggcttac gtgtggaaaa aatttgcaat ctatgtagtc    420

tttaactaat gtttttttct ttaaaaaaaa agtcattatt tttggtttga ttaatatatt    480

tggtttaaat taaataaaat attaaaaagt ttagttaaat catctattta aacgatttgt    540

actgatttgt gatctattaa ttttttaact taatctagac cagggtacta gttggtccga    600

tcccatcttg aaaacactat ctttagcttg ctggtaggtt ccagggtaga aggcagagac    660

tt                                                                   662

<210>15    

<211>53

<212>DNA

<213>陆地棉(Gossypium hirsutum)

<220>

<223>在棉花中基因座281-24-236上的基因组DNA片段

<400>15

ataacttctg tagctctatt ccttagaccc accatgaacg agcagataaa tgc            53

<210>16

<211>16

<212>DNA

<213>陆地棉

<220>

<223>在棉花中基因座3006-210-23上的基因组DNA片段

<400>16

cttggttatt ctatga                                                     16