经物理/物理化学刺激处理的无定形细胞递送载体

技术领域

本发明属于功能性组织工程领域。更特别地，本发明在一些方面涉及体外培养方法及其产物，其用于再生适于替代或修复受损组织部位的组织。

技术背景

有许多恢复活体的受损组织或致病部分的方法。一种方法是使用活组织以外的材料比如塑料、金属和/或陶瓷替代受损组织或致病部分从而恢复受损组织或致病部分。另一种方法是使用来自其它个体或其它动物或来自活体的不同区域例如皮肤的部分替代受损组织或致病部分。这些方法可能存在某些缺陷，包括非活组织的物理磨损和移位以及活组织对于某些目的的可用性和合适性。第三种方法是体外产生新的活组织。

因此，恢复活体的受损组织或致病部分的一种方法是使用通过体外培养细胞或组织所得组织替代组织的受损部分。目前已报道了这些方法通常可适用于许多组织比如皮肤、软骨、骨、血管、肝和胰腺。如果在患者活体外培养来自活体的细胞或组织，并将培养所得的细胞或组织用来恢复损伤部分，则可在体内再生组织。此外，如果用于恢复的组织来源于接受该培养组织的个体，那么就不必考虑该组织植入所述个体中时的免疫排斥问题。

包裹柔韧连接骨末端的关节软骨具有在负荷关节中分配负荷的功能。为了实现该功能，软骨组织能在低负荷或压力条件下可逆地吸收水，并在高负荷或压力条件下释放水。此外，软骨表面在关节中起滑动面作用。

软骨没有脉管系统，其体内再生能力尤其在成年个体中的再生能力非常有限，并且即使待再生的软骨块的体积小也是如此。但是，关节软骨经常因磨损、年龄、疾病或创伤或过劳损伤而退化，需要比自然再生明显更大的体积。此类软骨层缺陷导致受影响关节移动和加负载时疼痛，并可引起进一步的并发症比如炎症，其可以进一步损害软骨层。

因为这些原因，已经进行了相当长期的研究以替代或修复缺失或受损软骨，尤其是关节软骨。

修复单独涉及关节软骨或涉及关节软骨与其下的软骨下骨组织的缺陷的方法包括：在缺陷位置研磨或钻孔以形成具有尽可能准确几何形状的孔，从负重较轻的位置(如同一关节中)通过钻孔或打孔抽取具有相同几何形状的软骨或软骨与骨的盘，将该柱状物插入待治疗缺陷处的孔中。用同样的方式，修复具有几个孔的较大缺陷(镶嵌整形术(mosaicplasty))。

已开发了试图至少部分在体外产生软骨的许多方法，也即，在人工条件下使用活天然细胞产生软骨。这些方法所面临的一个问题是在这些体外条件下的软骨细胞具有相对快速地去分化为成纤维细胞的倾向。由于这种去分化，软骨细胞丧失了产生II型胶原的能力，而II型胶原是软骨组织的最重要成分之一。解决体外软骨细胞去分化问题的努力包括在单层或三维骨架中以高细胞密度培养固定软骨细胞。在这些条件下，软骨细胞自我繁殖而无实质性去分化，并且它们可形成至少类似于天然软骨细胞外基质的细胞外基质。三维骨架不仅用于固定细胞还提供需要的植入后机械稳定性，因为以上述方式产生的软骨组织不具有承受即使低机械张力的稳定性。

发明内容

功能性组织工程的主要目的是开发新组织(细胞构建体)以修复或替代受损组织。对于整形外科应用，刚度(rigidity)和韧性(stiffness)对于替代受损组织而言是重要的，因为植入物必须能承重、关节-负荷和伸展。本发明涉及解决这些问题的新系统，其具有三种主要成分：可降解载体、半透膜和生物反应器，其将流体静压施加于培养细胞。

本发明的某些方面提供通过产生液体水凝胶-细胞组合物而产生用于对象中的新组织的体外方法，所述组合物包含可生物降解的水凝胶和组织前体细胞，它们处于至少部分被半透膜限制的细胞培养空间中并在模拟组织体内条件的物理/物理化学条件下培养。选择半透膜，使得细胞、细胞所产生的任何高分子量细胞外基质和可生物降解的水凝胶载体的高分子量降解产物保留在细胞培养空间内。本发明某些方面的特征是使用无定形水凝胶或其它可生物降解载体，而不用预成型骨架或其它支持结构，使得在体外或体内，体外培养的产物可变形以采取由可引入该产物的空间或容器所限定的三维形状。可将体外细胞培养产物移植入对象，例如通过注射器或导管。本发明的方法和组合物适用于治疗多种组织例如包括软骨组织。

本发明某些方面的特征还在于涉及产生和应用可注射的细胞/基质组合物的方法和组合物，所述组合物包括具有内源性细胞外基质(ECM)的软骨形成细胞。使用本发明体外培养方法所产生的ECM在其生化、组织学和/或生物力学特征上有利地密切类似天然存在的ECM。

在一方面，本发明提供在体外培养细胞的方法。根据本发明此方面的方法包括以下步骤：使选用于体外培养的细胞群与可生物降解的无定形载体相接触；将所接触的细胞群置于接受所述细胞的细胞空间内，所述细胞空间至少部分以截留分子量大于100kDa和高达1,000kDa的半透膜为界限；和向所接触的细胞群周期性施加压力。

在根据本发明此方面的一种实施方案中，所述细胞包含软骨细胞以及任选地其前体细胞。

在根据本发明此方面的一种实施方案中，所述细胞基本由软骨细胞组成。

在根据本发明此方面的一种实施方案中，所述可生物降解的无定形载体包含I型胶原。

在根据本发明此方面的一种实施方案中，所述可生物降解的无定形载体包含葡聚糖珠。

在根据本发明此方面的一种实施方案中，所述可生物降解的无定形载体包含选自葡聚糖、硫酸软骨素、聚乙二醇、透明质酸(hyaluronan)及其任何组合的水凝胶。

在根据本发明此方面的一种实施方案中，所述接受细胞的细胞空间由半透膜管组成，所述半透膜管包含至少一个用于接受细胞的可闭合开口。

在根据本发明此方面的一种实施方案中，所述接受细胞的细胞空间由半透膜袋(pouch)组成，所述半透膜袋包含至少一个用于接受细胞的可闭合开口。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述半透膜具有至少200kDa的截留分子量。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述半透膜具有至少250kDa的截留分子量。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述半透膜具有至少500kDa的截留分子量。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述半透膜具有1,000kDa的截留分子量。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述半透膜是携带净正电荷的半透膜。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述携带净正电荷的半透膜是涂有聚-L-赖氨酸的半透膜。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述周期性施加压力包括以0.001-1Hz施加0.5-3.5MPa。

在一个方面本发明提供一种组合物，其包括与可生物降解的无定形载体相接触的体外扩增细胞群。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述细胞包含软骨细胞以及任选地其前体细胞。在此情况下所述细胞/基质组合物被称为用于本发明目的的软骨细胞/基质组合物。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述细胞基本由软骨细胞组成。在此情况下所述细胞/基质组合物也被称为用于本发明目的的软骨细胞/基质组合物。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述可生物降解的无定形载体包含I型胶原。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述可生物降解的无定形载体包含葡聚糖珠。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述可生物降解的无定形载体包含选自葡聚糖、硫酸软骨素、聚乙二醇、透明质酸及其任意组合的水凝胶。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述细胞和载体包含在接受细胞的细胞空间内，所述细胞空间至少部分以截留分子量大于100kDa和高达1,000kDa的半透膜为界限。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述半透膜具有至少200kDa的截留分子量。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述半透膜具有至少250kDa的截留分子量。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述半透膜具有至少500kDa的截留分子量。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述半透膜具有1,000kDa的截留分子量。

在一个方面本发明提供一种组合物，其包括根据上述体外培养细胞的方法所产生的细胞/基质组合物。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述细胞/基质组合物包含软骨细胞以及任选地其前体细胞。在此情况下所述细胞/基质组合物被称为用于本发明目的的软骨细胞/基质组合物。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述细胞/基质组合物的细胞基本由软骨细胞组成。在此情况下所述细胞/基质组合物也被称为用于本发明目的的软骨细胞/基质组合物。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述细胞/基质组合物包含可生物降解的无定形载体，所述无定性载体包含I型胶原。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述细胞/基质组合物包含可生物降解的无定形载体，所述无定性载体包含葡聚糖珠。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述细胞/基质组合物包含可生物降解的无定形载体，所述无定性载体包含选自葡聚糖、硫酸软骨素、聚乙二醇、透明质酸及其任意组合的水凝胶。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述细胞/基质组合物包含在用于接受细胞的细胞空间内，所述细胞空间至少部分以截留分子量大于100kDa和高达1,000kDa的半透膜为界限。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述半透膜具有至少200kDa的截留分子量。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述半透膜具有至少250kDa的截留分子量。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述半透膜具有至少500kDa的截留分子量。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述半透膜具有1,000kDa的截留分子量。

在一个方面本发明提供一种治疗受损软骨性组织的方法。根据本发明此方面的方法包括以下步骤：将有效量的本发明软骨细胞/基质组合物引入受损软骨性组织部位以治疗所述受损软骨性组织。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述软骨性组织是椎间盘。

在一个方面本发明提供一种治疗受损关节软骨表面的方法。根据本发明此方面的方法包括以下步骤：将有效量的本发明软骨细胞/基质组合物引入由受损关节软骨表面部位之上的软骨的表面层或表面过渡区域以及受损关节软骨表面下的软骨或软骨下骨所限定的空间内，以治疗所述受损关节软骨表面。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述引入作为关节镜操作的一部分以治疗所述受损关节软骨表面。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述受损关节软骨表面是受损的膝关节软骨表面。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述受损关节软骨表面是受损的髋关节软骨表面。

在根据本发明该方面的一种实施方案中，所述受损关节软骨表面是选自肩、肘、手(腕骨间、腕掌间、掌骨间、掌指间、指节间)和颞下颌的受损关节表面。

在一个方面本发明提供一种治疗对象中骨关节炎的方法。根据本发明此方面的方法包括以下步骤：在患有骨关节炎的对象中将有效量的本发明软骨细胞/基质组合物引入由受损关节软骨表面部位之上的表面区软骨和受损关节软骨表面部位之下软骨下骨所限定的空间内，以治疗骨关节炎。

本发明这些和其它方面以及实施方案将结合以下部分进一步详细说明。

附图说明

附图仅是用于举例说明而非实施本文公开的发明所必需的。

附图1是描述流体静压/灌注培养系统(生物反应器)的照片图，所述系统设计用于递送正流体静压于含或不含恒定灌注介质的培养海绵。基本系统包括(1)具有气体交换硅管的介质储器，(2)灌注泵(单活塞缸泵)，(3)培养室，和(4)反压控制模块。细胞与半透膜袋一起悬于所述室内，其保持在指定温度，如37℃。使用计算机设定并控制流体静压幅度、灌注速率、O₂/CO₂气体浓度和温度。

附图2是描述将半透膜袋用于在可生物降解的无定形载体中培养细胞的示意图。半透膜(例如，透析管)选择性允许小分子(例如，气体、氨基酸、离子、蛋白质和降解碎片)的流入和流出并防止大分子(例如，聚集蛋白聚糖、胶原)流出。随着动态流体静压和恒定介质变化(灌注)，促进了扩散性传质并避免了直接流体剪切力。

附图3是描述分子标记物(葡聚糖-FITC，500kDa)从表面层向天然牛关节组织的限制性扩散的照片图。

附图4是描述皿中六个半透膜袋的照片图，各袋含有细胞/胶原凝胶载体。

附图5是一系列六个显微照片图，显示在静态、恒定流体静压以及周期性流体静压培养条件下标注出在细胞形状和几何学均存在显著差异。TB，甲苯胺蓝。

附图6是举例说明使用在半透膜袋中培养且经物理刺激处理的可注射软骨细胞/基质进行外科治疗的方法的示意图。

具体实施方式

本发明提供用于生长新组织比如软骨的方法和组合物，以及所述新组织组合物用于治疗对象中受损组织的方法。

1、定义

除非另有定义，本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。

如本文所用，选用于体外培养的细胞群是指从天然环境分离并提供用于体外培养的任何合适的活细胞集合。所述细胞群可以是基本均一的细胞类型或者可以是不均一的。例如，在一种实施方案中，均一细胞群可以包括来源于已建立的细胞系、细胞克隆、成年干细胞源、或原代培养产物的代表性细胞样品。在一种实施方案中，不均一细胞群可包括两种或多种细胞类型并可来源于任何合适的来源，所述来源包括源自一种或多种已建立的细胞系、细胞克隆、原代培养产物或其组合的代表性细胞样品。在一种实施方案中，所述细胞群是从透明(例如关节)软骨获得的细胞集合。这样的群体可包括但不限于软骨细胞、成纤维细胞、皮肤成纤维细胞和滑膜细胞。在一种实施方案中，所述细胞群基本由软骨细胞组成。在一种实施方案中，所述细胞群包括软骨细胞的前体细胞。在一种实施方案中，所述细胞群包括代表性去分化软骨细胞。

如本文所用，可生物降解的无定形载体是指任何合适的水凝胶，其在室温至生理温度(即20-38℃)下缺乏预定的自身三维形状，并在适于体外培养哺乳动物细胞的无菌条件下经两周至约六周的时间有明显程度的降解。这样的条件包括温度、pH、盐、以及酶或组织培养基成分、添加剂或废弃物的存在，它们可直接或间接作用于水凝胶，从而降低其分子量。可通过平均分子量评价降解，例如，降解一半的载体可以指平均分子量是其初始平均分子量50％的载体。作为替代或等同地，降解一半的载体可以指仅有初始平均分子量物质起始量的50％的载体。用于确定平均分子量的方法可包括但不限于浊度测量、比重、色谱法、渗透压、光散射和电泳法。在一种实施方案中，两周时降解程度为至少50％。在一种实施方案中，两周时降解程度为至少60％。在一种实施方案中，两周时降解程度为至少70％。在一种实施方案中，两周时降解程度为至少80％。在一种实施方案中，两周时降解程度为至少90％。在一种实施方案中，三周时降解程度为至少50％。在一种实施方案中，三周时降解程度为至少60％。在一种实施方案中，三周时降解程度为至少70％。在一种实施方案中，三周时降解程度为至少80％。在一种实施方案中，三周时降解程度为至少90％。

“水凝胶”是指有机聚合物(天然或合成)固定或固化所形成的物质，其形成三维开放晶格结构以包封水或其它溶液分子从而形成凝胶。例如固化可通过聚集、凝集、疏水相互作用或交联而发生。

在一种实施方案中，所述可生物降解的无定形载体不交联。例如，在本领域已知的一些方法中，合并然后光聚合某些水凝胶以包封细胞并形成三维骨架。例如参见Bryant SJ et al.(2003)J Biomed Mater Res64A：70-9；Bryant SJ et al.(2002)J Biomed Mater Res 59：63-72。

在一种实施方案中，所述可生物降解的无定形载体是选自以下的水凝胶：I型胶原、III型胶原、IV型胶原、葡聚糖、透明质酸(hyaluronan)、或其它碳水化合物、硫酸软骨素、聚乙二醇(PEG)、其它可生物降解的合成聚合物及其任意组合。在一种实施方案中，所述可生物降解的无定形载体包括I型胶原。在一种实施方案中，所述可生物降解的载体包括葡聚糖珠。通常选择所述可生物降解的无定形载体，使得其初始平均分子量大于本发明方法中所用半透膜的截留分子量。但是，如下所述，在至少一种情形下可选择所述可生物降解的无定形载体，使得其初始平均分子量小于本发明方法中所用半透膜的截留分子量。

如本文所用，接受细胞的细胞空间是指其中放置所述细胞群和可生物降解的无定形载体的容器的内部，其中所述细胞立即限于体外培养。在一种实施方案中，所述接受细胞的细胞空间是如本文所述的半透膜制成的管。在一种实施方案中，所述接受细胞的细胞空间是如本文所述的半透膜制成的袋。在这些实施方案的每一种中，所述接受细胞的细胞空间包括用于接受细胞的可闭合开口，例如通过将细胞吸移至管或袋内。所述可闭合开口可通过本领域已知的任何适宜方法密封，例如包括机械夹紧、捆绑、热封等。

如本文所用，半透膜是指任何适宜的多孔壁材料，其允许某些分子或溶质通过而不允许其它的通过。对于孔在其表面的空间分布，半透膜可以是均匀或不均匀的。对于孔径在其表面的分布，半透膜可以是均匀或不均匀的。在一种实施方案中，对于膜表面上空间分布和孔径大小，所述半透膜基本是均匀的。这些半透膜的实例是本领域公知的，其包括但不限于透析膜、滤膜等。在一种实施方案中，膜的形状为管形。在一种实施方案中，膜的形状是袋形。

溶质的渗透性取决于分子形状、其水化程度及其电荷。这些分别受溶剂性质、pH和离子强度影响。通常，分子大小可方便地由分子量表示。具有良好表征的截留分子量的半透膜是本领域公知的，并可以商业获得，其包括上述的透析膜、透析管、和滤膜。为了用于本发明，膜材料通常与组织培养应用相容，并可包括例如由再生纤维素、纤维素酯或聚偏二氟乙烯(PVDF；Spectra/Por，Spectrum Laboratories，Inc.，Rancho Dominguez，CA)所制成的半透膜。PVDF膜和管可高压灭菌并可热封。使用透析膜的典型应用包括去除盐、表面活性剂、去污剂和溶剂；样品溶液的缓冲和pH调节；浓缩蛋白质、肽或抗体；DNA电洗脱；电泳、高压液相色谱(HPLC)之前的蛋白质准备；除去污染源微分子；结合研究；和组织培养提取物的纯化。

半透膜具有明确的截留分子量。商业可得的半透膜包括100道尔顿(0.1kDa)至1,000,000道尔顿(1000kDa)范围的名义截留分子量。透析膜孔径通常表示为膜将保留(防止渗透)90％溶质时的分子量。在一种实施方案中，半透膜孔径表示为至少90％的溶质被膜保留(防止渗透)时的分子量。

在一种实施方案中，半透膜是电中性的，即，其自身基本上不负载净电荷。这样的膜允许溶质分子基于其分子大小通过而无需考虑其电荷。在一种实施方案中，半透膜负载净正电荷。在一种实施方案中，半透膜负载净负电荷。在一种实施方案中，通过将涂层施加于下面的电中性膜而提供净电荷。电荷或涂层可存在于膜的两侧或仅一侧，例如管形膜的内侧。例如，在一种实施方案中，半透膜负载净正电荷且是涂有聚-L-赖氨酸的半透膜。净正电荷起到排斥正电荷溶质的作用，包括那些仅根据大小可穿过膜的溶质。

如本文所用，与可生物降解的无定形载体相接触的体外扩增的细胞群是指包括细胞群的体外组织培养产物，所述细胞群在数目上超过放入培养物中的所述初始细胞群，其中所述细胞与如本文所述的可生物降解的无定形载体相接触。所述可生物降解的无定形载体包括保留在半透膜限定的细胞空间边界内的无定形载体的降解产物。在一种实施方案中，所述与可生物降解的无定形载体相接触的体外扩增的细胞群进一步包括由所述细胞产生并保留在半透膜限定的细胞空间边界内的细胞外基质材料。用于本文的这后一种产物被称为根据本发明方法所产生的细胞/基质组合物。该组织培养产物通常是无定形的，因此其可作为凝胶或粘性液体被引入刚性容器比如注射器或套管针中并通过刚性容器的开口而被挤出。

如本文所用，软骨是指特化的、无血管形式的结缔组织，其包括软骨细胞和包埋在由所述软骨细胞所产生的无定形、凝胶样基质中的细胞外纤维。软骨提供形成长、负重骨的基础以及关节表面的基础。三种主要类型的软骨是透明软骨、弹性软骨和纤维软骨，其中透明软骨最为常见。除了存在于长骨的关节表面外，透明软骨还发现于成年个体的肋骨腹端、气管环和喉中。在组织学上，透明软骨表现为被占主导地位的细胞外透明基质围绕和包裹的分离软骨细胞，透明基质中富含粘多糖(例如，硫酸软骨素)和胶原，尤其是II型胶原。也许因为其无血管的性质，软骨的愈合能力通常受到限制。

已经鉴定了超过19种胶原，其中较好表征了I、II、III和IV型。I型胶原，是最丰富的形式，发现于皮肤、韧带、腱、骨和主动脉中，由两个相同的α1(I)链和一个α1(II)链构成。II型胶原，其形成拱形细纤维，大概占软骨干重的40-50％，由三个相同的α1(II)链构成。III型胶原，其主要发现于大血管比如主动脉中，在皮肤、韧带和腱中的含量较少，由三个相同的α1(III)链构成。非纤维性IV型胶原存在于基底膜中。

如本文所用，关节软骨表面是指覆盖在动关节(可动的、滑膜内衬的)表面的透明软骨层的任何方面。关节表面包括涉及给定关节全部天然运动范围内的关节表面的任何部分。

如本文所用，受损关节软骨表面是指因任何原因引起物理缺陷的任何关节软骨表面。例如，关节软骨表面可以被急性损害，例如由于跌打损伤，或者关节软骨表面可以被慢性损害，例如由于重复性冲击负荷或张力损伤、任何炎症过程，包括痛风和关节炎(例如，骨关节炎)、感染、自身免疫疾病(例如，类风湿性关节炎)、无菌性坏死和镰状细胞贫血。与正常关节软骨表面相比，损害的形式可以是关节软骨表面变薄或破裂，例如这可存在于相应的对侧关节中。正常关节软骨表面可参照任何未患病或未受影响的相应关节软骨表面来定义。在一种实施方案中，受损的关节软骨可以通过影像学观察，包括通过平面X-射线、计算机断层(CT)成像和磁共振成像(MRI)。例如胫股节或其它关节空间变窄的影像学证据通常被认为是关节软骨变薄的信号。

尽管由于方法复杂并且不一致使得数据解释困难，但流体静压对于软骨发生的作用已有报道，比如使用软骨盘对软骨细胞(悬浮或培养)、受限的对不受限的模型、以及施加静压对间歇(周期性)压力。已通过专门设计的仪器在受限和不受限模型中测试了机械刺激对软骨和软骨细胞的作用，综述见Mow VC et al.(1999)Osteoarthritis Cartilage7：41-58和Mizuno S et al.(1998)Mat Sci Eng C 6：301-6。在不受限模型中，软骨的压力负载引起组织变形和流体静压、流体渗出和流动电势(streaming potential)的改变。Maroudas A(1975)Biorheology12：233-48；Comper WD et al.(1993)Biochem J 289：543-7。该模型也可以显著改变细胞形状。Guilak F et al.(1995)J Ortho Res 13：410-21；Guilak F(2000)Biorheology 37：27-44。

体外试验经常使用软骨盘以评价生物物理力对关节代谢的作用。于0-3MPa下静态压迫12小时显示硫酸与脯氨酸掺入之间的相反关系。Gray M et al.(1988)J Ortho Res 6：777-92。流体静压对牛关节软骨片内硫酸和脯氨酸掺入的作用取决于压力的强度和持续时间。Hall A et al.(1991)J Ortho Res 9：1-10。施加生理水平的压力(5-10MPa)20秒或2小时刺激了随后的基质合成，然而持续2小时施加20MPa减少了基质合成。出处同上。然而，对于动态或间歇性压迫的生物合成反应可以是刺激或者抑制，这取决于负荷的频率和强度。Sah RLY et al.(1989)JOrthop Res 7：619-36；Ostendorf RH et al.(1994)J Rheumatol 21：287-92；Palmoski MJ et al.(1984)Arthritis Rheum 27：675-81；Klein-Nulend J etal.(1987)J Biol Chem 262：15490-5；Torzilli PA et al.(1997)J Biomech30：1-9；Buschmann MD et al.(1996)J Cell Sci 109：499-508；Mankin KPet al.(1998)J Pediatr Orthop 18：145-8。

压力诱发的张力和随后的流动电势可以是ECM合成的强刺激因素。Kim Y et al.(1994)Arch Biochem Biophys 311：1-12；Bachrach NM etal.(1998)J Biomech 31：445-51；Kim YJ et al.(1995)J Biomech28：1055-66。但是，当经受高达12MPa的流体静压时，关节软骨的固体基质是不可压缩的。Bachrach NM et al.(1998)J Biomech 31：445-51。此外，流体静压不影响细胞体积。Bushmann等人认为软骨组织变形是较细胞形状变化更强的刺激。Buschmann MD et al.(1995)J Cell Sci108：1497-1508。流体静压影响软骨细胞的转导机理尚不清楚，但已用软骨盘和分离的软骨细胞单层在体外考察了流体静压的某些作用。

已比较了周期性流体静压对培养的软骨细胞以及软骨盘的作用，Parkkinen et al.(1993)Arch.Biochem.Biophys.300：458-65。在经受0.5、0.25或0.05Hz周期性负荷1.5小时的细胞培养中抑制了硫酸掺入，但在经受0.5Hz周期性负荷1.5小时的软骨盘中却刺激了硫酸掺入。经受更长时间负荷(20小时)的牛软骨细胞培养表明在0.05和0.25Hz刺激了硫酸掺入，但在0.0167Hz为抑制作用。出处同上。研究者的结论是细胞/基质相互作用影响了周期性流体静压对细胞功能的作用。

此外，有数据支持代谢刺激与流体流动和/或细胞形状的变化(Guilak F et al.(1995)J Ortho Res 13：410-21；Kim Y et al.(1994)ArchBiochem Biophys 311：1-12；Bachrach NM et al.(1995)J Biomech28：1561-9；Lammi MJ et al.(1994)Biochem J 304：723-30)以及与流动电势的变化(Kim YJ et al.(1995)J Biomech 28：1055-66)相关的观点。通过向室中的溶液浴施加压力，间接施加流体静压(HP)于悬浮在介质浴中的分离软骨细胞。Hall A et al.(1991)J Orthop Res 9：1-10。即使该模型不包含累积的软骨ECM，也易于操控各细胞和HP之间的相互作用。对于分离软骨细胞的研究还表明压力对蛋白聚糖合成和聚集蛋白聚糖mRNA表达的双相作用。Lammi MJ et al.(1994)Biochem J 304：723-30。间歇性暴露于500或1000磅每平方英寸(psi)(5秒加压和15秒不加压，每天4小时，持续长达5周)时，糖胺聚糖(GAG)在三维骨架内的累积高于不施加压力时的情况。Hall A et al.(1991)J Orthop Res 9：1-10。

对于分离软骨细胞的研究还表明蛋白聚糖的合成和聚集蛋白聚糖mRNA的表达取决于压力模型。Lammi MJ et al.(1994)Biochem J304：723-30。根据Smith等人报道，GAG合成不直接依赖于转录和翻译，他们报道10MPa恒压负荷4小时，刺激了高密度单层培养中软骨细胞合成II型胶原和GAG，但对mRNA水平无影响；而间歇性压力使聚集蛋白聚糖mRNA水平提高了31％、使胶原mRNA水平提高了36％。Mueller SM et al.(1999)J Bone Min Res 14：2118-26。

关节软骨由软骨细胞和两种主要的大分子(即，胶原和蛋白聚糖)构成，这两种大分子由软骨细胞合成并沉积在软骨细胞周围。软骨细胞还合成滑液，其浸浴关节软骨。在健康情况下，关节软骨在关节骨端形成光滑表面以减少运动所致的摩擦。该摩擦进一步被滑液降低。软骨关节的结构完整性是髋、膝、肩和肘等骨关节最佳功能的基础。功能受损的骨关节严重降低了运动性并影响正常活动比如从坐姿起立或上下楼梯。

为了维持关节软骨的结构完整性和正常功能，软骨细胞持续合成胶原和蛋白聚糖(它们是关节软骨的主要成分)以及降低摩擦的滑液。大分子和滑液的这种持续合成使得关节软骨对于大多数由骨端间摩擦引起的常规磨损具有修复机制。

2、体外培养方法

本发明在一方面提供体外培养细胞的方法。根据本发明此方面的方法包括下列步骤：使选用于体外培养的细胞群与可生物降解的无定形载体接触，将所述接触的细胞群置于接受细胞的细胞空间内，所述细胞空间至少部分由大于100kDa且可高达1,000kDa截留分子量的半透膜为界限，和周期性施加压力于所述接触的细胞群。本方法较现有的体外培养法具有若干优点，特别是对使用产生ECM的细胞。这些优点包括但不限于增加ECM产生的能力，产生在生物力学性质方面更类似于天然组织的组织的能力，选择性保留高分子量ECM成分，以及防止细胞遭受直接流体剪切力。

根据本发明的体外培养法可用于制备细胞/基质构建体，其可作为可注射糊用于填充并由此修复对象中退化的天然存在的细胞/基质部位，例如受损的软骨组织部位。

组织细胞和/或组织前体细胞可由下列来源直接获得或衍生：供体如患者自身细胞，供体细胞培养物，分离的干细胞，已建立的细胞系。在多种实施方案中，所述供体是小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠、牛、猪、马、山羊、绵羊、狗、猫或人。通过活组织检查，从所述对象或近亲属例如生物学父母或同胞，可获得相同或不同物种的细胞，优选具有相同的免疫学特性。

如果使用可引起免疫反应的细胞，比如来自与接受者相同物种但免疫学不同的供体的细胞，那么接受者需要进行免疫抑制，例如使用皮质类固醇以及其它免疫抑制药物比如环孢霉素的方案。但是，使用自体细胞将避免这样的免疫反应且无需这样的免疫抑制治疗。

细胞可从供体直接获得，洗涤，悬浮于所选水凝胶中，之后递送至细胞培养空间中。可将细胞加入或与水凝胶混合，随后立即注入细胞培养空间。作为替代，可将细胞和无定形载体分别且相继引入细胞培养空间，可以先引入细胞后引入载体，或者反之，条件是细胞和载体都在细胞培养空间内时可被彻底混合。此外，可通过向体外培养基中添加适宜的生长因子或特异或非特异性支持所选细胞类型生长的其它组织培养成分来增强细胞生长。

在用于本发明的体外培养法之前，通过活组织检查所得的细胞任选地可以被收获、培养，然后必要时传代以除去污染的、不需要的细胞。

可以在从供体部位或源无菌切出之后分离软骨细胞，然后用0.2％II型胶原酶(Gibco)和5％胎牛血清(Gibco)在无添加剂的Dulbecco改良Eagle氏培养基(DMEM，Gibco)的溶液中于37℃在有轨摇床上消化长达17小时。然后通过70mm尼龙细胞滤网过滤溶液，于1000rpm离心10分钟。抽吸或倾析上清液后，将沉淀重悬于磷酸盐缓冲液(PBS，Gibco)中，其中PBS中添加有1％青霉素-链霉素(Gibco)和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA，Aldrich)。然后再离心该溶液两次并重悬于PBS中。软骨细胞数目和活力通过台盼蓝排斥法和血球计数器测定。

根据细胞类型、所需新组织的体积和培养的时间量，置于培养中的细胞数目可以不同。在典型应用中，置于培养中的细胞数目由细胞培养空间的体积决定，即，确定为初始或接种细胞密度。例如，置于培养中的细胞数目的典型范围可以是约1×10⁶至1×10⁹细胞/ml，更典型的范围是约1×10⁷至1×10⁸细胞/ml。随着细胞在培养中生长和分裂，总细胞密度将相应增加。

在一种实施方案中，所述细胞包括软骨细胞以及任选地其前体细胞。例如，在适当条件下，成纤维细胞可分化成软骨细胞；成纤维细胞由此可被认为是软骨细胞前体细胞。其它细胞也可以是软骨细胞前体细胞，包括间充质干细胞。

在一种实施方案中，所有的或基本上所有的细胞均是软骨细胞。所存在细胞的类型可通过任何合适的方法评价，例如包括组织学检查、细胞表面蛋白分析、生化或其它ECM表征、荧光激活细胞分选(FACS)、核转录分析、酶联免疫荧光检测(ELISA)、蛋白质印迹、免疫组织化学、电子显微镜、逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)分析、以及本领域技术人员已知的其它方法。

所述可生物降解的无定形载体是任何合适的天然或合成材料，其是生物相容的且在数周至数月时间内基本上完全生物降解。在一种实施方案中，所述无定形载体包括I型胶原，例如作为I型胶原在培养基或其它生理可接受流体中的0.3％溶液(w/v)。可购得多种形式的I型胶原。在用于本发明方法之前，可使用涉及溶剂交换的标准技术，使I型胶原与不需要的盐、防腐剂或其它试剂相分离。这样的技术例如可包括离心、超滤、透析等。

在某些实施方案中，所述可生物降解的无定形载体是或包括葡聚糖珠。在多种实施方案中，所述可生物降解的无定形载体包括选自葡聚糖、硫酸软骨素、聚乙二醇、透明质酸及其任何组合的水凝胶。可基于其分子量选择它们，从而适用于如本文所述的特定截留分子量的半透膜。更具体地，选择所述可生物降解的无定形载体的起始分子量，使得其基本上保留在被半透膜限定的细胞培养空间内。虽然较大分子量形式的可生物降解的无定形载体将不会渗透过膜，但是所述可生物降解的无定形载体的较小分子量的降解产物(当它们形成时)将渗透过膜并由此退出细胞培养空间而消失在培养基中。

在某些实施方案中，所述接受细胞的细胞培养空间是半透膜管或袋，例如透析管，其具有用于接受细胞和载体的可闭合开口。将所述细胞和载体引入细胞培养空间后，通过任何合适的方法封闭所述可闭合开口，使得全部所得结构(即，包含细胞和载体的封闭的半透膜管或袋)浸入合适的培养基中或者与其相接触。

选择所述半透膜的截留分子量(MWCO)大小，以保留细胞、ECM和可生物降解的无定形载体的高分子量成分，同时允许与培养基交换低分子量的载体降解产物、营养物、废弃物和气体。当然，低分子量的载体降解产物、营养物、废弃物和气体通常将沿着它们的浓度梯度流动，使得例如所述载体的低分子量降解产物退出细胞培养空间。理想地，膜的MWCO大小的选择是基于载体的初始分子量和生物降解动力学的知识。例如，相对快速降解的载体最好可以与具有较小MWCO的半透膜一起使用，而相对缓慢降解的载体则使用较大的MWCO，使得高分子量载体的清除动力学和高分子量ECM的产生是相似的。使用下面实施例所述的技术，无需过度试验即可选择MWCO。

由此，在一种实施方案中，所述半透膜具有至少200kDa的MWCO。在一种实施方案中，所述半透膜具有至少250kDa的MWCO。在一种实施方案中，所述半透膜具有至少300kDa的MWCO。在一种实施方案中，所述半透膜具有至少400kDa的MWCO。在一种实施方案中，所述半透膜具有至少500kDa的MWCO。在一种实施方案中，所述半透膜具有至少600kDa的MWCO。在一种实施方案中，所述半透膜具有至少700kDa的MWCO。在一种实施方案中，所述半透膜具有至少800kDa的MWCO。在一种实施方案中，所述半透膜具有至少900kDa的MWCO。在一种实施方案中，所述半透膜具有1,000kDa的MWCO。

在一些实施方案中，可以处理半透膜以携带净正或负电荷，由此影响适当大小带相似电性或相反电性的溶质穿过膜的通量。在一种实施方案中，所述半透膜带净正电荷。在一种实施方案中，所述半透膜涂有阳离子或聚阳离子比如聚-L-赖氨酸。对于透析管来说，这样的涂层可通过简单地将膜浸入聚-L-赖氨酸溶液中而方便地实现。

在其它情况下，大分子比如白蛋白基本上从蛋白聚糖聚集体被排除。Ogston AG et al.(1973)Proc R Soc Lond A 333：297-316。已报道了在关节软骨盘内周期性负载2.8MPa显著增强了白蛋白的转运。O′Hara BPet al.(1989)Ann Rheum Dis 49：536-9。一旦软骨细胞累积细胞周围的ECM，所述ECM可物理性阻止可溶因子与细胞表面受体相结合。OgstonAG et al.(1973)Proc R Soc Lond A 333：297-316。因此，预期细胞周围基质的累积将随时间推移而削弱培养物中丝裂原的利用度，流体静压可辅助所需调节因子的转运。

与其它大分子相比，蛋白聚糖(主要的软骨ECM成分)具有高渗透压。蛋白聚糖聚集体(聚集蛋白聚糖aggrecan)具有大量固定的-COO^-和-SO^3-阴离子，它们与游离的阳离子比如Na⁺和Ca²⁺相互作用。随着更多蛋白聚糖积累，渗透压将增加。而且，渗透压的增加导致围绕细胞的蛋白聚糖的溶胀张力。随着袋内侧和外侧(灌注介质相)之间的渗透物梯度产生了渗透压。预期这些压力的平衡将影响组织形态发生和组织发生。

通过半透膜，添加大量ECM成分比如硫酸软骨素和硫酸葡聚糖(具有确定的分子量)将改变介质中的渗透压。外部施加的流体静压和内部产生的渗透压可改变溶质的传质。在流体静压和渗透压之间的平衡中需要考虑围绕软骨细胞的ECM的影响。人股骨头表面和钙化区的原位渗透压分别为310-370mOsm和370-480mOsm。天然软骨的ECM渗透压高于常规培养基的渗透压。通过加入硫酸软骨素或葡聚糖可改变培养基中的渗透压。

所述体外培养方法包括向所述培养细胞群施加压力。所施加的压力通常为流体静压，其可通过膜传递，其水平为约0.5-约5MPa。本发明也包括生理水平的压力，其可以在5-10MPa范围。尽管在静态培养条件(即环境大气压)下载体中软骨细胞的增殖非常小，向载体中软骨细胞施加流体静压导致提高了细胞增殖和细胞产生ECM。在一种实施方案中，施加的压力为0.001-1Hz的0.5-3.5MPa流体静压。

3、培养装置

用于实践本发明体外培养方法的仪器描述于美国专利No.6,432,713中，其全部内容在此引入作为参考。简言之，如美国专利No.6,432,713中所公开的，根据本发明培养细胞或组织的仪器，其特征为包括培养单元(培养回路单元)，其具有其中含有细胞或组织并供应培养基的培养室，用于向所述培养室内的所述细胞或组织施加压力的压力施加装置(压力施加仪器)，以及用于间歇或连续向所述培养单元供应所述培养基的培养基供应装置(培养基供应仪器)。

也就是说，所述培养单元容纳用于待在所述培养室中培养的细胞或组织从而供应与开放环境相分离的细胞或组织所需的培养基。避免与开放环境相分离的细胞或组织被细菌等污染，并由此生长成优异质量的组织。除了由液压和培养基流动引起的物理刺激之外，将由压力施加装置的期望压力施加于所述细胞或组织。结果，其影响代谢功能、细胞分裂周期、浓度梯度或活体刺激的分散，从而增强培养。向细胞或组织供应培养基的模式是由培养基供应装置任意设置的，并且培养基可间歇或连续地供应至细胞或组织从而通过多种物理刺激增强培养。培养基的供应模式包括在所有时间供应新培养基或通过重复循环培养基来供应培养基中的一种或两种。在循环培养基的模式中可节省培养基，但当单向供应培养基时具有防止培养基浓度变化的优点。

在一种实施方案中，根据本发明培养细胞或组织的仪器的特征在于进一步提供控制压力施加装置或培养基供应装置的控制装置。也即，尽管压力施加装置或培养基供应装置可被任意控制，可使用控制装置如计算机来实施多种控制比如反馈控制或前馈控制以及程序控制等。无需说通过中断增加个人收集控制，且不排除所述收集控制。

在一种实施方案中，根据本发明培养细胞或组织的仪器的特征在于从所述压力施加装置施加于所述细胞或组织的压力可根据所述细胞或组织而任意设定。施加压力的方式，即压力模式，相应于所培养的细胞或组织而设定，由此进行高效培养。

在一种实施方案中，根据本发明培养细胞或组织的仪器的特征在于从所述压力施加装置施加于所述细胞或组织的压力是间歇性变化的压力、每隔一定时间重复的压力或每隔一定时间升高或降低的压力。也就是说，压力模式可以考虑所有模式，由此通过选择压力模式的方式而高效培养细胞或组织。

在一种实施方案中，根据本发明培养细胞或组织的仪器的特征在于所述培养单元与所述培养仪器本体相独立和相分离。也即，所述具有在其中容纳培养细胞或组织的培养室的培养单元可与所述培养仪器本体相独立和相分离，使得所述细胞或组织可以与培养单元一起移动，所述培养单元与开放环境相隔离从而防止细胞或组织在移动期间被细菌污染。

在一种实施方案中，根据本发明培养细胞或组织的仪器的特征在于所述培养单元被容纳在密闭空间内从而与开放环境相隔离。也即，由于所述密闭空间是所述培养空间，并且其与开放环境相隔离，可以通过供应所需气体设定培养环境从而防止细胞或组织被开放环境污染。

在一种实施方案中，根据本发明培养细胞或组织的仪器的特征在于所述培养仪器进一步包括可吸收氮气、氧气、二氧化碳气的气体吸收装置。也即，氮气、氧气或二氧化碳气之任一种或组合可被供应至容纳在所述密闭空间内的培养单元，并且将该气体吸收装置提供在所述培养单元中从而将气体施用于细胞或组织，并且可以通过供应和控制气体来模拟活体环境。

在一种实施方案中，根据本发明培养细胞或组织的仪器的特征在于所述密封空间充满氮气、氧气、二氧化碳气。也即，当将氮气、氧气、二氧化碳气充入由所述密闭空间形成的培养空间时，就可模拟活体环境。

在一种实施方案中，根据本发明培养细胞或组织的仪器的特征在于进一步包括用于储存向培养单元供应的培养基的培养基罐。也即，需要培养基供应源从而为培养单元供应或循环必要的培养基，并且所述培养基罐是供应源。具体来说，如果将所述培养基罐安装在与开放环境相隔离的密闭空间中，可以防止保留在培养单元内的培养基被污染。

在一种实施方案中，根据本发明培养细胞或组织的仪器的特征在于所述培养室包括用于接受外部压力的压力传递膜。也即，可以将压力施加刺激施加于容纳在培养室内的细胞或组织，其中该培养室处于与开放环境相隔离的状态，并且可以实现所需的压力施加刺激，比如通过提供所述压力传递膜模拟活体环境刺激。

在一种实施方案中，根据本发明培养细胞或组织的仪器的特征在于所述培养室包括压力缓冲装置。也即，可以实现类似于活体环境的物理刺激并可以在培养单元的一部分被加压时通过由压力缓冲装置调节压力而增强细胞或组织的培养。

在一种实施方案中，根据本发明培养细胞或组织的仪器的特征在于所述仪器进一步包括通过压力传递膜的方式固定于所述培养室的压力室，通过施加作用于培养室内细胞或组织的水压、油压或气压从而将压力施加于培养室内的细胞或组织。也即，可以实现期望的压力施加刺激并通过施加水压、油压或气压作为压力形成手段高度精确地模拟活体环境。

在一种实施方案中，根据本发明培养细胞或组织的仪器的特征在于所述培养基供应装置包括提供于所述培养单元内的培养基供应室以及培养基供应单元，该培养基供应单元用于向在培养基供应室内提取的培养基加压并供应所述加压培养基。也即，所述培养基供应装置是在培养单元内供应和循环培养基的装置，其由多种类型构成，例如，如果其由所述培养基室和培养基供应单元构成，其中该培养基提供单元用于向在培养基供应室内提取的培养基加压，则可以控制施加压力的量以设定供应培养基的期望量。

在一种实施方案中，根据本发明培养细胞或组织的仪器的特征在于在培养中提供减压阀，并且当培养基的压力超过对减压阀所任意设定的给定压力时，所述减压阀开放从而降低培养基的压力。也即，对于向所述细胞或组织施加理想的压力施加刺激而言，缓冲施加于培养物的压力是重要的。如果将所述减压阀用作一种装置，并且当培养基的压力超过任意设定的减压阀压力时该阀将开启以降低压力，则所述培养基控制于理想的压力状态而不污染培养基。

在一种实施方案中，根据本发明培养细胞或组织的仪器的特征在于在所述密闭空间内提供加热装置或加湿装置并将该密闭空间保持且控制在期望的温度或湿度。也即，通过控制容纳培养单元的密闭空间的温度和湿度可提供与活体环境一致的培养空间。

在一种实施方案中，根据本发明培养细胞或组织的仪器的特征在于用于向培养单元的培养室内施加超声波等声波的声波产生单元。也即，通过一起使用所述声波产生单元可在声音上模拟活体环境，因为活体接受外部的声音刺激，并且可以通过高度可靠地一起使用超声波而在培养室中注射待培养的细胞或组织。

在一种实施方案中，根据本发明培养细胞或组织的仪器的特征在于所述仪器进一步包括用于控制供应给所述密闭空间的气体浓度的控制装置。也即，可以通过所述控制装置控制供应至密闭空间的气体浓度来模拟活体环境从而增强细胞或组织的培养。

4、组合物

本发明在某些方面提供根据本发明的体外培养方法所产生的组合物。这些组合物通常包括在体外扩增的细胞群，其与可生物降解的无定形载体相接触并包含在至少部分以半透膜为界的细胞空间内。本发明的组合物可用于本发明的临床方法中，例如用于治疗对象中的受损组织。

在一方面中，本发明提供一种组合物，其包括与可生物降解的无定形载体相接触的体外扩增的细胞群。在一种实施方案中，所述细胞群包括软骨细胞和任选地其前体细胞。在一种实施方案中，所述细胞基本由软骨细胞构成。所述可生物降解的无定形载体可以如本文前述那样，包括但不限于I型胶原、葡聚糖珠、葡聚糖、硫酸软骨素、PEG、透明质酸或其任意组合。除前述外，根据本发明这些方面的可生物降解的无定形载体包括剩余的高分子量材料，其衍生于在体外培养中任意点与所述细胞群相接触的可生物降解的无定形载体材料。在典型的实施方案中，根据本发明此方面的剩余可生物降解的无定形载体包括剩余的高分子量物质，其衍生于在体外培养开始时与所述细胞群相接触的可生物降解的无定形载体材料。例如，所述细胞群可在培养中维持几天至几周，典型地为一周至六周，更典型为三至六周，最典型为三至四周，在此期间所述可生物降解的无定形载体可被降解至显著程度，可高达约100％但不包括100％。在一种实施方案中，所述可生物降解的无定形载体是I型胶原。

在一方面，本发明提供根据本发明体外培养方法所产生的细胞/基质组合物。在根据本发明此方面的一种实施方案中，软骨细胞群，有或没有软骨细胞前体细胞，如所述方法培养而产生体外扩增的软骨细胞群加上由所述软骨细胞所产生的高分子量细胞外基质材料，以及剩余可生物降解的无定形载体，其中任选地所述细胞、基质材料和载体包含于接受细胞的细胞空间内，其中所述细胞空间全部或部分被具有大于100kDa截留分子量的半透膜限制。在多种实施方案中，所述半透膜的截留分子量范围选自大于100kDa-1,000kDa、200kDa-1,000kDa、250kDa-1,000kDa、500kDa-1,000kDa、和1,000kDa。根据本发明此方面的可生物降解的无定形载体如上所述，并可包括但不限于I型胶原、葡聚糖珠、葡聚糖、硫酸软骨素、PEG、透明质酸、及其高分子量降解产物中任一种或其组合。在一个实施方案中，所述可生物降解的无定形载体是I型胶原。可将所述细胞群维持在培养中几天至几周的时间，典型地为一周至六周，更典型是三至六周，最典型为三至四周。

当所述细胞/基质产物包括由半透膜限定的细胞空间，该半透膜提供转运根据本发明体外培养方法所产生的细胞及它们所产生细胞基质的方便的包装形式。例如，当细胞空间是半透膜制成的管形(例如，透析管)时，所述含细胞/基质物的管可作为单元被转运至临床应用位点。此外，这种包含在管状半透膜内的细胞/基质材料可以容易地从所述管中取出，例如通过开口或切除管末端并将封闭的细胞/基质材料经由开口端挤出管而方便地移出，如同从牙膏管内挤出牙膏。

5、临床方法

本发明还提供用于治疗对象中受损软骨性组织的方法。该方法包括用于治疗患者中受损关节软骨表面的方法。在一般意义上，该方法涉及将有效量的本发明细胞/基质组合物引入受损软骨性组织部位或受损关节软骨表面，其中所引入的细胞/基质材料是活的并作为活移植物驻留从而替换受损组织，由此治疗所述受损组织。因为本发明的细胞/基质组合物不同于其中具有骨架结构的组合物，没有其自身的内在三维形状，其可作为可挤出产物被引入组织空间内，这易于与由其所填充的组织缺陷所确定的形状相一致。

在一方面，本发明提供治疗受损软骨性组织的方法。根据本发明此方面的方法涉及将有效量的本发明软骨细胞/基质组合物引入受损软骨性组织部位以治疗所述受损软骨性组织。可以使用适于此目的的任何方法将所述细胞/基质组合物引入所述部位。在一种实施方案中，将所述细胞/基质组合物挤入受损软骨性组织部位中，例如使用注射器、插管或套针。在一种实施方案中，可作为开放手术的一部分将所述细胞/基质组合物引入所述部位。在一种实施方案中，可作为所谓的微创手术的一部分将所述细胞/基质组合物引入所述部位，如关节镜手术。

在一种实施方案中，该方法是用于治疗受损椎间盘的方法。椎间盘作为构成脊柱的相邻椎体之间的半弹性缓冲垫起作用。总体而言，椎间盘占人椎柱长度的四分之一。每个盘由中心部分、髓核以及外周部分、纤维环组成。年轻成人的半流体髓核包含大量水和少量软骨细胞，随着年龄增长，水含量降低并被纤维软骨替代。纤维环由纤维软骨构成，其通常保留内部髓核并防止后者脱出。受损的椎间盘是常见的并与急性或慢性背痛、坐骨神经痛、肌肉无力、足下垂、麻痹、截瘫、膀胱潴留、以及医学领域技术人员所熟悉的其它症状相关。

本发明在一方面提供治疗受损关节软骨表面的方法。根据本发明此方面的方法涉及以下步骤：向由受损关节软骨表面部位之上的表面区软骨和受损关节软骨表面部位之下的软骨或软骨下骨所限定的空间引入有效量的本发明软骨细胞/基质组合物，从而治疗受损的关节软骨表面。根据本发明已发现，当关节软骨表面的缺陷填充可生物降解的聚合物如纤维蛋白胶时，一薄层的新软骨细胞生长并铺展至胶的表面。形成该表面区软骨的同时，纤维蛋白胶被降解，使得随时间推移所述胶被重吸收，仅留下了所述薄表面区软骨覆盖表面缺陷的原始部位。先前由所述胶所占据的空间可作为引入根据本发明方法的新软骨的部位。可以将根据本发明体外培养方法在体外扩增的软骨细胞引入所述表面区软骨下面。所述表面区软骨帮助将在体外扩增的软骨细胞/基质组合物保留在位置上，同时将细胞整合入周围的软骨性环境。

在一种实施方案中，软骨细胞来源于待治疗对象的组织。例如，在准备所述部位时可从受损关节表面部位收获细胞，包括清创所述部位和向缺陷部位引入纤维蛋白胶。然后如前所述在体外扩增对象自身的细胞，同时纤维蛋白胶在原位降解，然后在所述细胞/基质组合物经适当扩增或成熟时将其返回至对象中。引入所述细胞/基质组合物时纤维蛋白胶的降解程度可以但不必是完全的，因为预期在引入所述活细胞/基质组合物后将继续降解。

在一种实施方案中，软骨细胞来源于待治疗对象以外的供体组织。所述供体可以是同种的或异种的。例如，可以从尸体或活供体的关节软骨表面收获细胞。然后如前所述在体外扩增供体细胞，然后当所述细胞/基质组合物经适当扩增或成熟时将其施用于对象。

在一种实施方案中，向所述空间内引入所述细胞/基质组合物的步骤作为关节镜或微创手术的一部分而进行，从而治疗受损的关节软骨表面。在一种实施方案中，引入所述细胞/基质组合物的步骤作为在超声或其它合适成像导引下的封闭手术来实施。在一种实施方案中，封闭手术可包括经皮注射入期望部位。

上述方法可用于治疗对象中任何的很多关节，包括但不限于选自膝、髋、肩、肘、腕/手(腕骨间、腕掌间、掌骨间、掌指间、指节间)、踝/足(跗骨间、跗跖间、跖骨间、跖趾间、趾节间)和颞下颌的关节。在一种实施方案中，受损的关节表面是受损的膝关节表面。在一种实施方案中，受损的关节表面是受损的髋关节表面。

在一方面中，本发明提供治疗对象中骨关节炎的方法。根据本发明此方面的方法包括下列步骤：在患骨关节炎的对象中，将有效量的本发明软骨细胞/基质组合物引入由受损关节软骨表面部位之上的表面区软骨和受损关节软骨表面部位之下的软骨下骨所限定的空间，从而治疗所述骨关节炎。在一种实施方案中，受损的关节表面是受损的膝关节表面。在一种实施方案中，受损的关节表面是受损的髋关节表面。

本发明通过下面的实施例进一步举例说明，这些实施例不应理解为进一步的限制。

实施例

                         实施例1

                    培养细胞或组织的仪器

适用于本发明体外培养方法的流体静压/灌注培养系统(生物反应器)描述于附图1中，在美国专利No.6,432,713中也有描述，其全部内容在此引入作为参考。使用半透膜待用于在可生物降解的无定形载体中培养细胞描述于附图2的示意图中。将包含细胞和可生物降解的无定形载体的所述半透膜袋置于培养室内，其保持水平并维持37℃培养1-6周或更久。

                        实施例2

评价在体外施加流体静压后半透膜袋内的分子标记物与可生物降解聚

                       合物的传质

在静态培养条件以及在不同的流体强度和周期性流体压力下进行试验以评价无定形细胞载体中的分子标记物通过半透膜的传质。软骨ECM具有高分子量并将保持在半透膜袋内。降解的细胞载体碎片(小分子)和代谢废物将被排出到介质相中。在静态条件下，营养物可根据Fick定律渗透进袋内。此外，用生物反应器根据确定的流体静压、介质流速和受控的氧气/二氧化碳浓度来操作传质。作为传质模型，使用分子量标记物来评价在一系列试验条件下的传质(表1)：0.3％中和的I型胶原(Vitrogen，Cohesion)、PEG(Coseal，Baxter)、和补充的透明质酸(Smith &Nephew)作为在确定截留分子量(MWCO)大小半透膜袋内的可能的细胞载体而被评价。将至少70kDa、250kDa和500kDa荧光FITC-或罗丹明-葡聚糖(Sigma)的分子量标记物加入载体中。由于硫酸-GAG(S-GAG)带高度负电，使用FITC-葡聚糖(酸性pI)标记物模拟带电分子。将所述标记物/载体注入半透膜袋(1mm内径，1.2mm外径，10mm长)中。热封该袋，在静态条件(即环境压力)或施加流体静压下培养。于1、3、12、24、48和74小时收获各袋。然后从袋中分离样品(标记物/载体材料)。测量样品的荧光强度和体积。作为替代，所述膜用聚-L-赖氨酸涂敷以增加膜的正电荷。这可改变俘获带负电荷的软骨ECM的效率。

表1.实验条件和评价方法

计算各培养条件下分子量标记物的动力学以得出各种分子量的传质系数。膜的电荷修饰影响了具有特定电荷修饰的传质。

                    实施例3

流体静压对半透膜袋中传质和无定形细胞载体降解的作用

在确定的细胞培养条件下使用组织培养系统测试可生物降解的无定形聚合物(水凝胶或溶胶/凝胶可逆聚合物)。使用半透膜袋保持所述细胞构建体和软骨细胞所产生的大分子量的细胞外基质产物。在0-5MPa和0-0.5Hz流体静压(HFP)下根据100-500kDa的截留分子量大小分析袋的性能。将测试载体注入袋中，并评价其降解动力学。使用100-500kDa范围的荧光分子示踪剂(例如，葡聚糖-FITC)作为标记物。使用适当选定的荧光激发和检测波长经荧光计测量荧光强度。根据初步研究，观察到500kDa的葡聚糖-FITC不渗入天然软骨内(附图3)。因此，＜500kDa分子量的标记物适用于该试验。

初步数据表明交联葡聚糖珠形的聚合物在普通培养皿中于10天后溶解。尽管人关节软骨细胞不粘附于这些珠的表面，然而这些珠并未表现出细胞毒性。

                        实施例4

流体静压对半透膜袋中髓核细胞(Nucleus Pulposus Cells)和软骨细胞的

                细胞增殖和ECM产生的作用

使用兔髓核(NP)-来源的细胞和丢弃的人椎间盘(hIVD)组织进行细胞试验。新杀死的二至四周龄兔购自当地屠宰场(USDA授权)。从腰椎IVD获得NP和纤维环(AF)。NP-和AF-来源细胞经酶促作用分离。将分离的NP和AF细胞接种于常规培养皿中以扩增细胞数量。尽可能少传代数以维持所有组织的表型。

传代2-3次后，将细胞接种于半透膜(MWCO大小：100kDa、250kDa或500kDa)袋中并在流体静压(HFP)强度、灌注速率和气体浓度的确定条件下培养，并使用美国专利No.6,432,713中描述的当前水平的组织工程处理器(附图1)。测试这些变化条件以最大化软骨细胞表型。根据初步数据，HFP强度、周期频率和介质(培养基)流速在0-3MPa、0-0.5Hz和0.01-1.0ml/min的生理相关范围变化。介质流速的变化取决于营养物和气体传质的最佳水平。参考初步数据，将培养时间设置为2天至21天。使用生化评价确定最佳时间点和接种密度。

在最佳培养条件下使用与使用分离的兔NP-源细胞和AF-源细胞而确定的相同培养系统测试丢弃的人组织。作为已验证对照，将细胞接种于胶原凝胶/海绵构建体中或者与小量胶原凝胶一起接种于所述袋中。这些方法是使用HFP处理促进软骨发生的标准操作。为了维持任何进一步评价的质量可靠性，在培养皿中培养细胞构建体1周。

IVD重构的细胞源是重要的，因为完整的自体NP很难从患者获得。患者的关节软骨是作为IVD重构细胞源的一个选择。

根据初步数据，表明所丢弃的突出组织是纤维化的并需要酶促消化以分离细胞。将人IVD细胞接种于培养皿中并培养约1-2周。将粘附的IVD细胞接种于半透袋中，并在通过用兔IVD-源细胞所确定的最佳条件下培养。根据初步数据，表明外源胶原基质(凝胶)被降解。所分离的细胞可包含成纤维细胞或去分化的软骨细胞。基质金属蛋白酶(MMP)的活性通过组织学和生化学方法进行评价。任选地加入补充物比如抗坏血酸以防止细胞外基质(ECM)降解。还可测试防止ECM降解的其它可能的补充物。

软骨基质产生和细胞性质通过组织学和ELISA生化学进行评价。来自培养物的ECM累积经1，9-二甲基甲撑蓝(DMB)测验总S-GAG而测量。II型胶原、聚集蛋白聚糖和连接蛋白经蛋白质印迹法测量。广泛的分子评价包括聚集蛋白聚糖和II型胶原mRNA表达从而确定所述软骨细胞的表型。细胞数目(DNA浓度)和细胞性质经Hoechst荧光染色和增殖细胞核抗原(PCNA)测试以及荧光细胞毒性测试进行评价。从流体静压/灌注培养获得细胞，用抗PCNA单克隆抗体固定并染色涂布的细胞。

组织学.样品经2％多聚甲醛的0.1M二甲胂酸盐缓冲液(pH7.4)在4℃固定24h，并包埋在甲基丙烯酸乙二醇酯(JB-4，Polysciences，Warrington，PA)或石蜡中。JB-4-包埋样品的切片(20μm)在pH 4下经0.2％甲苯胺蓝O(Fisher，Franklin，NJ)染色。

ELISA.对于基质成分的生化学测量，使用手术刀将冷冻海绵切成1-mm³块。8个复制样品的每一个于4℃在1ml的4M盐酸胍、10mMEDTA(pH 5.8)以及蛋白酶抑制剂(0.1Mε-氨基己酸和0.005M盐酸苯甲脒)中提取48h。于3,000xg离心5分钟后，上清液经3x体积1.3％乙酸钾的无水乙醇于-20℃沉淀2小时，于14,000xg离心20分钟分离沉淀。重复乙醇沉淀两次，最终的沉淀用于测量蛋白聚糖。蛋白聚糖在海绵内的累积用ELISA评价，其中使用抗-硫酸角质素、抗-软骨素4-硫酸和抗-软骨素单克隆抗体。将乙醇沉淀物溶解于碳酸缓冲液(35mMNaHCO₃，18mM Na₂CO₃，pH9.8)，以相同的方式再沉淀。对样品稀释液进行免疫化学分析。来自牛鼻软骨的蛋白聚糖单体(ICN Biomedicals)用作标准品。将50微升每种样品或标准品包被于96孔板中于4℃过夜，漂洗，于37℃经50μl的0.1单位/ml不含蛋白酶的软骨素酶ABC(Seikagaku America，Falmouth，MA)在0.1M Tris-HCl和0.03M乙酸钠的溶液(pH8.0)中消化1小时。各孔经200μl封闭溶液(BLOTTO，Pierce，Rockford，IL)处理。经软骨素酶ABC消化后，抗软骨素Di-4硫酸蛋白聚糖的抗体(克隆；2-B-6，Seikagaku America)以在PBS(pH 7.4)中1∶3000稀释使用，并在室温孵育2小时。第二抗体，羊抗鼠IgG+IgM-生物素缀合物(Pierce)，以在PBS中1∶20,000稀释液使用并孵育1小时。为了增强，将磷酸酶-链亲合素缀合物(GIBCO/BRL Laboratory)以在PBS中1∶1000稀释液加入，维持1h。在两步之间，各孔经0.05％Tween20-PBS漂洗。各孔与100μl 4mg/ml磷酸对硝基苯酯(GIBCO/BRLLaboratory)在含22mM碳酸钠、28mM碳酸氢钠和1mM MgCl₂的缓冲液(pH9.8)中一起孵育1小时。通过加入100μl 1N NaOH终止各反应。使用微量滴定板读板器(Bio-Rad，Cambridge，MA)于405nm测量光密度。

蛋白质印迹.对于基质成分的生化测量，使用活塞式匀浆器于4℃匀浆5秒。将匀浆物置于冰上15分钟然后于3,000rpm于4℃离心5分钟。八个复制样品分别在1m1 4M盐酸胍、10mM EDTA(pH5.8)和蛋白酶抑制剂(0.1Mε-氨基己酸和0.005M盐酸苯甲脒)中在4℃提取48小时。Mizuno S et al.(1996)Exp Cell Res 227：89-97。于3,000xg离心5分钟后，上清液经3x体积1.3％乙酸钾的无水乙醇于-20℃沉淀2小时，于14,000xg离心20分钟分离沉淀。重复乙醇沉淀两次，最终的沉淀用于测量蛋白聚糖。蛋白聚糖在凝胶内的累积用抗-软骨素4-硫酸单克隆抗体进行评价。

取每种样品(20μl)进行SDS-PAGE凝胶(Invitrogen)电泳。于150mV电泳后，于25mV进行45分钟将各凝胶转移至PVLA膜(Pharmacia)。该膜用含5％脱脂干奶的Tween-20 PBS封闭，室温过夜。该膜在第一抗体中于4℃孵育过夜。该膜用Tween 20-PBS洗涤3次，每次5分钟。对于化学发光检测，将蛋白印迹的蛋白侧向上置于聚偏二氯乙烯膜上，根据制造商说明将检测试剂(ECL plus Western blotting detection system，Amersham，Buckinghamshire，England)施加至印迹膜。将一张放射底片(Heyperfilm ECL，Amersham)置于用聚偏二氯乙烯膜包裹的膜之上，接触1分钟，并显影。

使用胶原凝胶/海绵的猪关节软骨细胞所得的初步数据表明施用HFP后的静态培养条件较单独HFP促进了更多的S-GAG累积。HFP具有刺激软骨细胞特异性代谢功能的潜力，例如，产生高度硫酸化的硫酸软骨素。同时，也需要考虑所述细胞构建体的细胞和材料性质作为增殖和新累积ECM的结果。这些生物学改变(生长)影响所述构建体的材料性质，例如，营养物和气体的渗透性。静态培养条件促进ECM和包埋细胞的稳定化。接种细胞时，所述半透膜袋在细胞/载体和介质相之间起分配作用。由此，在培养初期就出现ECM累积。随着其产生，在所述构建体表面可见多数已增殖细胞(PCNA-阳性细胞)。使用半透膜袋，在细胞/构建体基底和介质流之间没有界面。

细胞增殖可能需要细胞附着于基底。此时，任选加入纤维化胶原片段以补充无定形载体。如果细胞粘附于基底是必要的，基底任选用精氨酸-甘氨酸-抗坏血酸(RGD)-肽(Integra，CA)或其它粘附分子包被。

增殖和软骨发生表型经最佳HFP算法刺激，其设计使用软骨-特异性ECM的标记物。

                        实施例5

在预选流体静压强度下半透膜内无定形载体中软骨发生活性的评价和

                  流体静压算法的确定

本实施例检查在预选流体静压强度下半透膜内无定形载体中的软骨发生活性(细胞活力、增殖、表型)并测定流体静压的算法。新合成ECM(主要是软骨细胞-特异性蛋白聚糖、或聚集蛋白聚糖)的分子量是2-3×10³kDa。II型胶原纤维的长度为500nm。ECM维持在半透膜袋中。软骨细胞包埋在新合成的ECM中，并且选择载体材料使之可被高效保留在袋中(根据实施例2确定的截留大小)。通过操作物理刺激(流体静压及其与静态条件的算法；介质流速)，改变了细胞活性(细胞活力、增殖以及表型表达)。在最适物理刺激下，软骨细胞开始了体外和全新的再生过程。本实施例使用前述生物学标记物确定最佳培养条件。

初步的组织学结果表明密封在所述膜内的胶原凝胶载体中均匀的细胞分布和致密的ECM累积。表1中表示了一系列物理刺激和算法以及定量评价方法。在恒定0、0.7或3.5Mpa下或在0.5Hz周期性0.7或3.5Mpa下施加流体静压。接种后1、3、7和14天收获袋培养物。除了无定形载体外，掺入的透明质酸(800-1200kDa)可用作聚集蛋白聚糖的结合位点直至可得到新合成的透明质酸。组织学和生化学测试方法(表1)基本上如前所述。

初步数据表明施加流体静压刺激了细胞增殖和II型胶原的合成。静态培养期(即环境压力)有助于S-GAG的累积。目标算法对于S-GAG累积使用静态培养模式和对于增殖使用流体静压模式。

                      实施例6

在半透膜袋中培养和使用物理刺激操作下可注射软骨细胞/基质的发育

使用下列无定形细胞载体测试核心方法：0.3％胶原凝胶(Cohesion)、PEG基-止血剂(COSEAL^TM，Baxter)和1.2％藻酸钙凝胶(Inotech)。将牛关节软骨细胞与载体一起悬浮并加入半透膜袋中(PVDF，1mm内径，1.2mm外径，MWCO大小：500kDa)。在静态(环境)压力，在0.7MPa0.1Hz周期性流体静压4小时后静歇20小时，或者在0.7MPa恒定流体静压4小时后静歇20小时，培养袋中的细胞/凝胶载体1周。培养的牛关节软骨细胞产生S-GAG并在胶原和海藻酸凝胶中累积基质(附图4)。

在静态、周期性和恒定流体静压条件下，细胞形状和几何学方面观察到显著差异(附图5)。在静态培养条件下，主要是异染性ECM累积，但填充的胶原凝胶收缩。在周期性流体静压下，纤维样ECM累积。在恒定流体静压下，细胞具有腔隙-样形状(箭头)并且周围有异染性ECM和放射纤维-样累积。

                        实施例7

                   半透膜袋的电荷修饰

在实施例3中的初步结果表明分子示踪剂向天然关节软骨的渗透受到了限制。该渗透取决于荧光标记物的pI和纵向组织形态学。这些数据表明可以控制细胞外基质(ECM)的累积。如果软骨细胞成功地产生高度硫酸化的ECM，该ECM将在袋内累积。电荷修饰可用于控制选择性分子渗透性。例如，用聚-L-赖氨酸包被膜产生带正电荷的表面。

经流体静压处理，在周期性流体静压下，小分子量的分子高效渗透入袋中。大分子量产物，如ECM，被保留在袋内。可生物降解的无定形聚合物被新合成的ECM替代。

                       实施例8

使用在半透膜袋中培养并用物理刺激操作的自体可注射软骨细胞/基质

                      的外科治疗

该外科方法使用可注射的细胞/基质并依赖于自愈合过程和体外细胞治疗而非全组织替换。这一修复技术利用了组织自身的关节表面再建能力从而在受损部位构建软骨表面层。一旦用迁移细胞形成表面层，在新表面下注射软骨细胞(具有其自身基质)并填充缺陷。该手术方法允许使用关节镜替代更侵入性的手术方法。基于使用实施例1-7开发的优化培养方法，用物理刺激处理的可注射细胞/基质有利于软骨的从头再生。为了体外形成细胞/基质构建体，通过实施使用半透膜袋实现高效ECM累积、选择无定形细胞载体以及确定物理刺激的算法而开发了一系列体外培养方法(附图6)。这种方法包括下面三个步骤：

1)分离软骨细胞，清洁受损缺陷，用纤维蛋白胶填充缺陷。

2)扩增分离的细胞，使用实施例1的生物反应器在最佳物理刺激下在培养中在半透膜袋内与无定形凝胶一起培养。

3)在新覆盖的表面层或软骨表面过渡区与软骨下骨之间注射所述细胞/基质。

                        等同物

前述书面说明被认为足以使得本领域技术人员实施本发明。本发明不限于所提供实施例的范围内，因为实施例意在单独举例说明本发明的某一方面，其它功能等同的实施方案也在本发明范围内。根据前面的描述，除本文所示和描述的以外，本发明的多种改进对于本领域技术人员而言将是显而易见的并落入在附属的权利要求范围内。本发明的优势不必包含在本发明每一实施方案中。

本申请中所引用的所有参考、专利和专利公开在此全部引入作为参考。