生产具有多重胁迫耐受性的植物的重组表达载体以及使用其制备多重胁迫－耐受性植物的方法

技术领域

本发明涉及生产具有多重胁迫耐受性的植物的重组表达载体，转化了上述载体的多重胁迫耐受性植物，和制备所述植物的方法，所述重组表达载体通过将多重胁迫耐受性基因附着到源于甘薯的氧化胁迫诱导性启动子上以在叶绿体中表达所述基因而制备。

背景技术

包括植物的大多数生物不仅易受生物胁迫诸如病原体、昆虫、病毒等的影响，而且易受各种环境压力诸如高温、盐、干旱、污染、损伤、冻伤、过度光照条件、臭氧、二氧化硫、过度暴露于UV、渗透性冲击等的影响。当植物受到如上述各种环境压力的影响时，其中生命支持必需的氧转变成活性氧自由基，包括超氧阴离子自由基(O^2-)、过氧化氢(H₂O₂)、氢氧自由基等，这在体内引起严重的生理紊乱。精确地，少量的氧自由基在体内足以在细胞中传导信号，并且在植物中诱导自我防御必需的基因(抗氧化酶、热激蛋白等)的表达。然而，活性氧自由基的增加通过剂量-依赖性方式引起生理紊乱，甚至引起细胞死亡。

最近，许多研究者对植物中氧自由基介导的信号传导途径非常感兴趣。这是由于所述途径的调控使得细胞中抗氧化酶和宿主-防御蛋白的表达增加，并且导致具有针对任何环境胁迫的强抗性的植物的发展(Kovtun，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97(6)：2940-2945，2000)。依据最近的报道，MAP激酶级联(MARK级联)在植物中由氧自由基介导的信号传导途径中起重要作用(Kovtun，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97(6)：2940-2945，2000)。

超氧化物歧化酶(SOD)是一种将超氧阴离子自由基(O^2-)转化成过氧化氢(H₂O₂)的酶，并且按照酶中所包含的金属辅因子分为CuZnSOD，MnSOD和FeSOD。这些酶在细胞中分布不同，例如CuZnSOD在细胞质和叶绿体中发现，MnSOD在线粒体中发现，以及FeSOD存在于叶绿体中。SOD是一种消除生物体中由环境胁迫产生的氧自由基的重要的环境耐受性因子，其可以用于产生医药供给、食品、化妆品等。并且因此，制备包含SOD基因的表现出强活性胁迫耐受性的转基因植物导致具有针对环境胁迫诸如臭氧、低温、除草剂等的强抗性的植物的发展(PlantPhysiology，10：1049-1054，1995；US Patent No：5,538,878)。

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种通过使用维生素C作为电子供体而将H₂O₂转化成水的酶，并且在植物和昆虫中大量地发现。已知这种酶在植物中存在于细胞质、叶绿体基质和类囊体膜中(Free Rad.Biol.Med.23：473-479，1997)。

在植物的叶绿体中，氧含量相对高，并且应用从利用光能分解水产生的电能操纵电子转运系统，因此这一器官对各种氧化胁迫非常敏感。因此，叶绿体抗氧化能力的增加可能极大地帮助维持植物在环境胁迫下的生产力。

到现在，为了开发胁迫耐受性植物，不管什么条件都能组成型表达的CaMV 35S启动子，已经广泛地与具有针对具体胁迫的抗性的基因组合应用，来构建表达载体。因此，得到的植物具有只针对具体的胁迫的抗性。为了克服这一问题，需要制备一种表达载体，其包括能够在任何胁迫环境下表达的启动子和胁迫耐受性基因，并且制备用所述载体转染的转基因植物。

为了开发具有针对环境灾难的耐受性的转基因农作物，本发明人制备了用于植物转化的新型表达载体，其通过将多重胁迫耐受性基因SOD(超氧化物歧化酶)和APX(抗坏血酸过氧化物酶)附着到源于甘薯的氧化胁迫诱导性过氧化物酶启动子SWPA2上而在植物的叶绿体中表达所述基因。然后，本发明人通过组织培养再生从马铃薯、甘薯和高羊茅制备的转化植物。最后，本发明人通过证实本发明的转基因植物具有增加的多重胁迫耐受性而完成本发明。

公开内容

技术问题

本发明的一个目的是提供一种用于植物转化的重组表达载体，其通过将多重胁迫耐受性基因附着到源于甘薯的氧化胁迫诱导性启动子上以在叶绿体中表达所述基因而制备。

本发明的另一个目的是提供转化了上述表达载体的多重胁迫耐受性植物，以及关于其的制备方法。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供用于生产多重胁迫耐受性植物的重组表达载体‘pSSA-K’和‘pSSA-H’，其含有氧化胁迫诱导性过氧化物酶启动子、烟草蚀刻病毒(TEV)前导序列、多重胁迫耐受性基因、用于叶绿体靶向表达的转运肽序列、CaMV 35S转录终止子、抗生素抗性基因和T-DNA边界序列(T-DNA boarder sequence)。

本发明还提供用上述pSSA-K或pSSA-H表达载体转化的转基因植物。

本发明还提供多重胁迫耐受性转基因植物的制备方法，所述方法包括下述步骤：

i)制备用于植物转化的表达载体，所述载体包括SWPA2启动子、SOD基因和APX基因；

ii)通过将上述表达载体插入到植物或培养细胞中而制备转化体；

iii)培养上述转化体；和

iv)在组织-培养所述转化体后通过再生而制备转基因植物。

在下文中将详细地描述本发明。

本发明提供用于生产多重胁迫耐受性植物的重组表达载体pSSA-K和pSSA-H，其包含氧化胁迫诱导性过氧化物酶启动子、烟草蚀刻病毒(TEV)前导序列、用于叶绿体靶向表达的转运肽序列、多重胁迫耐受性基因、CaMV 35S转录终止子、抗生素抗性基因和T-DNA边界序列。

在本发明的一个优选实施方案中，由SEQ.ID.No 11代表的SWPA2(甘薯过氧化物酶阴离子2)启动子的核苷酸序列，优选地用作源于甘薯的氧化胁迫诱导性过氧化物酶启动子，和由SEQ.ID.No 12代表的SOD基因核苷酸序列以及由SEQ.ID.No 13代表的APX基因核苷酸序列优选地用作多重胁迫耐受性基因。

本发明人将由本发明人按上述制备的用于生产多重胁迫耐受性植物的表达载体pSSA-K和pSSA-H于2003年11月7日保存在韩国生命工学研究院(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB))的韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for TypeCultures(KCTC))。pSSA-K表达载体的保藏号是KCTC 10536BP，和pSSA-H表达载体的保藏号是KCTC 10537BP。

SWPA2启动子是本发明人从甘薯(Ipomoea batatas)分离的氧化胁迫诱导性启动子，其对于开发胁迫耐受性植物和产生其它有用产物的植物细胞系非常有用(韩国专利公布No：2001-51095；国际公布No：WO01/31018(于2000年10月28日申请)；Kim，等.，Plant Mol.Biol.，51：831-838，2003)。精确地，作为在培养细胞中高度表达的过氧化物酶启动子，SWPA2是一种受到氧化胁迫而诱导表达的基因。特别地，所述基因特异地在甘薯悬浮培养细胞和转化的烟草悬浮培养细胞中在对数期末期高度表达(国际公布No：WO 01/31018)。在使用烟草原生质体用GUS蛋白进行的瞬时检测中，所述启动子表现出比CaMV 35S启动子高至少30倍的活性。在正常条件下，所述启动子不在植物的叶片中表达，但是当它们受到诸如臭氧的氧化胁迫、低温、损伤等时，其表达(Kim，等.，Plant Mol.Biol.，51：831-838，2003)。因此，本发明的SWPA2启动子可以有效地用于开发环境胁迫耐受性植物，和用于应用转化的植物细胞而生产有用的产物。

本发明的SWPA2启动子有效地通过胁迫而诱导目标基因的表达。本发明的SWPA2启动子包括识别由ABA(脱落酸)、茉莉酮酸甲酯、损伤、组织缺氧、氧自由基、热或氮气产生的外来胁迫的因子。基于所述启动子的这一特征，SWPA2启动子用于构建嵌合基因结构，其中将具有启动子活性的DNA序列连接到结构基因上以于启动子序列有效地起作用。由于在参与生产有价值的因子的结果基因和SWPA2启动子之间的连接，这样的嵌合基因结构可以通过控制SWPA2启动子而使有价值的因子在任何环境胁迫下表达，以便它可以有效地用于制备生产有用产物的转化体。另外，当多重胁迫耐受性基因作为结构基因给予嵌合基因结构时，可以产生具有胁迫耐受性的转化体。

用于本发明的SOD基因通常从多于30种植物中分离。并且，特别地，从作为SOD高-生产细胞系选择的木薯(Manihot esculenta)的培养细胞首先分离的CuZnSOD基因(mSOD1)，与从豌豆分离的APX基因(Free Rad.Biol.Med.23：473-479，1997)一起用于本发明(Mol.Gen.Genet.262：807-814，1999)。

在本发明的优选实施方案中，本发明人通过将由SEQ.ID.No 15代表的SWPA2启动子与pRW20载体连接而构建pSA载体，在pRW20载体中插入由SEQ.ID.No 16代表的mSOD1基因而制备pSS载体(参见图1)。然后，将pSS载体的SWPA2pro-TEV-TP-SOD-35S转录终止子结构插入到包含潮霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因的用于植物转化的表达载体中，然后将从pSA分离的SWPA2pro-TEV-TP-APX-35S转录终止子结构插入到其中。结果，构建了用于生产多重胁迫耐受性植物的pSSA-K和pSSA-H表达载体(参见图2)。除了分别包括使得用所述载体转化的多重胁迫耐受性植物易于选择的潮霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因外，上述pSSA-K和pSSA-H表达载体还包括SWPA2启动子、mSOD1、APX基因、烟草蚀刻病毒(TEV)前导序列、用于叶绿体靶向表达的转运肽序列和CaMV 35S转录终止子，这使得对转化了所述载体的多重胁迫耐受植物的选择更加容易。

本发明还提供用pSSA-K或pSSA-H表达载体转化的多重胁迫耐受性植物。所有种类的植物可以用于生产转基因植物，但是优选大豆、大麦属、玉蜀黍、马铃薯、甘薯或高羊茅，并且特别地更优选马铃薯、甘薯或高羊茅。

本发明提供多重胁迫耐受性转基因植物，其通过转化用于产生多重胁迫耐受性植物的重组表达载体而制备，所述重组表达载体包含SWPA2启动子、SOD基因和APX基因，以在植物中大量表达SOD基因和APX基因。

在本发明的优选实施方案中，将上述构建的pSSA-K或pSSA-H表达载体插入到植物中，优选地插入到大豆、大麦属、玉蜀黍、马铃薯、甘薯或高羊茅中，并且更优选地插入到马铃薯、甘薯或高羊茅中，以表达SOD基因和APX基因。特别地，本发明人通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105或者通过粒子轰击的方法将上述表达载体插入到马铃薯、甘薯或高羊茅的嫩叶或叶柄切片中，以制备转化体。将得到的转化体进行组织培养，以诱导在植物中的再生(参见图3A，图4A和图5A)。从每种再生的转基因马铃薯、甘薯或高羊茅中提取基因组DNA，通过PCR从所述基因组DNA中扩增SWPA2启动子或APX基因，以证实SWPA2启动子或APX基因插入到植物基因组中(参见图3B，图4B和图5B)。在通过PCR证实了成功转化后，还从每种转基因植物中提取基因组DNA，将其转移到膜上。使用SWPA2启动子或APX基因进行DNA印迹杂交，以再次验证SWPA2启动子或APX基因在植物基因组中的插入(参见图3C，图4C和图5C)。

为了证实用pSSA-K或pSSA-H表达载体转化的转基因植物的胁迫抗性，本发明人例如应用甲基紫精(MV)或过氧化氢而在转化的马铃薯、甘薯或高羊茅的叶片或植物本身诱导氧化胁迫，然后研究离子传导率(参见图6，7，9，10和11)、可见的损伤(参见图8A和图11C)、光合作用效率(参见图11A)、叶片干重(参见图8B和图11B)以及叶绿素含量(参见图8C)。结果，证实用本发明的pSSA-K或pSSA-H表达载体转化的转基因植物与未转化的植物相比，表现出极好的氧化胁迫耐受性。还证实本发明的转基因植物可以在其它胁迫如高温(参见图13B～图14B)、低温(参见图15A和图15B)或SO₂胁迫(参见图16和图17)下保持正常的状况。

本发明还提供用上述pSSA-K或pSSA-H表达载体转化的转基因植物。

本发明还提供多重胁迫耐受性转基因植物的制备方法，所述方法包括下述步骤：

i)制备用于植物转化的表达载体，所述载体包括SWPA2启动子、SOD基因和APX基因；

ii)通过将上述表达载体插入到植物或培养细胞中而制备转化体；

iii)培养上述转化体；和

iv)在组织-培养所述转化体后通过再生而制备转基因植物。

这时，pSSA-K或pSSA-H优选地作为表达载体，并且任何植物可以用作上述植物或培养细胞，但是优选大豆、大麦属、玉蜀黍、马铃薯、甘薯或高羊茅，并且更优选马铃薯、甘薯或高羊茅。

上述转化体可以通过常规植物转化方法(Horsch，等.，Cold SpringHarb Symp Quant Biol.，50：433-7，1985；Rogerset，等.，1986)而制备，但是在本文中优选地应用粒子攻击而产生转化体。

在本发明的优选实施方案中，由于所述载体含有SWPA2启动子、SOD基因、APX基因、用于叶绿体靶向表达的转运肽序列、烟草蚀刻病毒(TEV)前导序列、CaMV 35S转录终止子和潮霉素或卡那霉素抗性基因，所以用所述载体转化的转基因植物可以容易地选择，因此，pSSA-K或pSSA-H用作表达载体。

附图描述

图1是显示本发明同时表达SOD(超氧化物歧化酶)和APX(抗坏血酸过氧化物酶)基因的载体的生产流程的示意图，

图2是显示含有SOD和APX基因用于生产多重胁迫耐受性植物的重组表达载体的示意图，

图3A是显示在将通过使用产生多重胁迫耐受性植物的重组表达载体(pSSA-K)而产生的具有卡那霉素抗性的转基因马铃薯(品种：Superior)进行组织培养后再生的植物的各个器官的形态的照片，

图3B是使用SEQ.ID.No 1和No 2代表的引物通过PCR验证SWPA2启动子在用本发明的表达载体(pSSA-K载体)转化的转基因马铃薯植物中的扩增的电泳照片，

图3C是验证SOD和APX基因存在于通过使用本发明的表达载体(pSSA-K载体)而制备的转基因马铃薯植物的基因组中的DNA印迹照片，

图4A是显示在将通过使用本发明的表达载体(pSSA-K载体)而产生的卡那霉素抗性转基因甘薯(品种：Yulmi)进行组织培养后再生的植物的各个器官的形态的照片，

图4B是使用SEQ.ID.No 1和No 2代表的引物通过PCR验证SWPA2在用本发明的表达载体(pSSA-K载体)转化的转基因甘薯植物中的扩增的电泳照片，

图4C是验证SOD和APX基因存在于用本发明的表达载体(pSSA-K载体)转化的转基因甘薯植物的基因组中的DNA印迹照片，

图5A是显示获自通过使用本发明的表达载体(pSSA-H载体)而制备的潮霉素抗性转基因高羊茅的组织培养物的再生植物的一组照片，

图5B是验证SOD和APX基因存在于用本发明的表达载体(pSSA-H载体)转化的转基因高羊茅植物的基因组中的PCR照片，

图5C是验证SOD和APX基因存在于用本发明的表达载体(pSSA-H载体)转化的转基因高羊茅植物的基因组中的DNA印迹照片，

图6是显示在将它们用不同浓度(0，3，5和10μM)的甲基紫精(MV)溶液处理后NT和SSA马铃薯植物叶片中的膜损伤的一组照片，其通过研究溶液中离子传导率而测定，

图7是显示在用不同浓度0，150，200和250μM的MV溶液喷洒5天后的马铃薯植物中的MV抗性水平的一组照片，

图8是显示在用不同浓度0，150，200和250μM的MV溶液喷洒5天后的马铃薯植物叶片中的可见损伤(A)、存活叶片的相对干重(B)、和叶绿素含量(C)，

图9是显示用不同浓度的MV溶液(0，2.5，5和10μM)处理72小时的NT和SSA植物的甘薯叶片中的膜损伤的一组图表，其通过研究溶液中的离子传导率而检测，

图10是显示用不同浓度0，100，150和200μM的MV溶液喷洒5天后的甘薯植物的MV抗性水平的一组照片，

图11是显示不同浓度0，100，150和200μM的MV溶液喷洒5天后的甘薯植物的光合作用效率(A)、存活叶片的相对干重(B)以及叶片中的可见损伤(C)的一组图表，

图12是显示用5μM MV溶液(A)和50mM H₂O₂溶液(B)处理的高羊茅植物叶片中的膜损伤的一组图表，

图13是显示在马铃薯植物的叶片中观察到的高温抗性的一组图表，精确地，在高温(25℃(A)和37℃(B))处理60小时后研究膜中的离子传导率，

图14是显示马铃薯植物高温抗性研究结果的一组照片和图表。精确地，研究在42℃热处理10小时导致的可见损伤(A)，和在42℃处理10小时、20小时后以及在高温处理后在25℃复苏3小时后的光合作用效率(B)，

图15是显示甘薯植物低温抗性研究结果的一组照片和图表。精确地，显示在4℃处理24小时后的可见植物损伤(A)，在所述处理后在25℃复苏12小时的植物的照片(B)，和在4℃低温处理24小时过程中以及在25℃复苏12小时后的光合作用效率(C)，

图16是显示每天用500ppb二氧化硫处理8小时持续处理5天导致的SSA甘薯植物的二氧化硫抗性的照片，

图17是显示NT和SSA甘薯植物的光合作用效率的图表，其在用500ppb二氧化硫处理5天过程中，和在用二氧化硫处理5天后适应正常条件(0ppb)后而获得。

发明模式

如在下述实施方案中所示，本发明实用的和目前优选的实施方案是示例性的。

然而，应该理解，考虑到本公开内容，本领域的技术人员可以进行术语本发明的精神和范围之内的更改和改进。

<实施例1>构建多重胁迫耐受性基因的表达载体pSSA-K和pSSA-H

本发明人通过将SEQ.ID.No 16代表的编码木薯CuZnSOD(CuZn超氧化物歧化酶，mSOD1)的cDNA(GenBank登记号AF170297，Lee，等.，Mol.Gen.Genet.，262：807-814，1999)和SEQ.ID.No 17代表的编码豌豆APX(抗坏血酸过氧化物酶；Randy，等.，Free Rad.Biol.Med.，23：473-479，1997)的cDNA连接到SEQ.ID.No 15代表的氧化胁迫诱导性SWPA2启动子(韩国专利公布No：2001-51095；国际公布No：WO 01/31018)上，而构建载体。

具体地，使用每种由SEQ.ID.No 1和No 2代表的引物而进行PCR，在94℃ 1分钟，51℃ 1分钟，72℃ 1.5分钟(这一循环重复30次)，以扩增SWPA2启动子序列。并且按照制造者的流程，将扩增的SWPA2启动子序列克隆到pGEM-T Easy质粒载体(Promega，USA)中。并且分析载体的核苷酸序列，以证实SWPA2启动子的目标序列是否正确地扩增。引物的核苷酸序列具有Hind III和Xho I限制性位点。因此，可以通过用Hind III和Xho I处理而从pGEM-T Easy质粒载体分离SWPA2启动子序列。并且，将为把豌豆的APX(抗坏血酸过氧化物酶)递送到叶绿体而构建的pRW20载体(Allen，等.，Free Rad.Biol.Med.，23：473-479，1997)用相同的酶消化，以消除增强型CaMV 35S启动子。然后，将更早先分离的SWPA2启动子连接到载体上，形成pSA载体的构建(图1)。

为了用mSOD1基因取代pSA载体中的APX基因，使用分别由SEQ.ID.No 3和No 4代表的引物进行PCR，在94℃ 1分钟，57℃ 1分钟和72℃ 1分钟(这一循环重复30次)，以扩增mSOD1基因。并且按照制造者的流程，将扩增的mSOD1克隆到pGEM-T Easy质粒载体(Promega，USA)中。进行核苷酸序列分析以验证目标mSOD1基因是否得到正确地扩增。引物的核苷酸序列具有Sal I和Sac I限制性位点。因此，将mSOD1基因从pGEM-T Easy质粒载体分离，通过用Sal I和Sac I处理更早地将mSOD1基因克隆到所述载体中。然后，将分离的mSOD1基因插入到用相同的限制性酶消化的上述pSA载体中。并且得到的载体命名为pSS载体(图1)。

最后，通过使用含有潮霉素抗性基因的pCAMBIA1300质粒(Centerfor Application of Molecular Biology to International Agriculture，Australia)和含有卡那霉素抗性基因的pCAMBIA2300质粒(Center for Applicationof Molecular Biology to International Agriculture，Australia)，构建用于植物转化的载体pSSA-K和pSSA-H，以同时转化SOD和APX。具体地，将上述pSS载体用Hind III消化，以获得大约2.0kb大小的DNA片段，将其插入到用相同的酶预先消化的pCAMBIA1300质粒和pCAMBIA2300质粒中。还将pSA用Pst I消化，以获得2.3kb大小的DNA片段，将其插入到上述质粒中，导致构建成具有SOD和APX基因的表达载体：pSSA-K载体(将DNA片段插入到pCAMBIA2300中)和pSSA-H载体(将DNA片段插入到pCAMBIA1300中)(图2)。本发明人将由本发明人按上述构建的pSSA-K和pSSA-H于2003年11月7日保存在韩国生命工学研究院的韩国典型培养物保藏中心。pSSA-K表达载体的保藏号是KCTC10536BP，和pSSA-H表达载体的保藏号是KCTC 10537BP。在图1和图2中，SWPA2 pro：氧化胁迫诱导性启动子，E35S pro：增强型CaMV 35S启动子，TEV：烟草蚀刻病毒(TEV)前导序列，TP：豌豆CuZnSOD(Cu·Zn超氧化物歧化酶)的信号序列，35S 3’：CaMV 35S转录终止子，Amp：抗生素(氨苄青霉素)抗性基因，H：Hind III，P：Pst I，Xh：Xho I，R：EcoR l，N：Nco l，S：Sal l，B：BamH l，X：Xba l，和Sa：Sac l。

按照An’s方法(An，Meth.Enzymol.，153：292-305，1987)，通过将上文构建的用于植物转化的表达载体(pSSA-K或pSSA-H)插入到根癌农杆菌EHA105中而制备转基因马铃薯植物(Hood，等.，Trans.Res.，2：208-218，1993)。

并且此外，通过使用Qiagen Co(U.S.A)提供的质粒Maxi试剂盒，从大肠杆菌分离质粒DNA(pSSA-K载体)，然后，通过粒子轰击用于转化甘薯，这将在下文实施例3中进行解释。

<实施例2>制备转化了pSSA-K表达载体的转基因马铃薯

<2-1>制备转基因马铃薯植物

本发明人通过共培养马铃薯植物的叶片圆片和含有在上文实施例1中构建的pSSA-K载体的根癌农杆菌EHA105而制备转基因马铃薯植物。

具体地，通过在培养箱中培养世界上最广泛培养的品种Superior和用于处理的品种Atlantic而制备本文用于转化的马铃薯植物(Solanumtuberosum L.)。将马铃薯植物在补充了3％蔗糖的MS培养基(Murashige和Skoog，Physiol.Plant.，15：473-497，1962)中培养，在25℃培养室中在冷白色荧光(40μmol·m^-2·sec^-1)下16小时光照/8小时黑暗的光条件下培养。培养2周后，将叶柄和在芽顶端的第二或第三片叶子分离，并且用作植物转化的材料。

将补充了50mg/l卡那霉素的5ml LB培养基(细菌用蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l和NaCl 10g/l)接种农杆菌，然后在28℃摇动培养箱中培养1天。将100μl农杆菌培养物溶液和马铃薯植物的叶片和叶柄片在含有10ml MS基本液体培养基的培养皿中完全混合，然后在黑暗中在25℃共培养2天。将农杆菌用MS基本液体培养基洗涤，然后用无菌滤纸消除获自共培养马铃薯植物的叶片和叶柄片中的水分。然后，将叶片和叶柄片置于选择培养(含有2mg/l玉米素，0.01mg/l NAA(萘乙酸)，0.1mg/l GA3(赤霉素)，300mg/l claforan和100mg/l卡那霉素的MS培养基)上。每3周将所述圆片转移到新鲜的新培养基中，然后进行亚培养。在从培养开始的3-4周后，观察到卡那霉素抗性的芽和胼胝体的产生。

当长出一或两片叶子时，将芽转移到根诱导培养基(含有300mg/l claforan和100mg/l卡那霉素的MS基本培养基)中以诱导根。根从所述芽得到很好的诱导，并且将有根的小植物从培养容器中取出，暴露在外4-5天(适应培养室)，然后转移到温室苗床花盆中，然后在培养箱中进一步培养(图3A)。结果，在生长在培养箱中的马铃薯植物中形成微管(图3A)。在携带外来基因的转基因马铃薯植物和未转化的马铃薯植物之间的形态上没有显著差异。同时，当叶柄用作转化材料时，比当叶片用于转化时形成更多的芽。尽管，通过PCR验证它们中的大多数是没有转化的。

<2-2>通过PCR和DNA印迹检验转化体

为了研究在上述实施例2-1中制备的马铃薯植物是否正确地转化，将再生的植物首先在补充了卡那霉素的培养基中进行选择，然后用SEQ.ID.No 5和No 6代表的SWPA2启动子的特异性引物进行PCR，在94℃ 1分钟，53℃ 1分钟和72℃ 1分钟(这一循环重复30次)，以扩增SWPA2启动子序列，进行转化体的选择(图3B)。结果，从携带外来基因的植物扩增了0.5kb的片段，这表明插入了SWPA2启动子。在图3B中，M：分子量大小标记，NT：未转化的马铃薯植物，1-5：卡那霉素抗性马铃薯植物，和P：阳性对照DNA。

对通过PCR验证的随机选择的马铃薯植物进行DNA印迹。精确地，通过使用Dneasy Plant Maxi试剂盒(QIAGEN Co.)，从在培养箱中生长的每株Atlantic和Superior植物的叶片中提取基因组DNA。将30μg的基因组DNA用限制性酶EcoRI消化，然后在琼脂糖凝胶上进行电泳。将在凝胶上的基因组DNA转移到Zeta Probe膜(Bio-Rad Co.)上，然后使用作为探针的³²P标记的SWPA2启动子序列的0.5kb DNA片段杂交转移的DNA。一旦完成杂交，将膜进行洗涤，并且暴露于X射线胶片，以检测条带。结果，尽管在非转基因对照植物中没有观察到条带，但是在转化的Atlantic和Superior植物中观察到3条条带，这意味着SWPA2启动子稳定地插入到马铃薯的基因组中(图3C)。在图3C中，NT：未转化的马铃薯植物，A1和A2：转化的Atlantic植物，以及S1和S2：转化的Superior植物。

<实施例3>通过使用pSSA-K表达载体制备转基因甘薯植物

<3-1>制备转基因甘薯植物

本发明人通过粒子轰击使用在上述实施例1中构建的pSSA-K载体转化甘薯胚发生胼胝体。

具体地，将在韩国培养的甘薯(Ipomoea batatas Lam.；品种：Yulmi)的胚发生胼胝体用作本发明的转化材料。更精确地，将甘薯的胚发生胼胝体诱导并且保持，以建立甘薯植物再生系统(Kwon，等.，Korean J.PlantBiotechnol.，29：189-192，2002)。

将胚发生胼胝体按细胞簇切成直径1-2mm。将细胞簇置于在补充了1mg/l 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的MS固体培养基上直径2cm的中心环内，将其培养1天，然后进行粒子攻击(图4A)。更精确地，制备在实施例1中构建的用于植物转化pSSA-K载体的质粒DNA。然后，将金粒子(直径1μm)用所述质粒DNA包被，然后在1,100psi压力下9cm距离处使用PDS-1000/He粒子递送系统(BioRad Co.)进行粒子轰击。在粒子轰击后，将植物在暗处在25℃培养3天，然后从补充了1mg/l 2，4-D和100mg/l卡那霉素的的MS选择培养基选择卡那霉素抗性的胚发生胼胝体。在亚培养过程中，选择以3周的时间间隔持续5-6个月。将卡那霉素抗性胚发生胼胝体转移到只补充了100mg/l卡那霉素没有2，4-D的MS基本培养基中。并且在培养箱中在25℃在40μμmol m^-2.sec^-1冷白色荧光条件下，将胚发生胼胝体转化成体细胞胚，这导致植物的再生(图4A)。

<3-2>通过PCR和DNA印迹验证转化体

为了验证在上述实施例3-1中制备的转基因甘薯植物是否得到正确地转化，将再生的植物首先在含有卡那霉素的培养基中进行选择。使用SEQ.ID.No 7和No 8代表的SWPA2启动子的特异性引物或者SEQ.ID.No 9和No 10代表的APX基因的特异性引物，对所述植物进行PCR，在94℃ 1分钟，56℃ 1分钟和72℃ 1分钟(这一循环重复30次)，以扩增SWPA2启动子或APX基因，然后进行电泳以选择转化体(图4B)。结果，当使用SWPA2启动子的特异性引物时，从插入外源基因的植物扩增得到1kb DNA片段，和当使用APX基因特异性引物时从其中扩增得到大约0.5kb的DNA片段，这表明SWPA2或APX基因被稳定地插入。在图4B中，M：分子大小标记，NT：未转化的甘薯植物，1-9：卡那霉素抗性甘薯植物，和P：阳性对照DNA。

对通过PCR验证的随机选择的甘薯植物进行DNA印迹。具体地，通过使用Dneasy Plant Maxi试剂盒(QIAGEN Co.)，从在培养箱中生长的甘薯植物的叶片中提取基因组DNA。将30μg得到的基因组DNA用限制性酶EcoR I消化，然后在琼脂糖凝胶上进行电泳。将在凝胶上的基因组DNA转移到Zeta Probe膜(Bio-Rad Co.)上。将转移的DNA杂交0.5kb的DNA片段，所述DNA片段是mSOD1的一部分，用³²P标记用作探针。一旦完成杂交，将膜进行洗涤，并且暴露于X射线胶片，以发现条带。结果，在卡那霉素抗性甘薯植物中稳定地插入了多于2个拷贝的mSOD1，而在对照植物中没有观察到条带(图4C)。在图4C中，NT：未转化的甘薯植物，和T1-T4：转化的甘薯(品种：Yulmi)植物。

<实施例4>通过使用pSSA-H表达载体制备转基因高羊茅植物

<4-1>制备转基因高羊茅植物

本发明人共培养含有在上述实施例1中构建的pSSA-H载体(质粒DNA)的根癌农杆菌EHA105和高羊茅切片，以诱导其的转化。

具体地，将主要作为动物饲料而培养的Kenturky-31用来转化高羊茅(苇状羊茅(Festuca arundinacea Schreb.))。为了制备用于高羊茅转化的胼胝体，将种子灭菌，并且去掉种子的表皮。然后，将种子在胼胝体诱导培养基[含有9mg/l 2，4-D，0.1mg/l BA(苯甲基腺嘌呤)，30g/l蔗糖，5g/l gelite的MS培养基]中培养4周以诱导胼胝体。将在28℃在补充了50mg/l卡那霉素的YEP液体培养基(10g/l细菌用-蛋白胨，10g/l酵母提取物和5g/l NaCl)中培养2天的农杆菌培养物溶液离心以得到细菌细胞。然后，将溶液悬浮在补充了100μM乙酰丁香酮，20mg/l抗坏血酸和5mg/l硝酸银(AgNO₃)的诱导胼胝体的液体培养基中，直到OD₆₀₀达到1。在真空下将所述胼胝体浸在农杆菌悬浮液中30分钟以诱导感染。然后，将剩余的农杆菌去除，并且将胼胝体转移到共培养基(含有100μM乙酰丁香酮，20mg/l抗坏血酸和5mg/l硝酸银)中，然后在28℃进一步培养3天。将感染的胼胝体转移到培养后培养基(含有5mg/l 2，4-D，1mg/l BA，140mg/l FeNaEDTA，70mg/l肌醇，25mM脯氨酸，0.4mM硫代脯氨酸，50mM K₂SO₄，2g/l酵母提取物，30g/l蔗糖和5g/l gelite的MS培养基)中，然后进一步培养1周。然后，将所述胼胝体再在初级选择培养基(含有0.5mg/l 2，4-D，2mg/l BA，140mg/lFeNaEDTA，70mg/l肌醇，25mM脯氨酸，0.4mM硫代脯氨酸，50mMK₂SO₄，2g/l酵母提取物，30g/l蔗糖，5g/l gelite和25mg/l潮霉素的N6基本培养基)中培养2周。将在初级选择培养基中存活的胼胝体和再生的芽转移到第二选择培养基(第一选择培养基+50mg/l潮霉素)中，然后培养3天，以再生转基因植物。将再生植物的芽切下，然后移植到补充了50mg/l潮霉素和30g/l蔗糖的1/2MS固体培养基中，以诱导根的发育。只选择那些表现出潮霉素抗性的个体。在适应环境后，将这些个体移植到花盆中并且进行培养(图5A)。

<4-2>通过PCR验证转化体

使用基因组DNA进行PCR和DNA印迹，以验证目标基因是否插入到在上述实施例4-1中制备的转基因高羊茅植物中。同时，将从在含有潮霉素的选择培养基中表现出强抗性的高羊茅植物中提取的基因组DNA和从正常萌芽长成的野生型高羊茅的对照中提取的基因组DNA用作模板。并且此外，在pSSA-H载体的核苷酸序列中选择由SEQ.ID.No11代表的正向引物和由SEQ.ID.No 12代表的反向引物，并且用于PCR，以通过扩增所述表达载体特异性核苷酸序列区而验证目标基因的插入。PCR进行30个循环，每个循环在94℃/1分钟，52℃/1分钟，和72℃/1分钟。结果，扩增得到大约0.5kb大小的目标片段，这表明APX基因正确地插入。在图5B中，Mw：分子大小标记，P：阳性对照DNA，NT：未转化的高羊茅植物，1-3：潮霉素抗性高羊茅植物。

每种基因组DNA从潮霉素抗性高羊茅植物和从正常萌芽长成的野生型高羊茅植物提取，然后用限制性酶Hind III消化，然后在琼脂糖凝胶上进行电泳。将DNA转移到尼龙膜上。使用由SEQ.ID.No 13和No14代表的引物通过PCR扩增的APX基因片段(426bp)作为探针，进行DNA印迹。结果，在具有强潮霉素抗性的高羊茅植物中观察到一条特异性的条带。另一方面，在对照植物中没有检测到条带(图5C)。在图5C中，2，3和4：转化的高羊茅植物。

<实施例5>SSA转基因植物的环境抗性

<5-1>氧化胁迫抗性

<5-1-1>马铃薯植物叶片的氧化胁迫抗性

为了研究SSA转基因马铃薯(品种：Atlantic)的氧化胁迫抗性，在温室中生长未转化的植物(NT植物)和SSA植物。从7周大的植物的叶片(从顶部的第5或第7片叶片)上采取10个叶片圆片(直径8mm)，将其漂浮在含有0，3，5和10μM甲基紫精(MV)的5ml 0.4M山梨糖醇溶液中。将它们在暗处培养12小时，以使它们吸收MV。此后，将它们再在光处培养48小时。然后，通过使用电导计(Orion，Model 162)测定溶液的离子传导率，这导致对叶片损伤的测定(图6)。图6A显示用0μMMV处理的结果，6B显示用3μM MV处理的结果，6C显示用5μM MV处理的结果，和6D显示用10μM MV处理的结果。在不处理的情形中，NT和SSA植物叶片的离子传导率保持稳定在20％持续48小时。在MV处理的情形中，含有SSA植物叶片的溶液的电导率比含有NT植物叶片的溶液的电导率低得多。从在用3，5，和10μM MV处理后12小时，在NT植物中开始观察到严重的叶片损伤。特别地，在处理后48小时后观察到大于80％的细胞损伤。然而，在处理后36小时，SSA植物中的细胞损伤仅为大约40％。这些结果表明SSA植物具有的强抗性是NT植物所具有的抗性的两倍。即，其中SOD和APX同时在叶绿体中表达的转基因马铃薯植物具有针对由MV引起的氧化胁迫的增加的抗性。在图6中，NT：未转化的植物和SSA：携带pSSA-K载体的植物。

<5-1-2>马铃薯植物的氧化胁迫抗性

为了研究植物的针对氧化胁迫的抗性能力，通过使用喷雾柜(ModelSB-6，DeVries Manufacturing，Hollandale，MN)，将NT植物、EV植物(携带pCAMBIA2300载体的植物)和SSA植物用70ml不同浓度0，150，200和250μM的MV溶液(含有0.1％吐温20)处理。在喷洒MV溶液5天后，研究植物叶片中的可见损伤。结果，当喷洒150μM MV时，在NT和EV植物的叶片中观察到部分萎蔫，但是在SSA植物中没有观察到损伤。NT和EV植物叶片中的损伤随着MV浓度的增加而增加。使用250μM的浓度，植物的叶片损伤90％，而SSA植物的叶片只是轻微地损伤(图7)。在图7中，NT：非转化体，EV：携带pCAMBIA2300载体的植物和SSA：携带pSSA-K载体的马铃薯植物。

检测可见损伤、叶片干重和叶绿素含量，以研究SSA植物的MV抗性。当将150μM MV溶液喷洒到每株NT植物和EV植物叶片上时，在每株植物中观察到20-40％的叶片损伤，但是在SSA植物中的损伤少于20％(图8A)。同时，在MV处理后NT和EV植物的存活的正常叶片的干重随着MV浓度的增加而减少。当用250μM MV溶液处理时，叶片的干重减少50％(图8B)。相反，在转基因植物的情形中，处理后存活的叶片的干重几乎与未处理的叶片的干重相同，与MV浓度无关。关于叶绿素含量的研究结果与干重检测的结果相似。未处理的植物和MV处理的转基因植物的叶绿素含量为大约40mg/cm²(图8C)。在图8A-8C中，NT：非转化体，EV：携带pCAMBIA2300载体的植物和SSA：携带pSSA-K载体的马铃薯植物。

<5-1-3>甘薯植物叶片的氧化胁迫抗性

为了研究SSA转基因甘薯(品种：Yulmi)的氧化胁迫抗性，将非转基因植物(NT植物)和SSA植物每种3株生长在温室中。从已经生长8周的植物的叶片(顶端第三或第四片叶子)采取10个叶片圆片，然后通过与实施例5-1-1中所用的相同方法用0，2.5，5和10μM甲基紫精(MV)处理。在MV处理后，测定不同浓度MV处理导致的叶片圆片中的损伤(图9)。图9A显示0μM MV处理的损伤，B显示2.5μM MV处理的损伤，C显示5μM MV处理的损伤，以及D显示10μM MV处理的损伤。与含有NT植物的叶片圆片的溶液的电导率相比，含有SSA植物叶片圆片的溶液的电导率非常低。而在MV处理12小时后，在NT植物的叶片圆片中观察到大于50％的细胞损伤，在SSA植物的叶片圆片中细胞损伤低于30％。特别地，与NT植物相比，5μM MV处理在SSA植物的叶片圆片中引起45％的细胞损伤。在图9中，NT：未转化的植物和SSA：携带pSSA-K载体的甘薯植物。

<5-1-4>甘薯植物的氧化胁迫抗性

为了研究桉树植物针对氧化胁迫的抗性能力，将在温室中生长4周的NT植物和SSA植物用70ml不同浓度0，100，150和200μM的MV溶液(含有0.1％吐温20)处理，处理方法与实施例5-1-2中所述的类似。MV处理后5天，观察到植物叶片的可见损伤。当喷洒100-150μM MV时，NT植物的叶片患有白化病而萎蔫。然而，在SSA植物的叶片中只观察到部分损伤。同时，当喷洒200μM MV时，NT植物的叶片几乎萎蔫了，但是只在SSA植物的叶片的某些部分观察到白花现象(图10)。在图10中，NT：非转化体，EV：携带pCAMBIA2300载体的甘薯植物和SSA：携带pSSA-K载体的甘薯植物。

SSA植物的MV抗性还通过测定光合作用效率、叶片干重和可见叶片损伤而进行研究。在MV处理2天后，采取植物顶端第三片叶子检测光合作用效率。当喷洒100μM MV时，与处理前相比，NT和SSA植物中的光合作用效率稍微下降到0.7(图11A)。当喷洒150μM和200μM MV时，光合作用效率大于0.4，这是NT植物光合作用效率的两倍高。在MV处理5天后，还测定了叶片干重。结果，在处理前，NT植物和SSA植物的干重大约400mg，但是NT植物中叶片的干重随着MV浓度的增加而减少。精确地，当用200μM MV处理时，与未用MV处理的植物相比，干重减少90％。同时，SSA植物叶片的干重减少60％，这表明抗性比NT植物高出3倍(图11B)。并且此外，在MV处理后5天观察到植物的可见损伤。结果，在用100μM MV处理的NT植物和SSA植物之间，在可见损伤中没有很多差异。然而，NT植物的叶片85％被200μM MV损伤，而SSA植物的叶片40％或更少被损伤，这意味着与NT植物的抗性相比，SSA植物中MV抗性加倍(图11C)。在图11A-11C中，NT：非转化体，SSA4和SSA5：携带pSSA-K载体的甘薯植物。

<5-1-5>高羊茅植物的叶片圆片的氧化胁迫抗性

为了研究SSA转基因高羊茅植物的氧化胁迫抗性，在温室中生长未转化的植物(NT植物)和SSA植物。从7周大的植物的叶片(从顶部的第5-第7片叶片)上采取10个叶片圆片(直径8mm)，然后将其漂浮在补充了5μM甲基紫精(MV)的5ml 0.4M山梨糖醇溶液中，然后在暗处培养12小时，以使所述圆片吸收MV。在用黑暗处理后，将它们再在光处培养48小时。然后，通过使用电导计(Orion，Model 162)测定溶液的离子传导率，以测定叶片损伤(图12A)。MV处理后，与NT植物相比，含有SSA植物叶片圆片的溶液的电导率非常低。从MV处理后12小时，在NT植物的叶片圆片出现严重的损伤，并且从处理后48小时，NT植物中细胞损伤大于75％。直到MV处理后36小时，SSA植物中的细胞损伤才为40％。这些结果表明，与NT植物相比，SSA植物具有2倍更高的针对MV诱导的氧化胁迫的抗性。将用上述相同方法生长的高羊茅植物的叶片圆片用50mM过氧化氢处理，然后进一步培养48小时。通过电导计测定溶液的离子传导率，以研究叶片损伤(图12B)。在用过氧化氢处理后，与NT植物相比，SSA植物中的细胞损伤很低。更精确地，在处理后12小时，NT植物中的细胞损伤大于65％。相反，直到处理后48小时，SSA植物中细胞损伤少于25％。总之，与NT植物相比，SSA植物具有至少2.6倍更高的针对由过氧化氢引起的氧化胁迫的抗性。从上述结果证实，SSA植物比NT植物具有更高的针对由NV和过氧化氢引起氧化胁迫的抗体。即，SOD和APX同时在叶绿体中表达的转基因高羊茅植物具有增加的针对由MV和过氧化氢引起的氧化胁迫的抗性。在图12A-12B中，NT：未转化的植物和SSA：携带pSSA-H载体的植物。

<5-2>针对温度胁迫的抗性

<5-2-1>马铃薯植物叶片圆片的热胁迫抗性

为了研究SSA转基因马铃薯植物(品种：Atlantic)的热胁迫(高温)抗性，在温室中生长NT植物(未转化的植物)和SSA植物。从7周大的植物的叶片(从顶部的第5-第7片叶片)上采取10个叶片圆片(直径8mm)，并且将其漂浮在5ml 0.4M山梨糖醇溶液中，然后，在37℃培养60小时。对照植物在除了25℃的温度外的相同条件下培养。每12小时测定溶液的离子传导率，以研究叶片损伤。当不给予高温胁迫时(25℃处理组)，NT植物和SSA植物的离子传导率稳定保持60小时(图13A)。然而，当给予37℃的高温胁迫时，SSA植物针对高温的胁迫抗性显著增加(图13B)。在高温处理12小时后，开始在SSA植物中检测到胁迫抗性，并且在36和48小时的离子传导率分别为42％和52％。并且在处理60小时后，抗性加倍。在图13A和图13B中，NT：未转化的植物和SSA：携带pSSA-K载体的植物。

<5-2-2>马铃薯植物的热胁迫抗性

为了研究转基因马铃薯(品种：Atlantic)针对由高温引起的胁迫的抗性，将生长4周的马铃薯植物(品种：Atlantic)的NT植物、EV植物和SSA植物暴露于42℃的温度10小时。结果，NT植物和EV植物萎蔫，但是SSA植物健康地存活下来(图14A)。比较在高温处理前和高温处理后的光合作用效率。结果，在NT植物中，高温处理10和20小时分别将光合作用效率减少15％和30％，但是在SSA植物中，高温处理即使20小时也只将光合作用效率减少6％(图14B)。高温处理后，将植物在25℃复苏3小时。结果，在NT植物和EV植物中，与处理前的光合作用效率相比，光合作用效率恢复50％。同时，SSA植物中光合作用效率几乎恢复到初始的光合作用效率。在图14A和图14B中，NT：非转化体，EV：携带pCAMBIA2300载体的植物，和SSA：携带pSSA-K载体的植物。

<5-2-3>甘薯植物针对由低温引起的胁迫的抗性

为了研究转基因甘薯(品种：Yulmi)针对由低温引起的胁迫的抗性，将在温室中生长4周的NT植物和SSA植物暴露于4℃的温度24小时。结果，NT植物萎蔫，但是SSA植物保持正常(图15A)。低温处理24小时后，将植物在25℃复苏12小时。结果，尽管NT植物几乎不能恢复，仍然是萎蔫的，但是SSA植物几乎恢复到初始状态(图15B)。在低温处理前，NT植物和SSA植物的光合作用效率都是0.8。低温处理后6小时，它们的光合作用效率与在处理前获得的那些光合作用效率没有很大差异，但是从那时起，光合作用效率时间-依赖性地减少。因此，24小时后，在NT植物中，光合作用效率减少大于30％，并且在SSA植物中减少大于20％。低温处理24小时后，将植物在25℃复苏12小时，然后再研究光合作用效率。结果，在复苏后，NT植物的光合作用效率仍然减少到60％。同时，SSA植物的光合作用效率恢复到处理之前的水平，尽管在个体间存在稍微的差异(图15C)。在图15A-15C中，NT：未转化的甘薯植物，SSA4和SSA5：携带pSSA-K载体的植物。

<5-3>二氧化硫抗性

为了研究SSA转基因甘薯植物的二氧化硫(SO₂)抗性，将在温室中生长4周的甘薯植物(品种：Yulmi)的NT植物和SSA植物用500ppb的二氧化硫处理，每天8小时，持续5天。结果，与SSA植物相比，NT植物的叶片由于二氧化硫而萎蔫，并且植物生长也停止。同时，SSA植物保持正常和健康，表现出茂盛的生长(图16)。在图16中，NT：非转化体，和SSA：携带pSSA-K载体的甘薯植物。

SSA植物的二氧化硫抗性通过测定光合作用效率而研究。从二氧化硫处理的第二天起，测定植物顶端第三片叶片的光合作用效率。结果，NT植物(SSA plant)的光合作用效率从0.80(处理前)逐渐减少到第五天的0.47。相反，SSA植物中，光合作用效率在处理的第五天后机会没有减少(仍为0.76)，这表明与NT植物相比，SSA植物保持健康(图17)。在植物用二氧化硫处理后，将它们在温室中生长5天，在生长过程中，检测光合作用效率。结果，NT植物的光合作用效率为0.32，这表明它几乎失去了光合作用功能。同时，SSA植物中，光合作用效率为0.75，这表明它几乎从二氧化硫损伤中恢复了。总之，SSA植物表现出针对最典型的污染物质之一的二氧化硫的增加的抗性。

产业适用性

如在上文中解释的那样，用本发明产生多重胁迫耐受性植物的重组表达载体转化的转基因植物表现出针对氧化胁迫诱导性除草剂、冷损伤、高温、盐损伤或产生氧自由基的各种环境胁迫的强抗性。因此，本发明的载体可以是对于增加农作物的生产力或有用成分的大量生产的极大的贡献。

序列表文本

SEQ.ID.No 1和No 2是在实施例1中进行的SWPA2启动子PCR所用的引物序列。

SEQ.ID.No 3和No 4是在实施例1中进行的mSOD1 PCR所用的引物序列。

SEQ.ID.No 5和No 6是在实施例2-2中进行的SWPA2-1 PCR所用的引物序列。

SEQ.ID.No 7和No 8是在实施例3-2中进行的SWPA2-2 PCR所用的引物序列。

SEQ.ID.No 9和No 10是在实施例3-2中进行的APX PCR所用的引物序列。

SEQ.ID.No 11是在实施例4-2中进行的mSOD1 PCR所用的正向引物序列。

SEQ.ID.No 12是在实施例4-2中进行的CaMV 35S终止子PCR所用的反向引物序列。

SEQ.ID.No 13和No 14是在实施例4-2中进行的APX的DNA印迹所述的引物序列。

SEQ.ID.No 15是源于甘薯(Ipomoea batatas)的氧化胁迫诱导性SWPA2启动子的核苷酸序列。

SEQ.ID.No 16是编码木薯(Manihot seculenta)CuZnSOD的cDNA序列。

The SEQ.ID.No 17是编码豌豆(Pisum sativum)APX的cDNA序列。

本领域的技术人员应该理解，在前述描述中公开的概念和具体实施方案可以容易地用作改进或设计实施本发明相同目的的其它实施方案的基础。本领域的技术人员还应该理解，这样等价的实施方案没有背离本发明在附上的权利要求中提出的精神和范围。

      用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约

                       国际表格

                    微生物保藏证明

                 按照细则Rule 7.1发行致：KWAK，Sang-Soo

韩国生命工学研究院，

#52，Oun-dong，Yuseong-gu，Daejeon，305-333，

韩国

         用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约

                             国际表格

                          微生物保藏证明

                       按照细则Rule 7.1发行致：KWAK，Sang-Soo

韩国生命工学研究院

#52，Oun-dong，Yuseong-gu，Daejeon，305-333，

韩国

序列表

<110>韩国生命工学研究院

<120>生产具有多重胁迫耐受性的植物的重组表达载体以及使用其制备多重胁迫-耐受性植物的方法

<130>4fpo-12-10

<150>KR 10-2004-93945

<151>2004-11-17

<160>17

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SWPA2启动子的正向引物

<400>1

ttaaagcttc catgatcaga tcgata                                         26

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SWPA2启动子的反向引物

<400>2

cgggtctaga ggtcaaagga aaat                                           24

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>mSOD1基因的正向引物

<400>3

gtcgacgtga aggctgaa                                                  18

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>mSOD1的反向引物

<400>4

gagctctatc ctcgcaaacc                                                20

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>特异性SWPA2-1的正向引物

<400>5

atttatcggc aaggaggagg ta                                             22

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>特异性SWPA2-1的反向引物

<400>6

cccggtgagg tgatttgaa                                                 19

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>特异性SWPA2-2的正向引物

<400>7

caccaagtac ccaaaccctc tatt                                           24

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>特异性SWPA2-2的反向引物

<400>8

gttggcgtga ccgtacatta ttg                                            23

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>特异性APX的正向引物

<400>9

ttcggaacaa ttaagcacca a                                              21

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>特异性APX的反向引物

<400>10

aagagggcgg aatacagagt cagt                                           24

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>11

gctgaagctg ttcttaccag                                                20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>12

ctcaacacat gagctaaacc                                                20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>13

agaggaagct cagaggtttt                                                20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>14

ccaccagata gagcaacaat                                                20

<210>15

<211>1325

<212>DNA

<213>甘薯(Ipomoea batatas)

<400>15

aagcttccat gatcagatcg ataataccaa atggtaccac ctaactaggt gatatatatt      60

atgtatgtca ttattttaaa ctgtattaca aagactattt tttcattaat tggtacaaag     120

aaaaattaaa cagaaaagaa aggaaaaaat gactcaccac ctagcaccta gacacctaga     180

caccaagtac ccaaaccctc tattttcaac atctattttc agatgtaaat atgagttgga     240

cgaagaaggt gttagcaatt atttgattaa tcttgctacg ataattatga tccactcact     300

tagtcatttt tttcagacca agacaactag cttgagtttt ttattgtatg tggtcggaac     360

gttttttgta attaaaaaaa taaaagttgc atcattatat atggtagatt aagtaattga     420

tcaatcaacg tttaattttg catttatcgg caaggtggag gttccaactt ccagtcgaac     480

ttagagagtc attggagacc ttgaccagtt aactagcggt gtcgaaaacc tgcacaactt     540

gagatttaat tgcatacctt ttatatatga cgcgttttat ttttttttcc tagaaaataa     600

tttggaagaa aataagaata tgtattctgt gaaagctagg ccaaaacgaa tgtcttttcg     660

tcgttttcgt taaaggttta gatcatattt catctggtcc aacactcaaa cttgtataat     720

ggacgaatta ttagtcattt tagacctacc ggctagcgcg acttttttgt tttccataaa     780

gattcgataa ttgcatggcc agatgcaaag tttgaaattt aatgtttgcc aaatcctatc     840

atacaccaca acacatgtct cagggccaag tggcaccagc aaacattcct gtcataatta     900

atttttttaa tgagaaggag gaaactcaca gctattactc gaaggtatat aatattgagt     960

aaatcttact ttgtgattct agttgacaaa acaccgcaag ataaactata ctaagttcaa    1020

atcacctcac cgggttggct cagattggtt ttttcaatac aagagggggt gtgaactccc    1080

gtgccgacct cttttgaggg acaataatgt acggtcacgc caacctagct tgattttttc    1140

tgacaaatat attactacat atattacacg gtcaaataat taatcaaaaa ataaaaaaag    1200

accccaatta aagtccccaa ccactctcaa atattctatt taagggaaac cttagaggca    1260

attcatgcat cctcaacccc ttcttcttca ttttcttaat cttacatttt cctttgaccc    1320

tcgag                                                                1325

<210>16

<211>801

<212>DNA

<213>木薯(Manihot esculenta)

<400>16

tctcgatctt ctctgtctaa gctctaaagg ggtgctctga gatcacgtaa aacaatggtg      60

aaggctgaag ctgttcttac cagtagtgag ggggttagcg gaacaatctt ctttacccaa     120

gaaggagatg gtcctaccac tgtaactgga aacatttccg gccttaagcc agggcttcat     180

gggttccacg tccatgccct tggagacaca acaaacggtt gcatgtcaac tgggccacac     240

tttaaccctt ctggcaaaga tcatggtgcc cctgaggatg agattcgtca tgctggtgat     300

ctgggaaatg tcactgctgg tgatgatggc actgctagtt tcacaattat tgacaagcat     360

attcctcttt ctggtcaaaa ttcaatcata ggaagggcag ttgttgttca tgcagatcct     420

gatgatcttg gcaggggagg acatgaactc agtaaaacca ccggaaatgc tggtggcaga     480

gtagcatgcg gtattattgg tttgcgagga tagagtgctt ctccagagat caataacaag     540

acaaagacag ctgaaacatg cacagccgga caacctttag aagaacgtta ggagaccatt     600

aactcatttg aataaaagaa agaataatac tgtagttttg gctggtttgg tcttgtgatc     660

tcaagatggt gtatgctttg tatggtttcg tgaagtttat tgaactttga actttttcga     720

atggtagggc ttgctctttg tctggtccaa attcaggccg tggatgtttt atactgcttt     780

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a                                               801

<210>17

<211>1054

<212>DNA

<213>豌豆(Pisum sativum)

<400>17

gaattcggct tgtgctctcc tcgtgtcact agggtttaac ttcttcgttt ttgcttctta      60

gatttcgaga atcgtttgct atgggaaaat cttacccaac tgttagtccc gattaccaga     120

aggccattga aaaggctaag aggaagctca gaggttttat cgctgagaag aaatgcgctc     180

ctctaattct ccgtttggca tggcactctg ctggtacttt tgattccaag acaaagactg     240

gtggtccttt cggaacaatt aagcaccaag ctgagcttgc tcatggtgct aacaacggtc     300

ttgatatcgc ggttaggctg ttggagccta ttaaggagca attccctatt gtgagctatg     360

ctgatttcta ccagttggct ggtgttgttg ctgttgagat taccggtgga cctgaagttc     420

ctttccaccc tggtagggag gacaagcctg agccaccacc tgagggtcgc ttgcctgatg     480

ccactaaggg ttctgaccat ttgagggatg tgtttggaaa ggctatgggg cttagtgatc     540

aggacattgt tgctctatct ggtggtcaca ccattggagc tgcacacaag gagcgttctg     600

gatttgaggg accatggact tctaatcctc tcatttttga caactcatat ttcactgagt     660

tgttgactgg tgagaaggat ggccttcttc agttgccaag tgataaggca cttttgactg     720

actctgtatt ccgccctctt gttgagaaat atgctgcgga tgaagatgtt ttctttgctg     780

attatgctga agcacatctt aagctctctg agcttggatt tgctgaagcc taagtcacag     840

ttgtttggtg tttagagagg agcactgtcc tgaatttcac ataaatttca tagacgttgc     900

ttttattttc aatgtgattc atcttagttg ggtagcattt tggatgtatt ttggaagttt     960

gattgttttc tctattgttg atccttggtt aaataacatt gttaagtggt aatgcccagc    1020

tattgcattt tcctgataaa aaaaaaaccg aatt                                1054