法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-06-25
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N9/12 授权公告日:20101117 终止日期:20130429 申请日:20070429
专利权的终止
2010-11-17
授权
授权
2008-04-23
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-02-27
公开
公开
2007-12-19
地址不明的通知 收件人:黄志达谢文凯 文件名称:补正通知书 申请日:20070429
地址不明的通知
技术领域
本发明属于一种提纯方法，具体涉及一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶的快速提纯方法。
背景技术
脱氧胞苷激酶(dCK)是细胞质内的四大激酶之一，它广泛存在于哺乳动物体内及一些细菌细胞内。细胞体内，dCK可以催化天然核苷的磷酸化，也可催化一些核苷类药物的磷酸化[1]~[4]。研究表明，抗病毒核苷类药物在人体内通过dCK催化进行磷酸化，产生与逆转录酶结合的底物，而发挥药效。但是，在一些患者体内细胞的dCK含量很低，无法催化核苷类药物的磷酸化，因而导致了病毒的抗药性[5]。因此，对核苷类药物进行体外磷酸化，是近年来核苷类药物研究的一大方向。传统的小牛胸腺dCK的提纯主要分为粗提和柱层析两步。所谓粗提就是将小牛胸腺粉碎匀浆，再对匀浆液进行盐析，透析后得dCK粗酶。将得到的dCK粗酶进行多次柱层析，就可得精提的dCK了[6]。该方法的缺点在于柱层析过程较为繁琐，耗时较长，重复性不高，容易导致dCK的失活和较大的实验误差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服了传统的小牛胸腺dCK的提纯方法的繁琐，耗时较长、易使dCK的失活和较大的实验误差的缺陷，提供了一种快速、简便、所提dCK活性较好的小牛胸腺dCK的提纯方法。
本发明提供的是一种利用先进的快速蛋白质层析系统(FPLC)快速提纯小牛胸腺dCK的方法，包括如下步骤：对小牛胸腺进行粉碎匀浆、盐析、透析提取dCK粗酶；再利用FPLC的分子筛凝胶柱和离子交换柱层析对上述dCK粗酶进行分离纯化。
具体步骤如下：
1、小牛胸腺dCK粗酶的提取：
(1)将小牛胸腺用剪刀剪碎，放入破碎仪中与0.001M～0.1M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH 6.0～7.0)一起进行匀浆化。
(2)将上述匀浆液低温超速离心10～20min，取上清液。向上清液中加入1％～10％链霉素硫酸盐溶液进行沉淀。
(3)将上述沉淀液低温超速离心10～20min，，取上清液。向上清液中加入10％～30％的硫酸铵进行沉淀。
(4)将上述沉淀液低温超速离心10～20min，取上清液。向上清液中加入硫酸铵10％～20％进行沉淀。
(5)将上述沉淀液低温超速离心10～20min，留取沉淀物。用少量0.001M～0.1M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH6.0～7.0)溶解沉淀。
用0.001M～0.1M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH6.0～7.0)对上述溶解液进行透析40小时以上，可得小牛胸腺DCK粗酶液。
2、FPLC提纯小牛胸腺dCK
(1)分子筛凝胶层析。将上述粗酶液在FPLC系统中层析，条件是：分子筛凝胶柱：Sephodex G75；洗脱液：0.001M～0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇pH6.0～7.5)；平衡：2个柱床；洗脱：1～2个柱床；流速：0.25～0.75ml/min。所得的锋谱图如图1。
(2)离子交换层析。将上述粗酶液在FPLC系统中用离子交换柱进行分离，条件是：离子交换柱：HiTrip Q FF 1ml；洗脱液A：0.001M～0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH 6.0～7.5)；洗脱液B：0.001M～0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH 9.0～10.0)+1M～2M的NaCl；平衡：10～25个柱床；冲洗：2～5个柱床；洗脱梯度：洗脱液B在5～10个柱床内保持3％～7％，然后在5个柱床内保持10％～15％，然后在5～10个柱床内保持20％～25％，然后在5～10个柱床内保持40％～50％；流速：0.75～1ml/min。阴离子交换层析得到三个峰，分别是流穿峰，A峰、B峰和C峰，所得的峰谱图如图2。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和HPLC酶活表征：
(1)SDS-PAGE凝胶电泳：将阴离子层析和分子筛凝胶层析得到的收集峰进行电泳表征。其中分子筛凝胶层析经过电泳后得到三条条带；阴离子交换层析得到一条条带。条件是：分离胶浓度为7％～15％；浓缩胶浓度为4％～5％；电流为10～15mA(浓缩胶)、20～30mA(分离胶)；电泳时间为40～80min，电泳槽：Ready Gel Precast Gel System(Bio-Rad)。电泳图见图3。
(2)HPLC酶活测定：以单位蛋白的dCK催化CDA的磷酸化的量为一个酶活单位。利用HPLC测定CDAMP的生成量。HPLC层析的洗脱液A为去离子水；洗脱液B为HPLC用甲醇；洗脱梯度为在5～10min内洗脱液A保持95％～100％，洗脱液B保持0％～5％；然后在5～10min内洗脱液A减少至75％～50％，洗脱液B增加至25％～50％；最后在5～10min内洗脱液A保持75％～50％，洗脱液B保持25％～50％。表一是各纯化步骤所得的收率和纯化倍数：
表一各纯化步骤所得的收率和纯化倍数
附图说明
图1为用快速蛋白质层析系统(FPLC)对小牛胸腺dCK粗酶凝胶分子筛层析得到的色谱图。
图2为用快速蛋白质层析系统(FPLC)对凝胶分子筛层析的到的收集液阴离子交换层析所得的色谱图。
图3为用快速蛋白质层析系统(FPLC)阴离子层析所得的蛋白峰进行SDS-PAGE电泳分析所得的电泳图。图中MW为蛋白质分子量标准，Sample为FPLC阴离子层析所得的蛋白峰。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1、小牛胸腺dCK粗酶的提取：
(1)将小牛胸腺用剪刀剪碎，放入破碎仪中与0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH 7.0)一起进行匀浆化。
(2)将上述匀浆液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入10％链霉素硫酸盐溶液进行沉淀。
(3)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入22.5％的硫酸铵进行沉淀。
(4)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入硫酸铵13.7％进行沉淀。
(5)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，留取沉淀物。用少量0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH 7.0)溶解沉淀。
用0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH 7.0)对上述溶解液进行透析40小时以上，可得小牛胸腺DCK粗酶液。
2、FPLC提纯小牛胸腺dCK
(1)分子筛凝胶层析。将上述粗酶液在FPLC系统中层析，条件是：分子筛凝胶柱：Sephodex G75；洗脱液：0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇pH 7.0)；平衡：2个柱床；洗脱：1个柱床；流速：0.5ml/min。得峰谱图。
(2)离子交换层析。将上述粗酶液在FPLC系统中用离子交换柱进行分离，条件是：离子交换柱：HiTrip Q FF 1ml；洗脱液A：0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH 7.0)；洗脱液B：0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH 9.0)+2M的NaCl；平衡：20个柱床；冲洗：5个柱床；洗脱梯度：洗脱液B在5个柱床内保持3％，然后在5个柱床内保持10％，然后在5个柱床内保持20％，然后在5个柱床内保持40％；流速：1ml/min。阴离子交换层析得到三个峰。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和HPLC酶活表征：
(1)SDS-PAGE凝胶电泳：将阴离子层析和分子筛凝胶层析得到的收集峰进行电泳表征。其中分子筛凝胶层析经过电泳后得到三条条带；阴离子交换层析得到一条条带。条件是：分离胶：15％；浓缩胶：5％；电流：10mA(浓缩胶)、20mA(分离胶)；电泳时间：60min；电泳槽：Ready Gel Precast Gel System(Bio-Rad)。电泳结果表明阴离子交换层析得到的峰为一种纯的酶。
(2)HPLC酶活测定：以单位蛋白的dCK催化CDA的磷酸化的量为一个酶活单位。利用HPLC测定CDAMP的生成量。
实施例2
1、小牛胸腺dCK粗酶的提取：
(1)将小牛胸腺用剪刀剪碎，放入破碎仪中与0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH 7.0)一起进行匀浆化。
(2)将上述匀浆液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入10％链霉素硫酸盐溶液进行沉淀。
(3)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入22.5％的硫酸铵进行沉淀。
(4)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入硫酸铵13.7％进行沉淀。
(5)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，留取沉淀物。用少量0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH 7.0)溶解沉淀。
用0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH 7.0)对上述溶解液进行透析40小时以上，可得小牛胸腺DCK粗酶液。
2、FPLC提纯小牛胸腺dCK
分子筛凝胶层析。将上述粗酶液在FPLC系统中层析，条件是：分子筛凝胶柱：Sephodex G75；洗脱液：0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇pH 7.0)；平衡：2个柱床；洗脱：1个柱床；流速：0.5ml/min。得峰谱图。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和HPLC对提纯小牛胸腺dCK进行酶活表征。
实施例3
1、小牛胸腺dCK粗酶的提取：
(1)将小牛胸腺用剪刀剪碎，放入破碎仪中与0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH 7.0)一起进行匀浆化。
(2)将上述匀浆液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入10％链霉素硫酸盐溶液进行沉淀。
(3)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入22.5％的硫酸铵进行沉淀。
(4)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入硫酸铵13.7％进行沉淀。
(5)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，留取沉淀物。用少量0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH 7.0)溶解沉淀。
用0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH 7.0)对上述溶解液进行透析40小时以上，可得小牛胸腺DCK粗酶液。
2、FPLC提纯小牛胸腺dCK
离子交换层析。将上述粗酶液在FPLC系统中用离子交换柱进行分离，条件是：离子交换柱：HiTrip Q FF 1ml；洗脱液A：0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH 7.0)；洗脱液B：0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巰基乙醇，pH 9.0)+2M的NaCl；平衡：20个柱床；冲洗：5个柱床；洗脱梯度：洗脱液B在5个柱床内保持3％，然后在5个柱床内保持10％，然后在5个柱床内保持20％，然后在5个柱床内保持40％；流速：1ml/min。阴离子交换层析得到三个峰。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和HPLC对提纯小牛胸腺dCK进行酶活表征。
机译： 一种测定胸腺激酶活性的方法和试剂盒及其用途
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