一种动态模拟人神经胶质瘤细胞转移的体外模型

技术领域

本发明涉及一种人神经胶质瘤细胞转移模型，尤其涉及一种动态模拟人神经胶质瘤细胞转移的体外模型。

背景技术

神经胶质瘤亦称胶质细胞瘤，是发生于神经外胚层的各种肿瘤，在颅内的各种肿瘤中最为常见，由于神经系统及头部的解剖学特点，神经胶质瘤很少通过脉管系统转移到其他组织，多数为颅内转移。但是，多数胶质瘤呈膨胀性-侵袭性生长，即肿瘤含有膨胀性生长的核心，其周围为弥漫性侵袭的边缘带，这种生长方式的肿瘤常常无包膜，与周围脑组织分界不清，有时在肉眼上似与周围组织有明显的分界，但在镜下观察则发现常侵袭到正常的脑组织中。神经胶质瘤细胞的转移范围很窄，但是常常与周围神经细胞混杂在一起，分不出肿瘤的界线，其结果是临床上很难通过手术将其完整的切除。因此，弄清神经胶质瘤细胞侵袭转移的发生机制并对其进行及早的诊断和预防是进一步提高神经胶质瘤治疗效果的关键所在。

目前，对神经胶质瘤细胞的治疗手段包括手术，放疗等，但总体疗效仍不理想，通过手术切除肿瘤组织后，有的高转移性神经胶质瘤细胞甚至可以通过脉管系统转移到远处其他脏器，术后发生远处转移的神经胶质瘤虽然很少见，仅有300例报道，但这些转移的神经胶质瘤细胞常常对放疗，化疗等不敏感，因而难以被根除，隐患时现。有关神经胶质瘤转移的标志物确立，目前临床上尚没有明确的指标，还不能有效的对神经胶质瘤的转移进行生物学诊断、预防和治疗。

综合分析国内外对肿瘤转移的研究可以发现，目前的关于肿瘤转移包括神经胶质瘤细胞转移的研究主要集中于原发灶、转移灶以及二者的对照研究。但是，细胞的存活需要细胞外基质(ECM)的支持并给予存活信号。若细胞脱离了ECM，细胞则趋向于凋亡，被称为失巢凋亡(anoikis)。神经胶质瘤细胞的侵袭性与它们抵抗失巢凋亡密切相关，抵抗了失巢凋亡的神经胶质瘤细胞侵袭性增加，可以随着脑脊液的回流扩散和转移，因此，研究神经胶质瘤细胞转移或构建相应的试验模型必须考虑到这一因素。经检索，关于动态模拟人神经胶质瘤细胞转移的体外模型的构建以及有效利用动态模拟人神经胶质瘤细胞转移的体外模型对转移的神经胶质瘤细胞的生物学活性进行动态的模拟和系统的研究的论文和专利还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种动态模拟人神经胶质瘤细胞转移的体外模型。利用本发明模型的人神经胶质瘤U251细胞可以实现对神经胶质瘤转移过程与发生机制的研究、转移状态下神经胶质瘤细胞的生物学活性研究、神经胶质瘤细胞治疗的药物筛选研究以及对于肿瘤的预后判断，并且还可进一步推广应用至其它肿瘤的转移过程研究和相关药物的筛选。

本发明从能够获得转移能力的神经胶质瘤细胞必定具有能够脱离细胞外基质的附着而具存活能力这一切入点入手，构建了不依赖于细胞外基质而生存的神经胶质瘤细胞转移模型，并进一步分离获得了具有转移能力的肝癌细胞神经胶质瘤细胞亚系，为转移癌的生物学活性研究和相关的转移机制探讨奠定了基础。

本发明所选取的研究对象U251细胞系是一株人神经胶质瘤细胞细胞系，购自上海生物细胞研究所。

本发明所述动态模拟人神经胶质瘤细胞转移的体外模型，由人神经胶质瘤细胞系U251细胞以抗细胞附着的模型建立、人神经胶质瘤细胞体外转移模型的建立、对所构建的人神经胶质瘤细胞体外转移模型鉴定的步骤构建而成，其特征是：

所述抗细胞附着模型的建立方法是：用95％-100％的乙醇溶解poly-HEMA[poly(2-Hydroxyethyl Methacrylate)]，配成poly-HEMA终浓度为120mg/ml的溶液，65℃震荡混匀8-10小时，得poly-HEMA储备液；然后将poly-HEMA储备液按体积比1∶10的比例用95％-100％的乙醇稀释，制成终浓度为12mg/ml的poly-HEMA工作液，4℃保存，备用；取poly-HEMA工作液均匀铺到细胞培养板或细胞培养瓶的底面上，铺板时poly-HEMA工作液终密度为1mg-3mg/cm²，室温下自然晾干poly-HEMA工作液，得抗细胞附着模型，4℃保存，备用；

所述人神经胶质瘤细胞体外转移模型建立的方法是：选取具有高转移力的、处于对数生长期的人神经胶质瘤细胞系U251细胞，用0.25％胰酶消化成单细胞悬液后，调整细胞浓度为1-5×10⁵个细胞/ml，然后将其分成两组，一组接种至上述抗细胞附着模型中，设定为悬浮细胞组，另一组接种至非抗细胞附着模型的细胞培养板或细胞培养瓶中，设定为贴壁细胞组，待细胞铺匀后置37℃，CO₂培养箱中培养12h-36h，获得的悬浮细胞组细胞即为人神经胶质瘤细胞脱离附着的体外转移模型，获得的贴壁细胞组细胞为人神经胶质瘤细胞贴壁生长的对照模型；

所述对所构建的入神经胶质瘤细胞体外转移模型鉴定的指标特征是：在台盼兰染色确定悬浮细胞组和贴壁细胞组细胞存活率不低于97％的前提下，①悬浮细胞组和贴壁细胞组细胞凋亡率低于5％；②悬浮细胞组与贴壁细胞组细胞形态对比，悬浮组细胞聚集成团，没有突起伸出，细胞仍为圆球型，细胞在悬浮后4h出现聚集，36h细胞聚集更紧，呈现融合状态，随着时间的推移，贴壁组细胞由伸出突起开始逐渐伸展，铺成单细胞层，而悬浮组的细胞形态呈圆形，并逐渐聚集成团，所聚成的细胞团块随着时间的推移越聚越大；③细胞生长曲线显示，贴壁组细胞呈旺盛增殖曲线，悬浮组细胞处于静止状态，既不增殖，也不凋亡，呈基本持平曲线；④流式细胞仪检测各细胞周期的细胞分布显示，悬浮组细胞为处于G0/G1期的静止状态的细胞，而贴壁组细胞大多处于增殖旺盛的G2/M期；⑤悬浮组细胞在再次遇到适于贴壁的环境时，能够在没有任何外界刺激的情况下，重新贴壁，并且重新进入细胞周期和旺盛的增殖状态。

上述构建动态模拟人神经胶质瘤细胞转移的体外模型的方法中：所述乙醇优选使用体积百分比浓度为95％的乙醇。

上述构建动态模拟人神经胶质瘤细胞转移的体外模型的方法中：所述poly-HEMA的铺板密度优选为3mg/cm²。

上述构建动态模拟人神经胶质瘤细胞转移的体外模型的方法中：所述接种于抗细胞附着模型或非抗细胞附着模型的细胞密度优选为4×10⁵个细胞/ml。

上述构建动态模拟人神经胶质瘤细胞转移的体外模型的方法中：所述人神经胶质瘤细胞体外转移模型鉴定的指标特征中，对悬浮组细胞生长曲线绘制时，因细胞的生物学特征与正常细胞不同，所用的试剂的选择亦有不同，细胞培养优选使用不用细胞换液操作的试剂CCK8试剂，以减少操作误差。

上述构建动态模拟人神经胶质瘤细胞转移的体外模型的方法中：所述人神经胶质瘤细胞体外转移模型鉴定的指标特征中，对悬浮组细胞进行流式细胞仪检测时，因悬浮状态的细胞由于聚集成团而不能直接通过流式细胞仪检测，细胞应经500目铜网滤过后再上机检测。

本发明的动态模拟人神经胶质瘤细胞转移过程的体外模型对人神经胶质瘤细胞转移机制的相关研究构建了良好的平台。应用这一模型，可以实现对人神经胶质瘤细胞在转移过程中的生物学习性研究。实验结果显示，应用该模型可以获得模拟转移状态的悬浮后保持生存的人神经胶质瘤细胞(即可以抵抗失巢凋亡的人神经胶质瘤细胞)。悬浮后抱团存活的细胞是一群静止状态的细胞，这些细胞大多位于细胞周期的G0/G1期，通过相互聚集，互相提供存活信号，以维持生存。处于这种聚集存活形式的细胞对放疗、化疗都不敏感，是肿瘤患者体内，能够在脉管系统存活，具有高侵袭力和转移潜能，并能逃逸机体免疫机制和各种治疗的最危险、最顽固的敌人。悬浮抱团存活的细胞重新接种后能够重新贴壁生长，这一过程动态模拟了体内转移的肿瘤细胞遇到合适的环境就会再次贴壁进行生长的状况。这种处于静止期的、抱团维持生存的细胞一旦遇到合适的环境，便能够重新进入细胞周期，进行旺盛增殖。这或许是体内具有高侵袭力的神经胶质瘤细胞的真实状态。

本发明提供的动态模拟人神经胶质瘤细胞转移的体外模型还可以进一步推广应用于人神经胶质瘤以外的其他肿瘤的转移相关的生物学活性研究。

本发明模型所提供的具有抵抗失巢凋亡的神经胶质瘤细胞系能为神经胶质瘤的侵袭和转移研究提供有力的工具。本发明模型还具有操作简便，背景清晰，可重复性好等特点。

本发明的动态模拟人神经胶质瘤细胞转移过程的体外模型突出的特点和优势是：

(1)本发明对于研究神经胶质瘤细胞的侵袭和转移等重要生物学活性具有明显的优势，可以通过本模型对悬浮培养能够存活的转移的神经胶质瘤细胞的形态学改变、增殖状况、细胞周期和凋亡状况等生物学特性进行深入研究，为阐明转移细胞的生物学特性奠定了良好的基础。

(2)本细胞系可以对贴壁生长的细胞和悬浮生长的处于转移状态的细胞对外界治疗措施的敏感度进行对比研究，并可以通过该系统，进行临床上特异性针对转移瘤的治疗药物进行筛选。

附图说明

图1转移状态下神经胶质瘤细胞在不同时间点的形态图

神经胶质瘤细胞U251接种于不加poly-HEMA的培养以及含有poly-HEMA的培养板，以此构建贴壁生长的细胞模型(A-D)以及悬浮培养的抵抗失巢凋亡的转移细胞模型(E-H)。细胞的形态在以下时间点进行了检测0h(A，E)，12hrs(B，F)，24hrs(C，G)，36hrs(D，H)。由图可见，在各个时间点，两组细胞的形态差异巨大，随着时间的推移，贴壁组细胞开始逐渐伸展，铺成单细胞层；而悬浮组的细胞形态呈圆形，并逐渐聚集成团，所聚成的细胞团块随着时间的推移越聚越大。

图2转移状态下神经胶质瘤细胞的生长状态研究——贴壁生长和悬浮生长的U251细胞的生长曲线

由图可见，在细胞接种36小时中，贴壁生长的细胞呈旺盛增殖状态，而悬浮生长的细胞没有明显的增殖现象，生长曲线呈基本持平状态。

图3转移状态下神经胶质瘤细胞的细胞周期变化    

A指贴壁24小时组U251细胞周期的检测，B指悬浮24小时组U251细胞周期的检测，悬浮细胞组和贴壁组细胞在培养24小时后进行收集，并用流式细胞仪进行细胞周期的检测。如图所示，贴壁组和悬浮组细胞的各细胞周期的分布有明显差异，二者G1期的细胞比率分别为44.4％和73.5％，这表明悬浮培养的细胞发生了细胞周期的阻滞。