表皮细胞分化和角化促进剂、以及用于促进表皮角化的功能性饮料食品

技术领域

本发明涉及在干燥皮肤或粗糙皮肤、以及银屑病或干皮病等伴随有角化不全的各种皮肤疾病群中，通过促进表皮细胞的分化来促进表皮的正常角化，可获得使各种皮肤问题正常化效果的表皮细胞分化和角化促进剂、以及用于促进表皮角化的功能性饮料食品。

背景技术

位于皮肤组织最外层的表皮直接曝露于外界，是经受各种物理性、化学性刺激而容易受到伤害的区域。因此，在表皮最深部的基底层产生的表皮细胞向外部方向移动，总是更替为新的细胞。将其称为表皮的更新，在该过程中，表皮细胞经由基底细胞、棘细胞、粒细胞以及角质细胞四个阶段的分化，最后形成皮屑，从皮肤表面脱落。通常，基底细胞至形成角质细胞的角化过程约14天，角质细胞形成皮屑至脱落约14天，共计4～6周，表皮不断地重复更新。

健康的表皮的角质细胞重叠约15层，形成角质层。该角质层具有优异的阻挡功能，防止体内水分蒸发，同时防止外来抗原等异物的侵入或外界刺激传播到体内等，在生物体防御中发挥重要作用。另一方面，在特应性皮炎或干皮病、银屑病等各种皮肤疾病中，健全的角质层的形成受到妨碍，导致该角质层的形成障碍，即角化不全导致皮肤阻挡功能降低，水分蒸发或外来异物侵入、外界刺激容易传播到体内，导致皮肤干燥或各种皮肤疾病的发病或恶化。另外，在更新混乱、角化无法顺畅进行的皮肤中，引起角质层增厚，引起皮肤表面粗糙或僵硬，因此从美容学角度考虑，表皮的角化异常也被视为问题。

为了改善上述皮肤疾病或为了保持健康的皮肤状态，有人提出通过使用某种成分来使皮肤问题正常化的方法。例如专利文献1中提出了在化妆品等中配合可能具有表皮角化促进作用的硅酸相关物质的方案。但是，对显示上述作用的成分的研究虽然在以外用为目的的化妆品或皮肤外用剂领域中进行，但是关于可在饮料食品领域中应用的有效成分尚未发现。也曾考虑将上述皮肤外用剂应用于饮料食品类，但是对于在实际应用时可以获得怎样的作用，这尚未明确。

专利文献1：日本专利第3227378号

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的课题在于提供通过口服摄取可以获得促进皮肤的正常角化作用的功能性饮料食品、以及该功能性饮料食品等中使用的表皮细胞分化和角化促进剂。

解决课题的方法

本发明可提供含有发酵乳乳清作为有效成分的表皮细胞分化和角化促进剂，其中该发酵乳乳清是通过含有乳酸菌的菌体使乳发酵而获得的。

本发明还提供含有上述表皮细胞分化和角化促进剂的用于促进表皮角化的功能性饮料食品。

本发明又提供通过含有乳酸菌的菌体使乳发酵而获得的发酵乳乳清在制备表皮细胞分化和角化促进剂、或用于促进表皮角化的功能性饮料食品中的应用。

发明效果

本发明的表皮细胞分化和角化促进剂、以及用于促进表皮角化的功能性饮料食品是以已经通过口服摄取确认了其安全性的发酵乳乳清作为有效成分，因此可以获得安全、口服性优异的表皮角化促进作用，通过持续摄取等，有望获得抑制由于季节或气候变化产生的皮肤干燥或皮肤粗糙、或者对以特应性皮炎、干皮病或银屑病等角化不全为特征的各种皮肤疾病的各种症状的改善效果等。

附图简述

图1是表示实施例1中进行的对分化标志蛋白的表达的分析结果的显微镜照片。

图2是表示实施例1中进行的mRNA水平的促进角蛋白10表达的效果图表。

图3是表示实施例1中进行的mRNA水平的促进外皮蛋白表达的效果图表。

图4是表示实施例1中进行的分化标志(角蛋白10)的表达量随时间变化的图表。

图5是表示实施例1中进行的分化标志(外皮蛋白)的表达量随时间变化的图表。

图6是表示实施例1中进行的细胞伤害性试验的结果图表。

实施发明的最佳方式

以下进一步详细说明本发明。

本发明的表皮细胞分化和角化促进剂含有发酵乳乳清作为有效成分，该发酵乳乳清是通过含有乳酸菌的菌体使乳发酵而获得的。

上述乳酸菌有属于链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属等的乳酸菌，优选乳杆菌属。具体来说例如有：保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgarius)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)等，可特别优选使用瑞士乳杆菌。

上述瑞士乳杆菌的菌株优选菌体外蛋白酶活性高的菌株。例如优选以Twining等人的方法(Twining，S.Anal.Biochem.143 3410(1984))为基础的、按照Yamamoto等人的方法(Yamamoto，N.等人，J.Biochem.(1993)114，740)测定的U/OD590的值显示为400以上的菌株。还可以使用具有下述细菌学性质的瑞士乳杆菌菌株。

细菌学性质

1.形态学性质：

1)细胞的形状：杆菌；2)运动性：无；3)是否有孢子：无；4)革兰氏染色性：阳性。

2.生理学性质：

1)过氧化氢酶：阴性；2)吲哚生成：阴性；3)硝酸盐的还原：阴性；4)对氧的态度：兼性厌氧性菌；5)由葡萄糖通过单纯乳酸发酵生成DL(-)乳酸，但不产生气体。

6)各种碳水化合物的分解性：葡萄糖：+；乳糖：+；甘露糖：+；果糖：+；半乳糖：+；蔗糖：-；麦芽糖：-；木糖：-；鼠李糖：-；纤维二糖：-；海藻糖：：-；蜜二糖：-；棉子糖：-；水苏糖：-；甘露糖醇：-；山梨醇：-；七叶苷：-；水杨苷：-。

上述优选的瑞士乳杆菌例如有瑞士乳杆菌CM4(Lactobacillushelveticus CM4)菌株(独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心 日本国茨城县筑波市东1-1-1中央第6保藏号：FERMBP-6060，保藏日1997年8月15日)(以下称为CM4菌株)。该CM4菌株根据专利手续上的微生物保藏国际认定相关的布达佩斯条约，以上述保藏号登记，该菌株已经获得专利。

上述发酵乳乳清是将含有上述乳酸菌的发酵乳引子(starter)添加到乳中，适当选择发酵温度等发酵条件，使其发酵获得。

作为有效成分的发酵乳乳清可通过离心、过滤等常规方法的分离操作，由所得发酵乳中分离乳清而获得，但在使用时也可以不分离，在发酵乳的状态下将分离的乳清适当分级、浓缩、纯化等使用，除此之外还可以通过冷冻干燥、喷雾干燥等将该乳清或其浓缩物制成粉末使用。

上述乳酸菌优选以预先预培养的活性足够高的引子的形式使用。初始菌数优选为10⁵～10⁹个/ml左右。

以特定保健用食品等功能性饮料食品或标示表皮角化促进功效的功能性饮料食品的形式利用作为有效成分的发酵乳乳清时，为了使风味良好、口味良好，可以在上述乳酸菌中结合使用酵母。对酵母的菌种没有特别限定，例如优选啤酒酵母等酵母菌属酵母。酵母的含有比例可根据其目的适当选择。

原料乳例如有牛乳、马乳、羊乳、山羊乳等动物乳，以及豆乳等植物乳，作为上述加工乳的脱脂乳、还原乳、粉乳、炼乳等，优选牛乳、豆乳、它们的加工乳，特别优选牛乳或其加工乳。

对乳的固形物浓度没有特别限定，例如使用脱脂乳时，无脂乳固形物浓度通常为3～15％重量左右，从生产性上考虑优选6～15％重量。

上述发酵可通过通常的静置或者搅拌培养、例如在发酵温度25～45℃、优选30～45℃，发酵时间3～72小时、优选12～36小时下，在乳酸酸度达到1.5以上时停止发酵的方法来进行。

本发明的表皮细胞分化和角化促进剂除上述有效成分发酵乳乳清之外，还可以含有其它的具有表皮细胞分化和角化促进作用的公知成分，并且可根据其形态含有赋形剂等各种添加剂。

本发明的表皮细胞分化和角化促进剂中，必须的有效成分是上述发酵乳乳清，因此其口服摄取量可根据给予期间或其持续性等适当选择，以获得所需效果，通常按照上述发酵乳乳清量，是每天1～1000ml/人左右，优选10～200ml/人左右。

本发明的表皮细胞分化和角化促进剂的给予可以是在皮肤角化不全症状发生之后，也可以在预防该症状的时期持续每天或者断续地摄取。

本发明的功能性饮料食品是含有本发明的表皮细胞分化和角化促进剂的食品和饮料，可以制成需求促进皮肤角化有关的预防或改善的例如特定保健用食品、标示了皮肤角化促进功效的功能性饮料食品等。

上述功能性饮料食品中可以添加糖类、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、香料或它们的混合物等的添加物。另外，可以进一步含有在分离发酵乳乳清之前的乳清以外的乳成分。

本发明的功能性饮料食品中，上述本发明的表皮细胞分化和角化促进剂的配合比例可以根据饮料食品的形态或种类适当选择，还可根据其功能性饮料食品的摄取持续性等适当选择，对此没有特别限定，作为有效成分的发酵乳乳清，通常在0.1～100％重量、优选10～90％重量的范围较为恰当。

上述功能性饮料食品的形态例如有酸乳、乳酸菌饮料等发酵乳制品，配合发酵乳乳清或其浓缩物等的各种加工饮料食品、干燥粉末、片剂、胶囊剂、颗粒剂等。

本发明的功能性饮料食品对于其给予量和给予时期没有特别限定，优选以上述有效成分的给予量的程度摄取，例如可以是在皮肤与必须促进表皮角化的环境等接触之前持续或者断续地、以及在接触上述环境之后持续或断续地摄取。

实施例

以下通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不受这些实施例限定。

实施例1

将CM4菌株引子(菌数5×10⁸个/ml)以3％接种于含有固形物比例为9％重量的脱脂粉乳的乳培养基中，在37℃下、在静置状态下发酵24小时，获得发酵乳。将该发酵乳以12000G离心20分钟，除去沉淀，制备发酵乳乳清。使用所得发酵乳乳清进行以下试验。

<分化促进作用评价试验和细胞伤害性试验>

1)方法

(a)培养的表皮细胞和培养基

人正常表皮细胞和培养基(Humedia-KG2)是使用市售商品(KURABO制备)。

(b)细胞培养

将人正常表皮细胞的细胞数在上述培养基中调节为5.652×10⁴细胞/ml，以5ml接种于60mm的培养皿中，在95％空气(V/V)-5％(V/V)CO₂的气氛下、在37℃下静置培养24小时。然后更换为添加了终浓度为0.03、0.1、0.3、1％发酵乳乳清和作为对照的纯净水的上述培养基，静置培养24小时。作为培养时间分析用样品，在更换为含有终浓度为1％的试样的培养基后，静置培养0、1、2、4、6、8天。

(c)通过抗体染色进行分化标志表达的分析

在上述(b)中制备的1％发酵乳乳清的存在下或不存在下培养24小时，然后通过含有4％低聚甲醛的PBS进行细胞固定。用含有10％兔血清的PBS封闭，然后将小鼠抗细胞角蛋白10抗体(Dako制备)或小鼠抗外皮蛋白抗体(YLEM公司制备)在室温下反应1小时。用PBS清洗，然后在室温下与过氧化物酶标记的兔抗小鼠免疫球蛋白抗体(Dako公司制备)反应30分钟。再用PBS清洗，然后用DABSubstrate-Chromogen System(Dako公司制备)进行显色反应。结果如图1所示。

图1中，a表示未添加发酵乳乳清的角蛋白10表达的观察结果，b表示以终浓度1％添加发酵乳乳清时角蛋白10表达的观察结果，c表示未添加发酵乳乳清的外皮蛋白表达的观察结果，d表示以终浓度1％添加发酵乳乳清时外皮蛋白表达的观察结果。

(d)通过实时RT-PCR进行分化标志表达的分析

在上述(b)中，在各浓度的发酵乳乳清的存在下或不存在下培养24小时，然后进行培养时间的分析培养，吸除培养上清，用Hepes缓冲液清洗两次，然后用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN公司制造)从细胞中提取总RNA。对于1ng提取的总RNA，通过Smart Cycler II系统(Cepheid公司制造)，用一步SYBR RT-PCR试剂盒(商品名，TaKaRa公司制备)和表1所示的引物，按照所附说明书实施实时RT-PCR，对角蛋白10mRNA、外皮蛋白mRNA和甘油醛三磷酸脱氢酶(GAPD)mRNA的表达量进行定量。表达量是用被认为在任何细胞中都同等量表达的GAPD mRNA表达量相除，统一规格，并将该值以在将上述(b)中使培养基中的发酵乳乳清浓度为0％的样品(对照)作为1，以相对值的形式表示。结果如图2～5所示。图4和图5中，黑色圆圈表示添加发酵乳乳清的结果，白色圆圈表示未添加发酵乳乳清的结果。

(e)细胞伤害性评价试验

与上述(b)同样，在试样存在下对人正常表皮细胞培养48小时，然后使用Alamar Blue试剂(NACALAI TESQUE公司制造)，按照所附说明书进行细胞伤害性评价。结果如图6所示。

[表1]

图1表明，在未添加发酵乳乳清中未见到的角蛋白10和外皮蛋白的表达通过添加发酵乳乳清得到促进。

图2和图3表明，发酵乳乳清的添加量相关性地使角蛋白10和外皮蛋白的表达增加。

图4和图5表明，发酵乳乳清促进表皮细胞分化标志角蛋白10和外皮蛋白的表达。

图6未见添加发酵乳乳清导致的细胞毒性。

实施例2

为了使实施例1中制备的发酵乳乳清容易饮用，将90质量份该发酵乳乳清、0.25质量份香料、0.05质量份阿司帕坦和9.70质量份水混合，制备含有发酵乳乳清的饮料。使用所得饮料如下进行评价。

<口服摄取对角层细胞面积的评价>

通过使用透明胶带(NICHIBAN公司制备)的粘胶带剥离法，剥离脸左颊的最外层的角层细胞，转印到载玻片上并固定。将其用各种亮绿-龙胆紫(BG)进行染色，将染色图像采集到计算机中。通过BG染色图像的图像分析测定角层细胞面积。

评价试验是由24～43岁、平均年龄为29.4岁的16名男性测试人员进行。首先在饮用试样前实施，求出各测试人员的平均值。接着请他们每天引用150g含发酵乳乳清的饮料，每天饮用、共饮用9周，第9周再进行同样的评价试验，求出各测试人员的平均值。结果如表2所示。

[表2]

表2中，含有发酵乳乳清的饮料摄取组的细胞面积在饮用9周后增加27，显示通过长期饮用含发酵乳乳清的饮料，可以促进皮肤表皮的角质化。