包含替诺福韦、表面活性剂、依法韦仑和恩曲他滨的稳定固定剂量的单位制剂

                        发明背景

本申请涉及使用已知抗病毒化合物依法韦仑(商品名Sustiva，也 称作EFV)、恩曲他滨(商品名Emtriva，也称作FTC)和替诺福韦 DF(disoproxil fumarate，也称作TDF)(商品名Viread，与恩曲他滨 联用以商品名Truvada销售)治疗病毒感染，特别是HIV感染的产品。

Truvada产品通过恩曲他滨和替诺福韦DF的湿法制粒生产(WO 04/64845)，在这种情况中产生化学上稳定的剂型。该产品不含依法韦 仑。

认为使用依法韦仑以及恩曲他滨和替诺福韦DF的HIV疗法是理想 的(下文的″三联″；参见WO 04/64845)。然而，生产商业上可行的三 联产品可能要求最终的产品满足与商品Viread(tenofovir disoproxil fumarate)，Emtriva(恩曲他滨)和Sustiva(依法韦仑) 生物等效的严格FDA要求且该片剂对患者而言具有易于吞咽的适当大 小。

最初单纯将三种药物(活性药物中间体或APIs)合并成通过湿法 制粒生产的单一，尤其是均匀组合物的尝试未能产生化学上稳定的片 剂。在该联用片剂中替诺福韦DF在稳定性研究中非常不稳定并且快速 降解。依法韦仑制剂令人意外地与替诺福韦DF不相容，目前的结果归 因于在制剂中的依法韦仑部分中发现的表面活性剂(十二烷基硫酸 钠)。

进行另一种尝试以便产生三联组合，这次对三部分组合使用干法 制粒并且不使用表面活性剂。这产生了在人体临床试验中难以与依法 韦仑实现生物等效的片剂。在血流中的依法韦仑峰值浓度和总药物药 物接触(Cmax和AUC)均低于对商品对照品Sustiva(依法韦仑)片测定 的参数，本发明者推断在三联组合(依法韦仑/恩曲他滨/tenofovir disoproxil fumarate)片中至少表面活性剂是必须的，从而实现与 Sustiva生物等效。

接下来，通过下列步骤制备联用片剂：使用表面活性剂和其它赋 形剂对依法韦仑成分进行湿法制粒，使用干法制粒单独制备Truvada 成分，彼此混合颗粒，将该混合物压制成片剂且然后对片剂进行薄膜 包衣。令人意外的是，这一手段也无法在商品Sustiva(依法韦仑)与 临床试验物质(即提出的商品三联联用产品)之间产生所需的生物等 效。需要新的和开创性步骤克服多种直接对三联剂型手段的缺陷。

悬而未决的U.S.S.N.60/771,353(相同的提交日期并且特别引入 本文作为参考)涉及解决制备三联剂型中遇到的另一个障碍，即减小联 用产品的大小。尽管现有技术报导了化学上稳定的Truvada制剂的成 功的制备(WO 04/64845)，但是这些制剂含有相对低的赋形剂与API之 比。增加赋形剂的比例并且对三种API组合进行湿法制粒出乎意料地 产生了这样一种制剂，其中替诺福韦DF非常不稳定。正如U.S.S.N.60 /771,353中报导的，认为足量水在进行依法韦仑(与恩曲他滨和替诺 福韦DF相比相对低的溶解度)湿法制粒中的应用导致后两种APIs溶入 低共溶混合物。在制粒过程中低共溶混合物干燥成玻璃状或非晶形产 物，其中替诺福韦DF与晶体API相比在化学上不稳定。提供足量的赋 形剂以改善过量水的作用不符合获得易控比例的三联口服剂型的目 的。

正如U.S.S.N.60/771,353进一步所述的，如下克服这一障碍： 对恩曲他滨和替诺福韦DF组合物进行干法制粒，即在不使它们接触不 稳定量的液态水的情况下对组合物制粒。不使用水(特别是液态水)或 将存在的水减少至基本上不存在(insubstantial)的量消除了形成低 共溶混合物的缺点并且提高了所得药物产品的稳定性。

尽管对恩曲他滨/替诺福韦DF成分进行干法制粒提供了优点，但 是仍然有必要克服替诺福韦DF和Sustiva制剂中使用的表面活性剂的 令人意外的不相容性。

                        发明概述

本发明用于三联组合产品的稳定性和生物等效性的目的已经通过 提供多成分剂型实现，其中一种成分包含替诺福韦DF和任选的恩曲他 滨，而另一种成分至少包含依法韦仑。本发明的另一个实施方案为剂 型，它包含替诺福韦DF成分和表面活性剂成分，所述表面活性剂成分 不会与替诺福韦DF成分发生使其不稳定的接触。

                        发明详述

本发明的剂型包含依法韦仑、恩曲他滨和替诺福韦(tenfovir) DF。正如注意到的，替诺福韦DF和依法韦仑在单独的成分中。恩曲他 滨一般包括在替诺福韦DF成分中，但在其它实施方案中，恩曲他滨存 在于其自身的成分中或与依法韦仑成分混合。其配置对实施本发明而 言并非关键。非常必要的是恩曲他滨存在于剂型中，而替诺福韦DF 成分基本上与依法韦仑成分中的表面活性剂分开。适当将表面活性剂 与替诺福韦DF的接触减少至最低限度的任意方法、添加剂、方法特征 或结构均适合于实施本发明。

术语″成分″意旨整体(physically)上与其它成分结合并且接触 的物理分散单元或隔室。这并不意味着这些单元或隔室在整体上 (physically)不接触。实际上，一般优选它们整体(physically) 接触并且形成单元装置、制品或组合物。结合的程度仅要求有利于组 合物作为单一剂型的口服消耗。例如，本发明并不包括具有在单独的 孔或容器内的Sustiva和Truvada产品的患者药包或主要单独包装溶 液的结合物(不过，当然任选以任意适合于在此情形中的常用方式填充 或包装本发明的组合物)。

一般而言，本发明剂型中的成分便利地构成多层，一般为如例举 的实施方案中所示的双层。然而，如果恩曲他滨存在于其自身成分中， 那么该剂型构成至少三层结构。对每种药物而言不必是单一成分(例如 剂型任选包括对所述成分中各自的2层，总计6层)。因此，剂量单元 包括许多成分的叠层。不一定需要等数量的每种成分，例如每种药物 或药物组合的层，只要所用成分中的总剂量总计为所需用量。

用于空间构造成分的其它方式为合适的，只要实现替诺福韦DF 和表面活性剂的所需分开程度。例如，所述的成分以环状方式构成， 而不是沿片剂的轴形成平面，其中每个环或圆柱包含单独的成分。另 一种选择在于使用压制包衣方法结合成分。

所述的成分一般彼此直接接触，即在它们之间不存在屏障或保护 层。在其它实施方案中，在不相容性成分之间引入屏障。本发明的该 实施方案的合适的实例可以为多隔室胶囊，其中将不相容性成分分散 在单独的隔室中。或者，任选制成在不相容性成分内分配有或分布有 一种包囊的成分的片剂。一般而言，不相容性成分的紧密的直接混合 物是不希望的，除非提供防止替诺福韦DF成分接触表面活性剂的方 式。

在典型实施方案中，空间构造本发明剂型中的成分，以使替诺福 韦DF成分不会不稳定性(destabilizing)地接触依法韦仑成分中的 表面活性剂。″不稳定″意旨替诺福韦DF与能够导致替诺福韦DF发生 药学上不可接受的降解的表面活性剂之间的任何接触。使结构稳定在 于替诺福韦DF和依法韦仑成分的任何空间结构化，它不会导致产生″ 药学上不可接受的量″的如下降解产物中任意一种。不稳定接触在于导 致产生″药学上不可接受的量″的下列降解产物的空间结构化。

替诺福韦DF与含表面活性剂的成分之间允许的接触的空间几何 形状和条件基本上不受限制。这种空间几何形状称作″稳定的结构″或 以不同方式描述为不含如下所定义的″不稳定接触″构型。存在许多方 式，其中可以利用本发明的中心观察结果(即十二烷基硫酸钠使替诺福 韦DF不稳定)防止药学上不可接受水平的替诺福韦DF降解产生。

此外，当恩曲他滨存在于替诺福韦DF成分中时，允许的接触还在 于不会产生药学上不可接受量的恩曲他滨降解产物。

替诺福韦DF的″降解″在于产生-药学上不可接受的量的-至少一 种降解产物，即一-POC PMPA、二聚体或混合的二聚体。将FTC的″降 解″定义为产生-药学上不可接受的量的FTU。这些降解产物如下所示。

一-POC PMPA

一-POC PMPA

二聚化降解产物

二聚体

混合的二聚体

FTU具有如下结构：

将″药学上不可接受的量″定义为如下各降解产物的量。检测到任 选绝对或增加量的降解产物。降解产物的绝对量或总量单纯为在测试 制品中发现的量。增加量为产物中出现超过存在于API原料中的(如果 有的化)降解产物的额外量。此外，在2个时间点测定任选降解产物的 量。一个是在投放入市场时。另一个是在如下所述的条件，即如下所 述的贮存期限中接触储存条件后。

投放时的总量(第一次商业销售)

不超过约3％，一般约1.5％一-POC PMPA；

不超过约1％，一般约0.5％二聚体；

不超过约0.5％，一般约0.25％混合的二聚体。

低于约0.5％，一般约0.2％的FTU

贮存期限时的总量(在25℃/60％RH下贮存24mo.)

不超过约10％，一般约5％一-POC PMPA；

不超过约2％，一般约1％二聚体；

不超过约2％，一般约1％混合的二聚体；

不超过约4％，一般约2％的FTU

投放时的增加量(第一次商业销售)

不超过约2％，一般约0.5％一-POC PMPA；

不超过约0.6％，一般约0.1％二聚体；

不超过约0.3％，一般约0.05％混合的二聚体；

低于约0.4％，一般约0.1％的FTU

贮存期限时的增加量(在25℃/60％RH下贮存24mo.)

不超过约9％，一般约4％一-POC PMPA；

不超过约1.6％，一般约0.6％二聚体；

不超过约1.8％，一般约0.8％混合的二聚体；

不超过约3.9％，一般约1.9％的FTU。

降解产物的百分比为通过HPLC保留时间比较确定的降解产物的 量。在HPLC保留时间比较中，在已经证实对依法韦仑、恩曲他滨和替 诺福韦DF具有特异性的试验中要求在片剂中观察到的主峰的保留时 间在2％参比标准制剂中的主峰的保留时间内，所述的参比标准制剂包 含依法韦仑、恩曲他滨和替诺福韦DF。通过HPLC试验测定，通过用 替诺福韦DF+三种降解产物的总量除各降解产物的量确定百分比。

将这些参数用于评价测试组合物是否满足稳定接触的要求。例如， 任选将三联剂型设计成分散于依法韦仑基质内的替诺福韦DF成分的 压制颗粒的压缩块(slug)的成形制品。各种压缩块的大小可以用于 制备组合物。然后可以测试潜在产品的这种相互影响因素，或在上述 条件下储存且然后测试，以便检测替诺福韦DF和/或FTC降解产物的 产生。如果在投放时在任意上述4种检测范例下所得产品不含超过指 定近似界限的所列4种污染物中的任意一种或多种，那么可以认为这 种接触是稳定的。当然，技术人员可以采用更严格的标准，但这一标 准为选择的问题并且不应限制本发明的范围。

在优选的实施方案中，合并恩曲他滨和替诺福韦DF并且通过干法 制粒制备该成分(U.S.S.N.60/771,353)。在优选的实施方案中，包含 干法制粒的替诺福韦DF和恩曲他滨的组合物用于本发明剂型中的一 种成分中。

干法制粒本身为众所周知的制药方法。一般而言，将API与赋形 剂和润滑剂赋形剂合并且然后压制形成团块物。一般随后将该团粉碎 或磨碎，然后过筛而得到所需颗粒大小。将粒状产物压制成片，填充 入胶囊，或者，也可以常规方式制成单位剂型。

用常规设备压制成团块物。一般而言，使API和赋形剂通过辊筒 式压制设备。然而，任选使用用于压制API混合物，例如压制成压缩 块(或″压缩成块″)的其它装置。

干制粒法为一种方法，其中将API和选择的赋形剂的干燥组合物 压制成团块物，如果必要，将其粉碎或磨碎，且然后任选过筛而产生 所需大小的颗粒。用常规设备压制成团块物。一般而言，使API和赋 形剂通过辊筒式压制设备。然而，可以使用其它压制API混合物，例 如压制成压缩块(或″压缩成块″)的装置。

包含干燥成粒的恩曲他滨和替诺福韦DF的组合物为干制粒法的 产物。该组合物基本上保留了晶体APIs并且基本上不含干燥的低共溶 恩曲他滨/替诺福韦DF。它一般包含低于约15％重量的干燥低共溶混合 物，通常低于约10％且一般低于约5％。

在没有不稳定量的水存在下进行干制粒法，″不稳定 (destabilizing)″为能够导致产生如本文定义的药学上不可接受的 替诺福韦DF和/或FTC降解的液态水的量。如果本发明的剂型包括干 燥成粒的恩曲他滨/替诺福韦DF成分，那么在最终剂型中允许降解产 物的量仍然与上述所列的相同，即共同或单独的水暴露(exposure) 和接触(contact)量不会产生未满足上述标准的降解产物。当然，这 是一种首次测试干颗粒在其降解产物水平方面的选择，并且如果它们 通过，就将其配制成本发明的剂型，且随后测定接触是否产生任何使 所得剂型超出建立的参数的降解产物增加。

结合、夹带或吸收水通常存在于赋形剂中。这种水不会对替诺福 韦DF的稳定性产生明显的不良影响且由此不将其从任选用于本发明 剂型的干颗粒中排除。一般而言，来自任何来源，例如化学反应，缩 合，夹带冰等的液态水(加入的或原位生成的)应从制粒中排除。然而， 在制粒过程中任选加入少量的液体水。这些量一般可低于约5％重量， 一般低于约1％重量，不过，产生或提供水。水在最终成粒产物中的存 在量约达10％重量(Karl Fischer)，但优选更低，低至0.1％重量。然 而，水的允许量可以根据制粒中的其它因素的不同而改变，例如赋形 剂的类型、温度等。例如，如果包括吸湿性赋形剂，那么它将添加的 水转化成结合形式。所有一切非常必要的是水不要导致终产物中替诺 福韦DF和/或恩曲他滨降解。一般而言，从制粒前期阶段(制备直接用 于制粒的组合物)和制粒过程自身过程中排除水。

无水或″干″并不意味着不存在液体。使用有机溶剂制粒也是切实 可行的，只要不包括不稳定量的水。

干法制粒产生包含最少量水的产品。根据干燥损失(LOD)或通过 Karl Fischer法确定由此制成的产品颗粒或剂型中的水量。本发明组 合物的LOD约为15％、约10％、约5％或一般低于约3％重量。Karl Fischer 水约为0.1-10％重量，通常低于约5％重量或低于约2％。与颗粒相反， 最终制剂中的水量与颗粒水和随后加工步骤，诸如包衣过程中使用的 最少水量有关。这些在非制粒的后续步骤中加入的水量一般不会影响 恩曲他滨/替诺福韦DF APIs的稳定性且由此可以允许进行相当程度的 变化。

下述生产方法涉及制备包含依法韦仑，恩曲他滨和替诺福韦DF 的三联片剂。在这一具体的实施方案中，将最后两种药物置于片剂的 一个部分中，该部分与包含依法韦仑的片剂部分分离，但接触。然而， 应理解任选将作为本发明实施方案的片剂中的恩曲他滨和替诺福韦 DF成分制成独立的产品并且不一定与依法韦仑成分装配在一起。在这 种选择中，将下述恩曲他滨/替诺福韦DF干法制粒中间体单纯压制成 片剂或通常加工成其它常规的单位剂型，诸如胶囊、扁囊剂、栓剂等。

将本发明的剂型储存在容器中，优选在干燥剂存在下储存，诸如 一般足以在剂型上维持约10％，优选约5％RH下的用量的硅胶。

材料

将依法韦仑粉末掺合物、FTC/TDF粉末掺合物和薄膜包衣的双层 EFV/FTC/TDF片的定量组成分别列在表1、表2和表3中。如果值低于 0.99，那么因药物含量因素(DCF)调整依法韦仑、恩曲他滨和替诺福韦 DF的量，同时伴随在每次制粒中减少微晶纤维素的量。

表1.依法韦仑粉末掺合物的定量组成

表2.FTC/TDF粉末掺合物的定量组成

^a在生产过程中掺入制剂的粒内和粒外部分。

表3.薄膜包衣的双层EFV/FTC/TDF片的定量组成

^a在薄膜包衣过程中除去的水。

赋形剂均为药典级材料：

依法韦仑湿法制粒

使用Niro-Fielder PMA-400设备链对依法韦仑进行湿法制粒。将 依法韦仑、微晶纤维素和十二烷基硫酸钠(表1)加入到PMA-400中并 且掺合3分钟。向预混合物中加入交联羧甲基纤维素钠和羟丙基纤维 素(表1)并且再掺合2分钟。加入纯水以便形成合适的颗粒，随后在 加入水后再添加湿团。表4中列出了用于有代表性的两批和子部分的 制粒参数概括。所有子部分使用的水与依法韦仑的比值为1.30，但就 AB509混合物(Mix)C而言，其使用的水与依法韦仑的比值为1.25。

表4.依法韦仑湿制粒法参数概括

^a在干燥前合并每批的混合物A、B和C。

一般而言，磨碎湿颗粒，然后干燥至小于或等于1.5％的LOD。磨 碎干燥颗粒并且与硬脂酸镁掺合(表1)。

将根据依法韦仑制粒的LOD得到的堆密度、颗粒大小和水分含量 列在表5的前三行中(B批号为依法韦仑产品，C批号为恩曲他滨/替诺 福韦DF)。通过使用声频筛(Model L3P，ATM Corporation，Milwaukee， WI，USA)经3-英寸直径筛过筛10-克样品测定颗粒大小。使用如下US 标准筛目大小(孔)：#20(850μm)、#30(600μm)、#40(425μm)、 #60(250μm)、#80(180μm)和#250(63μm)。将搅拌和脉冲设定在 7并且过筛时间为5分钟。通过计算过筛前后的重量差异确定保留在 筛和精细采集器上的粉末量。根据过筛分布的对数加权计算几何平均 颗粒大小。

通过给100-mL刻度量筒填充样品并且计算每单位体积中的空量 筒与满刻度量筒之间的重量差确定堆密度。

通过使用加热灯/平衡系统Model LP16/PM400，Mettler-Toledo， Columbus，OH，USA)在85℃下将2.5g样品加热15分钟通过干燥损 失(LOD)进行湿含量测定。

颗粒具有类似的堆密度(0.54-0.56g/mL)和类似的几何平均颗 粒大小分布(215-268μm)。最终掺合物的LOD值一致性地为0.98- 1.80％。依法韦仑颗粒的各筛分布如表6中所列。

表5.依法韦仑粉末掺合物和恩曲他滨/替诺福韦DF粉末掺合物物 理特性的概括

表6.依法韦仑和FTC/TDF粉末掺合物的颗粒大小分布

恩曲他滨/替诺福韦DF干法制粒

使用Gallay掺合器将恩曲他滨、微晶纤维素、替诺福韦DF和交 联羧甲基纤维素(表2)在650L输送料斗中掺合10分钟。加入硬脂酸 镁(表2)并且再掺合5分钟。然后将这一预掺合物转入安装了锥形阀 门卸载装置的320-L Matcon料斗中以便有助于将物质转入辊筒式压制 料斗。

使用具有250mm直径×50mm宽平滑辊筒的Gerteis Macro-Pactor 250/25/3型压制预掺合物。对所用批量使辊缝厚度(2 mm)、辊速(10rpm)、压制力(4kN/cm)、振荡研磨速度(75rpm顺时 针方向和逆时针方向)和振荡研磨筛孔(1.25mm)保持恒定。振荡研磨 旋转角对所用批号而言也相同，顺时针方向150°和逆时针方向140°。

所有三批中在进料入辊筒压制机的同时没有物质操纵控制问题。 整个辊筒压制过程在没有任何显而易见的设备上热蓄积、产物累加或 熔化的情况下进行。然后将颗粒与粒外交联羧甲基纤维素钠(总量的 34％)和硬脂酸镁(总量的47％)掺合。

恩曲他滨/替诺福韦DF干颗粒的颗粒大小、堆密度和LOD对三批 而言均类似并且列在表5中(底行3个格)。几何颗粒大小极为类似， 在330-344μm。堆密度在0.59-0.60g/mL范围。最终掺合物的LOD 值一致性地在0.91-1.02％。最终粉末掺合物具有明显一致的物理特 性。

依法韦仑和替诺福韦DF颗粒各自具有任选在约100-600μm的 几何平均颗粒大小，任选在约0.1-1g/mL的堆密度和任选在约0.1 -10％重量的LOD值。

最终掺合物

基于恩曲他滨/替诺福韦DF干法制粒的产率适当调整依法韦仑颗 粒和粒外硬脂酸镁团快。将依法韦仑颗粒和恩曲他滨/替诺福韦DF干 颗粒在3立方英尺的V-型掺合器内掺合10分钟。加入硬脂酸镁并且 再掺合5分钟。在掺合后从10个不同位置上取最终粉末掺合物的样品 并且分析掺合物均匀性。依法韦仑和恩曲他滨/替诺福韦DF最终粉末 掺合物对所有三种活性组分均表现出可接受的掺合物均匀性和均一 性，表明制剂的鲁棒性(robustness)与恩曲他滨/替诺福韦DF干颗 粒和依法韦仑颗粒的颗粒大小或堆密度无关。制粒和掺合操作步骤对 大规模配制而言令人满意。

片芯压制

使用配有上光面/下凹凸″123″胶囊形(20.0mm×10.4mm)冲头的 Stokes Genesis Model 757，41台式双层压片机将依法韦仑/恩曲他 滨/替诺福韦DF最终粉末掺合物压制成片剂。片芯的靶团块为1550 mg。在压制运行过程中从最少20个等间隔的位置取芯部片剂的样品并 且分析含量均匀性。一般而言，所有粉末掺合物在旋转式压片机上在 片剂硬度、脆性、片剂厚度、片剂外观和片重变异方面压制得令人满 意。以约500片/分钟(12rpm压制速度)或约0.8kg/分钟的速率进行 压制操作以便递送令人满意的片重均匀性。

薄膜包衣片

通过对商购制剂进行常规筛选选择合适的薄膜包衣材料。该活动 充分属于本领域技术人员的能力范围。将每批片芯分成两个包衣亚批， 将其在使用双喷嘴喷雾系统的48-英寸Thomas Engineering COMPU-LAB包衣锅内进行薄膜包衣。使用在制备24小时内使用的15％ w/w含水包衣混悬液Opadry II Pink对所有片剂芯进行薄膜包衣。使 用相当于1.5-2.3g/分钟/kg片剂校准喷雾速率的180g/分钟的靶 喷雾速率将所有片剂芯包衣至靶重量增加3.0％。

                  降解产物的HPLC测定

使用外参比标准品通过HPLC测定依法韦仑/恩曲他滨/替诺福韦 DF片(EFV/FTC/TDF片)的EFV、FTC和TDF。如果合适，使用应用相对 响应因子的面积校准测定EFV、FTC和TDF的降解产物。通过比较其与 参比标准品的保留时间证实EFV、FTC和TDF的属性。

                  标准品和样品溶液的制备

标准品和样品溶剂

25mM磷酸盐缓冲液，pH3

称重并且将无水3.4g磷酸二氢钾转入1L量瓶。加入约800mL 水并且混合至溶解。使用磷酸将pH调整至3.0±0.1，然后使用水稀释 至体积量。

样品溶剂(40∶30∶30 25mM磷酸盐缓冲液，pH3∶乙腈∶甲醇)

合并400mL 25mM磷酸盐缓冲液，pH3、300mL乙腈和300mL 甲醇并且混合。使其平衡至环境温度。

50∶50乙腈∶甲醇

合并500mL乙腈和500mL甲醇并且混合。使其平衡至环境温度。

标准溶液

精确称重约60mg EFV参比标准品、20mg FTC参比标准品和30mg TDF参比标准品并且转入100mL量瓶。向该瓶中加入约80mL样品溶 剂(40∶30∶30)并且混合或超声处理至溶解。用样品溶剂稀释至体积量 (40∶30∶30)并且充分混合。每种成分的终浓度约为0.6mg/mL EFV、 0.2mg/mL FTC和0.3mg/mL TDF。

系统适应性测试溶液

灵敏度检验标准

通过将约10mg FTU真实物质精确称入100mL量瓶制备10μg/mL FTU储备溶液。加入样品溶剂(40∶30∶30)至约80％的体积并且混合或超 声处理至溶解。用样品溶剂(40∶30∶30)稀释至体积并且充分混合。将 10mL该溶液吸移入100mL量瓶。用样品溶剂(40∶30∶30)稀释至体积 并且充分混合。制备包含0.2mg/mL FTC和0.2μg/mL FTU(相对于 FTC 0.10％)的灵敏度检验标准品。将20mg FTC精确称入100mL量瓶。 使用A级移液管将2.0mL FTU储备溶液转入同一量瓶。再向该瓶中加 入样品溶剂(40∶30∶30)并且混合或超声处理至溶解。用样品溶剂 (40∶30∶30)稀释至体积并且充分混合。或者，可以向标准溶液中加入 2.0mL 10μg/mL FTU，然后稀释至体积。

EFV/FTC/TDF片的样品制备

通过分析由10片制备的组合物溶液测定EFV/FTC/TDF片浓度和降 解产物含量。

在样品溶液中各成分的终浓度约为0.6mg/mL EFV、0.2mg/mL FTC 和0.3mg/mL TDF。

a)将10片放入1L量瓶并且向量瓶加入400mL 25mM磷酸盐 缓冲液，pH3。

b)通过剧烈搅拌混合约75分钟。

c)向量瓶中加入50∶50乙腈-甲醇至低于体积标记约2cm。

d)通过混合1小时将该溶液平衡至环境温度。用50∶50乙腈∶甲 醇稀释至体积。通过倒置量瓶或使用磁性搅棒搅拌充分混合。

e)使用带有注射器的0.45μm注射器式滤器过滤约10mL的步 骤(d)用于接下来的稀释。弃去前2mL滤液。

f)使用A级移液管将5.0mL来自步骤(e)的滤液转入50mL量瓶 并且使用样品溶剂(40∶30∶30)稀释至体积。充分混合。

色谱法

1.使用安装了UV检测器和电子数据采集系统的HPLC。

2.使用HPLC柱，4.6mmi.d.×250mm长，填充有C12反相，4μm 粒径，80孔径。

3.流动相缓冲液：制备20mM乙酸铵缓冲液，pH4.6；根据需 要使用乙酸调整pH。

4.流动相梯度：在67分钟内用99∶1-1∶99的流动相缓冲液∶乙 腈洗脱。

5.峰检测：在262nm处的UV。

6.进样体积：10μL。

在所述的色谱条件下，FTC、TDF和EFV的保留时间一般分别为11、 33和50分钟。

进样顺序

注射样品空白溶剂至少2次以确保平衡柱并且鉴定任何潜在的人 为峰。

注射包含约0.10％FTU的灵敏度检验标准品或标准溶液以便确定 检测的灵敏度。

注射标准溶液1(R1)，重复5次，随后注射一次标准溶液2(R2)。 根据标准化溶液注射量计算理论塔板数和拖尾因子。

为了鉴定、浓度和降解产物测定，进行一式两份的样品溶液注射。

所有样品溶液之间必须插入标准溶液进样。一般而言，推荐在插 入标准品进样之间不超过10次样品溶液进样。

系统适应性

理论塔板数和拖尾因子

对来自根据标准溶液色谱图的EFV、FTC和TDF峰计算理论塔板(N) 数和拖尾因子(T)。在最新的美国药典中定义了用于N和T测定的公式。 这些参数值必须满足如下标准：N≤40,000和0.8≤T≥2.0。

灵敏度检验

灵敏度检验使用以约0.10％存在的灵敏度检验标准品中的FTU峰。 使用应用于使用计算各降解产物百分比的灵敏度检验标准的适当 RRF(列在表2中)计算FTU峰的面积百分比。将该结果与用于灵敏度检 验标准的FTU理论百分比如下进行比较：

其中：

FTU_测定值＝对灵敏度检验标准品或标准溶液测的FTU面积百分比

FTU_理论值＝对灵敏度检验标准品或标准溶液测的FTU理论面积百 分比

灵敏度必须在0.70-1.30。

评价和计算

降解产物的鉴定

使用适当的检测参数(诸如峰阈值、最小峰面积等)从而能够检测 以0.05％或0.05％以下存在的峰。通过下列步骤鉴定存在于样品溶液进 样的色谱图中EFV、FTC和TDF的杂质和降解产物：注意观察到的次级 峰的相对保留时间(RRT)，减少统计与样品无关的任何峰。仅对降解产 物进行定量。计算来自所有样品溶液进样结果的平均值，至最接近 0.01％。在未检测到降解产物或其低于一次进样和/或样品积分阈值的 情况中，仅使用计算中的定量结果(即不作为零值处理)。

EFV的潜在杂质和降解产物的RRTs和相对响应因子(RRF)值如表1 中所示并且用黑体字表示降解产物。FTC的杂质和降解产物如表2中 所示并且用黑体字表示降解产物。TDF的杂质和降解产物如表3中所 示并且用黑体字表示降解产物。

由于RRT可以改变，如果需要，可以通过与真实物质(或与参比标 准品中的杂质和降解产物峰)比较证实杂质和降解产物的属性。

降解产物含量测定

FTC降解产物的定量

使用下列公式测定在样品溶液进样色谱图中观察到的FTC的每种 降解产物的水平：

其中：

I＝降解产物峰面积

TPA＝总峰面积(FTC和所有相关降解产物的面积，不包括杂质和 后生物(artifacts))，通过RRF校准

RRF＝相对于FTC的相对响应因子

8.4.3 TDF降解产物的定量

使用下列公式测定在样品溶液进样色谱图中观察到的TDF的每种 降解产物的水平：

其中：

I＝降解产物峰或未指定峰的面积

TPA＝总峰面积(TDF主峰，所有相关降解产物和所有未指定峰的 面积，不包括杂质和后生物)，通过RRF校准

RRF＝相对于TDF的相对响应因子

结果和报告

降解产物含量

各自报告所观察到的每种降解产物结果的平均值，至最接近 0.01％。报告EFV，FTC和TDF总降解产物含量，分别至最接近0.1％的 作为观察到的所有降解产物峰的平均水平总和。就在低于0.05％水平 下发现的降解产物而言，报告其水平为痕量并且不把它们的水平包括 在计算总降解产物含量中。

参考文献：

美国药典(United States Pharmacopeia)<621>

药典论坛(Pharmacopeial Forum)26(4)2000

表1.EFV相关杂质和降解产物

^a近似RRTs，并且该值相对于TDF峰

^bEFV相关降解产物的RRFs相对于EFV

^cEFV相关降解产物

^dEFV前SR-695洗脱物(约0.1分钟间隔)

用黑体字标记降解产物

表2.FTC相关降解产物

^a近似RRTs，并且该值相对于TDF峰

^bFTC相关降解产物的RRFs相对于FTC

^cFTC相关降解产物

表3.替诺福韦DF相关降解产物

^a近似RRTs，并且该值相对于TDF峰

^bTDF相关降解产物的RRFs相对于TDF

^cTDF相关降解产物