表面带有抗转化生长因子β2抗体膜的人工晶状体及其制造方法

具体实施方式

实施例1：

本实施例表面带有抗转化生长因子β2抗体膜的人工晶状体，是一种在人工晶状体的光学部和袢的表面上带有抗转化生长因子β2抗体膜的人工晶状体。

本实施例中的抗转化生长因子β2抗体是一种免疫球蛋白，它能通过免疫细胞生物学的途径抑制后发性白内障，因为引起后发性白内障的关键因子是转化生长因子β2，故采用抗转化生长因子β2抗体则能以其高度的特异性来抑制转化生长因子β2的作用、抑制细胞外基质沉积和纤维化，从而对以纤维化为主的后发性白内障起到其他药物所欠缺的靶向作用，并且该人源性的抗体不具有免疫原性和毒性。因此，本实施例表面带有抗转化生长因子β2抗体膜的人工晶状体植入眼内、进入囊袋之后，其表面上的抗转化生长因子β2抗体膜即产生抑制后发性白内障的作用，且它既不对眼内其它组织产生毒性作用，又能提高人工晶状体的生物相容性，从而减少了白内障术后并发症，并有利于术后远期视力的恢复。

通过众多试验证实，本实施例人工晶状体是不宜通过物理吸附法或化学键合法制得，前者是抗转化生长因子β2抗体膜不能长期稳固在人工晶状体表面，而后者会使抗转化生长因子β2抗体的生物活性大幅下降、甚至丧失；但一种静电层层自组装的方法是可行的，该方法是利用蛋白质在特定的pH条件下能带电荷、具有聚电解质的特性，并通过交替地使用带正电荷、带负电荷的聚电解质，即可使抗转化生长因子β2抗体以一层、一层薄膜的形态沉积到人工晶状体的表面；该人工晶状体的表面因此而改性、能在使用过程中兼有安全靶向，并稳定持久地抑制后发性白内障的作用。

本实施例表面带有抗转化生长因子β2抗体膜的人工晶状体的制造方法包括以下的步骤：

取用人工晶状体，其材料可取聚甲基丙烯酸甲酯、硅凝胶、软性疏水性聚丙烯酸酯等中的一种，本实施例取用软性疏水性聚丙烯酸酯为材料的人工晶状体；先分别用无水乙醇、去离子水清洗后，再用超声清洗仪清洗1-3分钟，然后以去离子水漂洗后在60℃真空干燥24小时；接着将其放入低温等离子体发生器中，发生器功率为60W，射频为13.5kHz，其内气体是二氧化碳，气体压力维持在50-60Pa，以等离子体辉光放电处理2～5分钟，然后取出该人工晶状体、其表面已带有羧基官能团；再将其浸入0.01mol/L的氢氧化钠溶液中15分钟，使羧基转化为羧基离子，去离子水漂洗，氮气吹干，获得带负电的人工晶状体表面；接着将该表面带负电的人工晶状体浸入溶液浓度为5mg/mL的带正电的多聚赖氨酸水溶液中60分钟后，以去离子水漂洗，氮气吹干；此后再浸入溶液浓度为500μg/mL的带负电的抗转化生长因子β2抗体的PBS溶液(PBS溶液浓度0.05mol/L，pH＝7.4)中，吸附30分钟，再用PBS溶液漂洗，氮气吹干；重复以上的交替步骤即可获得表面带有1-20层抗转化生长因子β2抗体的人工晶状体；最后将它取出，并用去离子水清洗，氮气吹干，室温下真空干燥密封包装。

本实施例的人工晶状体的结构和制法可从图1中看到；该图是本实施例人工晶状体表面静电层层自组装过程的示意图，它是以软性疏水性聚丙烯酸酯的人工晶状体为例，在表面构建(多聚赖氨酸/抗转化生长因子β2抗体)₂多层膜，亦即组装了两个双层(多聚赖氨酸/抗转化生长因子β2抗体)；图中以1-4表示制造过程的4个步骤，a表示软性疏水性聚丙烯酸酯人工晶状体，b，c表示各个步骤中所用到的试剂，+表示正电荷，-表示负电荷，其中，1表示二氧化碳气体等离子体处理后使人工晶状体表面产生羧基而带负电荷，2表示带正电荷的多聚赖氨酸组装到人工晶状体表面，3表示在pH＝7.4条件下带负电荷的抗转化生长因子β2抗体组装到人工晶状体表面，4表示在人工晶状体表面再次交替组装多聚赖氨酸/抗转化生长因子β2抗体，b表示带正电荷的多聚赖氨酸，c表示在pH＝7.4条件下带负电荷的抗转化生长因子β2抗体。

实施例2：

本实施例所用的人工晶状体为聚甲基丙烯酸甲酯或软性疏水性聚丙烯酸酯材料中的一种，与实施例1中不同的是人工晶状体表面预处理获得负电荷的方法，其后组装过程所用的试剂和方法也与实施例1相同，即为带正电的多聚赖氨酸和带负电的抗转化生长因子β2抗体。与实施例1的表面预处理方法的不同之处在于：在人工晶状体按实施例1方法清洗并烘干后，将其浸入30％氢氧化钠水溶液中80℃水解30分钟后，其表面可产生大量羧基离子，该表面在水溶液条件下呈负电性。

本实施例与实施例1的共同之处在于人工晶状体表面经表面预处理后均带有负电荷，表1是此后在人工晶状体表面选用不同于多聚赖氨酸的带正电荷的其它聚电解质(PAH，或壳聚糖，或明胶)和带负电荷的抗转化生长因子β2抗体进行静电层层自组装的例子，每一例均能制造出本发明的表面带有抗转化生长因子β2抗体膜的人工晶状体。表1中所用带正电的聚电解质是不同于实施例1和实施例2中所用的多聚赖氨酸的其它聚电解质；表1中溶解抗转化生长因子β2抗体所用的PBS溶液pH均高于6.8，在此条件下抗转化生长因子β2抗体带负电。

表1

实施例3：

取用人工晶状体，其材料可取聚甲基丙烯酸甲酯、硅凝胶、软性疏水性聚丙烯酸酯等中的一种，如硅凝胶为材料的人工晶状体，按实施例1方法清洗并烘干后，将其放入低温等离子体发生器中，发生器功率为60W，射频为13.5kHz，其内气体是氨气，气体压力维持在50-60Pa，以等离子体辉光放电处理2～5分钟，然后取出该人工晶状体，其表面带有氨基官能团；将其浸入浓度为1mol/L的盐酸溶液中30分钟，使氨基盐酸化为氨离子，去离子水漂洗，氮气吹干，获得带正电荷的人工晶状体表面；接着将上述表面带正电的人工晶状体浸入0.01mg/mL的带负电的肝素水溶液中120分钟，去离子水漂洗，氮气吹干；此后浸入0.01μg/mL的带正电的抗转化生长因子β2抗体的PBS溶液(0.05mol/L，pH＝4)中，吸附120分钟，用PBS溶液漂洗，氮气吹干；重复以上步骤可获得表面带有1-20层抗转化生长因子β2抗体的人工晶状体。最后取出人工晶状体用去离子水清洗，氮气吹干，室温下真空干燥密封包装。

实施例4：

本实施例所用的人工晶状体与实施例3中相同，与实施例3中不同的是人工晶状体表面预处理获得正电荷的方法，而其后的组装过程所用的试剂和方法与实施例3中相同，均为带负电的肝素和带正电的抗转化生长因子β2抗体。本实施例中的表面预处理方法是：将人工晶状体浸入3mg/mL的带正电的聚乙烯亚胺水溶液中15分钟，去离子水漂洗，氮气吹干获得聚乙烯亚胺物理吸附的的表面，该表面在水溶液条件下呈正电性。

本实施例与实施例3的共同之处在于人工晶状体表面经表面预处理后均带有正电荷，表2是此后在人工晶状体表面选用不同于肝素的带负电荷的其它聚电解质(PSS、海藻酸钠、透明质酸钠)和带正电荷的抗转化生长因子β2抗体进行静电层层自组装的例子，每一例均能制造出本发明的表面带有抗转化生长因子β2抗体膜的人工晶状体。表2中所用带负电的聚电解质是不同于实施例3和实施例4中所用的肝素的其它聚电解质；表2中溶解抗转化生长因子β2抗体所用的PBS溶液pH均低于6.8，在此条件下抗转化生长因子β2抗体带正电。

表2

实施例5：

本实施例与实施例1的不同之处在于在二氧化碳气体等离子体处理使得人工晶状体表面带负电荷之后，浸入浓度为5mg/mL的带正电荷的多聚赖氨酸的水溶液和500μg/mL带负电的抗转化生长因子β2抗体的PBS溶液之前，还增加一道步骤，将表面带负电荷的人工晶状体浸到5mg/mL的带正电的强电解质PAH溶液中吸附15分钟，用去离子水漂洗，氮气吹干，获得带正电荷的表面；然后将其浸到5mg/mL的强电解质PSS水溶液中15分钟，去离子水漂洗，氮气吹干，获得带负电荷的表面；重复以上步骤即可在人工晶状体表面获得2-6层PAH/PSS交替存在的底层。在人工晶状体表面组装了电荷密度高的强电解质的底层后，有利于后续的抗转化生长因子β2抗体的组装。

本实施例的人工晶状体的结构和制法可从图2中看到；该图是本实施例人工晶状体表面静电层层自组装过程的示意图，它是以疏水性聚丙烯酸酯的人工晶状体为例，在表面构建(PAH/PSS)₂/(多聚赖氨酸/抗转化生长因子β2抗体)多层膜，亦即组装了两个双层(PAH/PSS)、一个双层(多聚赖氨酸/抗转化生长因子β2抗体)的本发明表面带有抗转化生长因子β2抗体膜的人工晶状体的示意图；图2中以1’-6’表示制造过程的六个步骤，a表示软性疏水性聚丙烯酸酯人工晶状体，b-e表示各个步骤中所用到的试剂，+表示正电荷，-表示负电荷，其中，1’表示二氧化碳等离子体处理后使人工晶状体表面产生羧基而带负电荷，2’表示带正电的PAH组装到人工晶状体表面，3’表示带负电的PSS组装到人工晶状体表面，4’表示在人工晶状体表面再次交替组装PAH/PSS形成带电荷密度高的底层以利于下一步抗体的组装，5’表示带正电荷的多聚赖氨酸组装到人工晶状体表面，6’表示pH＝7.4条件下带负电荷的抗转化生长因子β2抗体组装到人工晶状体表面。b表示带正电的多聚赖氨酸，c表示pH＝7.4条件下带负电的抗转化生长因子β2抗体，d表示带正电的PAH，e表示带负电的PSS。

本实施例中的带正电的强电解质PAH可以换用不同浓度或换用其它带正电的强电解质，例如以表3中所示的带正电的强电解质PDDA，对表面预处理过的带负电荷的人工晶状体表面进行组装，以形成带电密度高的底层的例子(表3中仅列出组装该底层的有关参数)；表3中的两例均能制造出本发明的表面带有抗转化生长因子β2抗体膜的人工晶状体。

本实施例中的带正电的强电解质PAH也可以换用表3以外的其它带正电的强电解质以对经预处理过的带负电荷的人工晶状体表面进行组装而形成带电密度高的底层。

表3

本发明还对上述各实施例中制得的表面带有抗转化生长因子β2抗体膜的人工晶状体作了以下的测定：

1)用石英晶体微天平的频率变化跟踪人工晶状体表面(PAH/PSS)₃/(多聚赖氨酸/抗转化生长因子β2抗体)₃静电自组装过程，如图3所示：它是以实施例5为例，组装三个双层(PAH/PSS)，三个双层(多聚赖氨酸/抗转化生长因子β2抗体)，图中的横坐标表示组装层数、纵坐标表示频率变化，其中奇数层中1、3、5层表示PAH，7，9，11层表示多聚赖氨酸，偶数层中2、4、6层表示PSS，8、10、12层表示抗转化生长因子β2抗体。其结果显示多层膜组装的频率变化随着组装层数的增加呈线性增加，而频率变化与重量变化呈正比，从而证明了(PAH/PSS)₃/(多聚赖氨酸/抗转化生长因子β2抗体)₃多层膜的成功构建，也就是用实施例5的步骤能制得本发明的人工晶状体。

2)以体外巨噬细胞粘附试验观察本实施例表面带有抗转化生长因子β2抗体膜的人工晶状体对巨噬细胞粘附行为的影响。用实施例1制得的人工晶状体和未修饰的人工晶状体均用环氧乙烷熏蒸的方法消毒后，将其平放在24孔培养板中，将巨噬细胞以1.0×10⁶/mL的密度接种于每个人工晶状体表面，每孔30μL进行细胞培养。分为两组，每组三个人工晶状体，一组为未修饰的人工晶状体，另一组为多层膜修饰的人工晶状体。培养24小时后用倒置相差显微镜对两组人工晶状体表面粘附的巨噬细胞进行比较。其结果如图4所示，其中图4(a)为未修饰的人工晶状体，图4(b)为本实施例的人工晶状体，前者表面粘附的巨噬细胞数量明显少于后者，亦即本实施例的人工晶状体大大减少了炎性细胞的粘附，提高了生物相容性。

3)以体外晶状体上皮细胞培养观察表面带有抗转化生长因子β2抗体膜的人工晶状体对转化生长因子β2诱导的晶状体上皮细胞行为的影响。取实施例2制得的人工晶状体和未修饰的人工晶状体，且均用环氧乙烷熏蒸的方法消毒后，将其平放在24孔培养板中，将晶状体上皮细胞以6.0×10⁴/mL的密度接种于每个人工晶状体表面，每孔30μL进行细胞培养。分为两组，每组三个人工晶状体，一组为未修饰的人工晶状体，另一组为本实施例中的人工晶状体，两组均在培养板中加入10ng/mL转化生长因子β2，于24小时后用倒置相差显微镜观察晶状体上皮细胞。未修饰人工晶状体表面的晶状体上皮细胞在转化生长因子β2的诱导下发生细胞间隙增加，移行明显，变为明显的长梭形，呈现向成纤维细胞转化的趋势，如图5(c)所示；本实施例的人工晶状体正常培养的晶状体上皮细胞呈多角形，细胞透亮，胞质丰富，大多维持多角形的正常形态，未表现出纤维化的趋势，移行不明显，如图5(d)所示；从上述上皮细胞说明，本实施例人工晶状体能够明显抑制转化生长因子β2所引起的上皮-间叶细胞转分化和细胞移行等有害行为，维持晶状体上皮细胞的正常形态和行为，从而抑制人工晶状体植入后的囊膜皱缩，后发性白内障等并发症，提高术后远期视力。

上述实施例中所使用的抗转化生长因子β2抗体从英国的剑桥抗体技术公司购得。上述实施例中所用的其他试剂均可从国内外化学试剂公司购得。离体巨噬细胞粘附试验中所用细胞为小鼠腹腔巨噬细胞，从6-8周龄的BALB/c小鼠腹腔提取，离体晶状体上皮细胞培养中所用细胞为人晶状体上皮细胞系HLEB-3，从日本购得。