绞股蓝提取物及其制备方法和其在预防和治疗脂肪肝和亚健康状态药物中的应用

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

实施例2-6中绞股蓝多糖和绞股蓝总皂甙是采用下述步骤进行提取：

(1)取绞股蓝净药材投入超声波中药提取罐中，加入0.5％碳酸钙细粉以调节pH＝8-10，加水提取2次，过滤后于二效浓缩蒸发器中进行真空浓缩，真空浓缩有效温度控制在80～85℃，真空度控制在-0.06～0.07MPa，浓缩为相对密度为1.15～1.20(80℃热测)，放凉。

(2)浓缩液加入95％(v/v)食用乙醇，边加边搅拌至含醇量达59～61％(v/v)，静置12小时，取上清液；沉淀物用60％(v/v)食用乙醇洗涤2次，收集洗涤液与上清液合并备用。

(3)上清液置酒精回收塔中回收乙醇后，通过大孔树脂柱D101，以40％～60％(v/v)食用乙醇洗至洗脱液无色后，收集洗脱液减压回收乙醇并浓缩，浓缩后浸膏的相对密度为1.20～1.25，将浸膏干燥后得黄色粉末(绞股蓝总皂甙，备用)。

(4)将步骤(2)中洗涤后的沉淀物挥干乙醇，用蒸馏水回流提取2次，每次10分钟，合并上清液，离心除去沉淀，上清液减压浓缩，加入95％(v/v)乙醇，使含醇量达79～81％(v/v)，低温过夜，离心，沉淀物低温干燥，得绞股蓝多糖。

(5)将绞股蓝多糖与绞股蓝总皂甙按比例配制。

实施例2绞股蓝总皂甙片

处方：绞股蓝总皂甙20g    淀粉180

取上述原料于混料器中采用等量递增的方法混匀，全粉末压片，每片重200mg，含绞股蓝总皂甙20mg。

实施例3.绞股蓝新组分A

处方：绞股蓝总皂甙20g    绞股蓝多糖5g    淀粉175g

取上述原料绞股蓝总皂甙和绞股蓝多糖于混料器中采用等量递增的方法混匀，全粉末压片，每片200mg，每片含绞股蓝总皂甙20mg，绞股蓝多糖5mg。

实施例4.绞股蓝新组分A1

处方：绞股蓝总皂甙20g    绞股蓝多糖20g    淀粉160g

取上述原料绞股蓝总皂和绞股蓝多糖于混料器中采用等量递增的方法混匀，全粉末压片，每片200mg，每片含绞股蓝总皂甙20mg，绞股蓝多糖20mg。

实施例5.绞股蓝新组分B

处方：绞股蓝总皂甙20g    绞股蓝多糖3g    淀粉160g

取上述原料绞股蓝总皂甙和绞股蓝多糖于混料器中采用等量递增的方法混匀，全粉末压片，每片200mg，每片含绞股蓝总皂甙20mg，绞股蓝多糖3mg。

实施例6.绞股蓝新组分C

处方：绞股蓝总皂甙20g    绞股蓝多糖25g    淀粉155g

取上述原料绞股蓝总皂甙和绞股蓝多糖于混料器中采用等量递增的方法混匀，全粉末压片，每片200mg，每片含绞股蓝总皂甙20mg，绞股蓝多糖25mg。

下面通过对绞股蓝新组分进行动物实验研究和临床研究的阐述，说明本发明在治疗脂肪肝、肥胖降血脂方面的作用，并且证实了绞股蓝新组分对以慢性疲劳为主要症状的亚健康状态的防治作用。

(一)绞股蓝提取物对代谢性疾病影响作用的实验研究

1.抗氧化作用的影响

1.1  方法：大鼠40只，雄性，体重240g±12g，随机分为4组：

A组：正常组，给蒸馏水；

B组：模型组，给CCl₄(150mg/kg)；

C组：CCl₄加绞股蓝总皂甙片(15mg/kg)；

D组：CCl₄加绞股蓝新组分A(15mg/kg)。

绞股蓝和蒸馏水组每天一次灌胃给药(1ml/100g)，灌胃前禁食16h，连续10d。CCl₄于第1、3d腹腔注射给药。末次给药后24h处死动物，立即取出肝脏放入4℃生理盐水中洗去浮血、剥除脂肪及结缔组织，吸干水份、称重、剪碎，按1g组织加入9ml 0.25mol/Lsucrose-0.01mol/L Tris-HCl缓冲液、匀浆。取部分肝匀浆经500g离心、20min去胞核碎片后，经104g离心10min，沉淀物为线粒体。取上清液经105g离心65min，沉淀物为微粒体。肝匀浆、微粒体、线粒体脂质过氧化物(LPO)含量用TBA比色法测定；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性用DTNB法测定。用酶法测定血清谷丙转氨酶(ALT)。蛋白质含量用Lowry法测定。用单因素方差分析法进行统计。

1.2  结果：

1.2.1  绞股蓝有效组分对大鼠ALT活性的影响    C、D组ALT显著低于B组，但仍高于A组，见表1，表明绞股蓝提取物能减弱CCl₄对肝功能的损害，且以D组的绞股蓝新组分A为优(P＜0.01)。

1.2.2绞股蓝新组分A对大鼠肝脏LPO、GSH-Px活性的影响

C、D组LPO明显低于B组，而GSH-Px活性高于B组，虽然C、D组LPO和GSH-Px未完全恢复到A组水平，但与B组相比较，差异显著(P＜0.05)，且以绞股蓝新组分A为优。见表2。

表1  对大鼠ALT活性的影响(X±S，n＝10)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；

表2  对大鼠肝脏LPO、GSH-Px活性的影响(X±S，n＝10)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

结论：绞股蓝总皂甙及绞股蓝多糖按本发明特定比例形成的组合物能提高机体的抗氧化能力，并可抑制脂质过氧化产物形成；且能保护肝脏受损大鼠的自由基除酶系的活力，减弱自由基作用于肝细胞膜的脂质过氧化作用，从而在一定程度上减弱了CCl₄对肝脏的损伤，且优于单纯的绞股蓝总皂甙。

2对肥胖大鼠体重、腹腔脂肪含量、血清总胆固醇、甘油三酯的影响

2.1方法：选用体重150～180g健康大鼠56只，雌雄各半，随机分为7组：

A组：正常组

B组：模型组

C组：绞股蓝总皂甙片组

D组：绞股蓝新组份A组

E组：绞股蓝新组份B组

F组：绞股蓝新组份C组

G组：绞股蓝新组份A1组

A组(正常组)喂普通饲料，B组(模型组)、C-G组绞股蓝提取物组均喂高脂饲料(内含2％胆固醇，10％猪油，0.5％胆酸钠，4％白糖，83.5％基础饲料)。A组和B组每天上午按2ml/100g给自来水，C-F组灌胃给药0.03g/kg，2ml/100g，连续40天，第41天空腹称重后剪尾采血测血脂，继续给药饲养至第44天，以戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后颈动脉采血，肝素抗凝测血液流变学，并剖取肝脏观察肝脂肪变情况，测定腹腔脂肪含量。

2.2  结果：

2.2.1  对肥胖大鼠血脂的影响    与B组(模型组)比较，C组(绞股蓝总皂甙组)、D组(绞股蓝新组分A组)、G组(绞股蓝新组分A1组)TC、TG水平下降明显，有显著差异，对HDL-c有升高趋势，LDL-c、AI显著下降，降血脂作用以D组(绞股蓝新组分A组)作用更优(P＜0.01)。E组(绞股蓝新组分B)组、F组(绞股蓝新组分C组)部分指标也有作用，但效果较差，见表3。

2.2.2对肥胖大鼠血液流变学、体重增值、肝脂肪肝发生率及腹腔脂肪含量的影响  与B组(模型组)比较，C组(绞股蓝总皂甙组)、D组(绞股蓝新组分A组)、G组(绞股蓝新组分A1组)全血比粘度、红细胞压积、体重增值及腹腔脂肪含量明显降低，B组脂肪占其体重的4.26％，C组、D组、G组腹腔脂肪占体重的4.1％和3.79％，3.87％，E组和F组分别为4.2％和4.15％，效果较差，见表4。

表3  对肥胖大鼠血脂的影响(X±S，n＝8)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

表4  对肥胖大鼠血流变学、体重增值、肝脂肪肝发生率及腹腔脂肪含量的影响(X±S，n＝8)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.0 1。

结论：绞股蓝总皂甙以及由绞股蓝多糖和绞股蓝总皂甙组成的组合物均能改善高脂血症大鼠的血液浓、粘状态，减缓体重，抑制脂肪肝的发生，具有减少脂肪沉积，减轻体重的作用，以绞股蓝新组分A、绞股蓝新组分A1疗效好。

(二)绞股蓝总皂甙及组合物对混合型脂肪肝的防治作用研究

1.1.实验动物

健康SPF级SD雄性大鼠104只(体重170±20g)，由广东省实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(粤)2003-0002，粤监证字2007A003。

1.2.药物

绞股蓝总皂甙片(实施例2)，绞股蓝新组分A(实施例3)，绞股蓝新组分B(实施例5)，绞股蓝新组分C(实施例6)，绞股蓝新组分A1(实施例4)广州白云山和记黄埔中药有限公司制备。

洛伐他汀片(批号：20060901)  北京万生药业有限责任公司。

食用酒精(红星二锅头，批号：GB/T10781.2-89，酒精度55％VOL)

北京红星股份有限公司(以下简称酒精)。

1.3.仪器

旋涡混合器    江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司

LAC-110.4型电子分析天平德国赛多利斯(ACCULAB)股份公司

TDL80-2B离心机                上海安亭科学仪器厂

TGL-16G型高速冷冻离心机       上海安亭科学仪器厂

ZS-831型内切式组织匀浆器      浙西机械厂

DK-S₂₂型电热恒温水浴锅        上海精宏实验设备有限公司

低温离心机                    Sigma公司

TU-1800紫外-可见分光光度计    北京普析通用仪器有限公司

1.4.实验方法

将大鼠适应性饲养1周，随机分为10组：

A组：空白组；

B组：模型组；

C组：洛伐他汀组；

D1组：绞股蓝总皂甙片低剂量组；

D2组：绞股蓝总皂甙片高剂量组；

E1组：绞股蓝新组分A低剂量组；

E2组：绞股蓝新组分A高剂量组；

F组：绞股蓝新组分B高剂量组；

G组：绞股蓝新组分C高剂量组；

H组：绞股蓝新组分A1高剂量组。

其中C组的洛伐他汀组为阳性药物组。

每天观察记录大鼠摄食情况(按50g/kg·d^-1/只喂饲相应的饲料)，每周末称重，根据大鼠体重变化相应调整给药及灌胃55°红星二锅头(药物：洛伐他汀组2mg/kg·d^-1/只，绞股蓝总皂甙片组和各绞股蓝新组分低、高剂量组分别为15mg/kg·d^-1/只(相当于成人临床用量的5倍)，30mg/kg·d^-1/只(相当于成人临床用量的10倍)。酒精：10ml/kg·d^-1/只)。每天上午空白组给予普通饲料，模型组和各绞股蓝新组分组给予高脂饲料(81％基础饲料+10％猪油+0.5％胆酸钠+1.5％胆固醇+2％蛋黄粉+5％糖，由广东省实验动物中心提供)，同时模型组和药物组灌胃酒精，空白组给予等容量生理盐水。每天下午药物组灌胃相应剂量的药物，空白组、模型组给予等量生理盐水。每天灌胃的同时观察大鼠的一般状况(毛发、饮食、体态活动、粪便)。于第10周末宰杀动物并进行相应的实验检测：

(1)观察摄食量、体重增长状况、计算肝指数。

(2)检测大鼠血清中TC、TG、FFA、HDL-C、LDL-C、MDA的含量及ALT、AST、SOD的活性。

(3)检测大鼠肝组织匀浆中TC、TG、FFA、MDA的含量及ALT、AST，、SOD的活性。

(4)观察肝组织病理变化。

1.5实验结果

1.5.1一般状况观察

A组(空白组)大鼠活动状态，其毛发有光泽，体态活泼，反应敏捷，食量、排泄物均正常。B组(模型组)大鼠灌胃酒精后部分有嗜睡的情况，其毛发欠光泽，灌胃酒精后活动减少，睡眠较多，粪便时稀软；喂饲高脂饲料的模型组大鼠体重增长相对空白组表现明显。1.5.2绞股蓝总皂甙片和绞股蓝新组分对脂肪肝大鼠体重及肝指数的影响

表5  各组大鼠体重变化情况(x±s)

表5续  大鼠体重变化情况(x±s)

注：与模型组比较^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01。

表5显示：各组大鼠体重增长较快，其中B组(模型组)增长最快，在7周时开始明显高于空白组，8周时与空白组比较在统计学上有显著意义，9周、10周时与空白组比较在统计学上有非常显著意义，说明喂饲高脂饲料的模型组大鼠体重增长相对空白组表现明显。而各药物组体重增长较模型组慢，无显著性差异。

表6  绞股蓝总甙及其组合物对大鼠肝指数的影响(x±s)

注：与模型组比较^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01

表6显示：B组(模型组)肝指数明显高于A组(空白组)，统计学上有非常显著意义(P＜0.01)。绞股蓝总皂甙和绞股蓝新组分A组低、高剂量组，绞股蓝新组分A1高剂量组肝指数明显低于模型组，与模型组比较在统计学上有非常显著意义(P＜0.01)，低于洛伐他汀组，说明绞股蓝总皂甙和新组分A组、新组分A1组抑制肝脏肥大的效果明显。

1.5.3绞股蓝总和新组分对脂肪肝大鼠血脂的影响

表7  绞股蓝总甙及其组合物对大鼠血清TG、TC、FFA含量的影响(x±s)

注：与模型组比较^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01；与空白组比较^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

表7显示：绞股蓝总皂甙片及绞股蓝多糖与绞股蓝总  皂甙组合物能降低大鼠血清TG、TC、FFA的含量。

表8  绞股蓝总甙及其组合物对大鼠血清HDL-C、LDL-C含量的影响(x±s)

注：与模型组比较^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01；与空白组比较^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

表8显示：绞股蓝总皂甙及其与绞股蓝多糖组成的组合物能降低大鼠血清LDL-C含量，升高HDL-C含量，且组合物效果更明显。

1.5.4.绞股蓝总及其新组分对脂肪肝大鼠肝脂的影响

表9  绞股蓝总甙及其组合物对大鼠肝组织TG、TC、FFA含量的影响(x±s)

注：与模型组比较^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01；与空白组比较^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

表9显示：绞股蓝总皂甙及其与绞股蓝多糖形成的组合物能降低大鼠肝组织TG、TC、FFA含量

1.5.5绞股蓝总甙及其组分对脂肪肝大鼠肝功能的影响

表10  绞股蓝总甙及其新组分对大鼠血清及肝组织ALT、AST含量的影响(x±s)

注：与模型组比较^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01；与空白组比较^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

表10显示：绞股蓝总皂甙及其与绞股蓝多糖构成的组合物具有保肝降酶的作用，但疗效以绞股蓝新组分A为好。

1.5.6绞股蓝总甙及其组合对混合型脂肪肝肝组织病理切片

切片如图1-图6所示。由图1可以看出，混合性脂肪肝大鼠模型肝组织HE染色病理图片显示空白组动物肝细胞结构完整，核居中，肝细胞索排列整齐。由图2可以看出，模型组肝细胞出现广泛的大小不等、数量不一的脂肪滴，细胞核被脂肪滴挤压明显偏位，脂肪变表现明显(图中箭头所指)。由图3可以看出，洛伐他汀组不同区域肝细胞周围出现大小不等、数量不一脂肪滴。由图4和图5可以看出，绞股蓝总皂甙组、绞股蓝新组分B组也有脂滴，部分细胞核被挤向一侧，绞股蓝新组分C组与图5一致。由图6可以看出，绞股蓝新组分A组脂肪变最轻，脂滴较少，核居中，肝细胞结构较完整。从对混合型脂肪肝的治疗效果来分析，绞股蓝总皂甙的疗效为45％，绞股蓝新组分A的疗效为87％，绞股蓝新组分A1的疗效为72％，绞股蓝新组分B的疗效为42％，绞股蓝新组分C的疗效为37％，可见绞股蓝总皂甙和绞股蓝新组分对混合型脂肪肝均有治疗作物，但绞股蓝新组分A，绞股蓝新组分A1的疗效明显优于其它各组(P＜0.01)。

(三)对防治亚健康状态的实验研究

1对小鼠免疫器官胸腺、脾脏重量的影响

1.1方法：取体重18-20g健康小鼠，雌雄各半，随机分组。除空白对照组外，其余各组均皮下注射环磷酰胺40mg/kg，每天一次，连续3天，造成免疫功能低下模型，空白组皮下注射等容积生理盐水。从造模当天起灌胃给药，空白组和模型组灌服等容积生理盐水，每天一次，连续8天。末次给药后24h处死动物，称体重，摘取胸腺及脾脏称重，以胸腺或脾脏与体重之比作为胸腺或脾脏指数。

1.2结果：绞股蓝能显著提高免疫器官胸腺、脾脏重量，提高小鼠免疫功能，且以绞股蓝新组分A和A1作用最优(P＜0.01)。见表11。

表11  绞股蓝对小鼠免疫器官胸腺、脾脏重量的影响(X±S)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2抗衰老作用的实验研究

2.1方法：实验用雄性大鼠220～250g，按体重随机分组。除正常组外，其余各组皮下注射D-半乳糖(125mg/kg/d，过滤灭菌)，注射后，模型组不给药，绞股蓝组予100mg/kg.d灌胃给药，生理盐水组灌服1mL/kg/d等容积生理盐水，连续40d。然后断头处死大鼠，迅速取出下丘脑内侧基底组织，称重后置于匀浆器中研磨，匀浆液在4℃时2800r/min离心30min，取上清-20℃保存，待用。按照试剂盒检测说明检测其中SOD、MDA、NOS、NO含量。

2.2结果：衰老模型组SOD活性明显降低，MDA水平明显增高，NOS、NO含量均明显增高，与正常对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。在应用绞股蓝治疗后，SOD活性明显增高，而MDA水平明显降低，NOS、NO含量亦明显降低。与正常对照组和衰老模型组比较均有显著差异(P＜0.05或P＜0.01)。说明绞股蓝具有延缓衰老作用。其机制可能是通过清除脑组织自由基含量，提高机体的抗氧化能力实现的。见表12。

表12  对D-半乳糖所致亚急性衰老大鼠下丘脑SOD、MDA、NOS、NO含量影响(X±S)

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

3抗应激作用的实验研究

(1)小鼠耐缺氧实验

1.1方法：选择健康小白鼠，体重18-20g，雌雄各半。随机分组。每日灌胃给药1次(对照组用等容积蒸馏水)，连续给药5天，于末次给药后1h，将动物放入50ml注射器内(1只小鼠)，用封口胶将两端封死，使之不漏气。立即计时，以呼吸停止为指标，观察小鼠致缺氧而死亡的时间。

1.2结果    绞股蓝和补中益气丸均可明显延长小鼠耐缺氧存活时间(P＜0.05)。见表13。

表13  绞股蓝对小鼠缺氧存活时间的影响(X±S)

注：与对照组比较，*P＜0.05

(2)小鼠耐疲劳实验(小鼠游泳试验)

2.1方法：选择健康小白鼠，体重18-22g，雌雄各半。随机分组，每日灌胃给药一次(对照组用等容积蒸馏水)，第七天每组动物在尾部束一2g重的负重物，将动物放入玻璃缸内游泳，水深至20cm，水温保持在20℃±0.5℃，当小鼠头部沉入水中10s不能浮出水面，即为体力耗竭，即刻计时为小鼠游泳时间。

2.2结果    绞股蓝各组和补中益气丸均可延长小鼠游泳时间(P＜0.05)。见表14。

表14  绞股蓝对小鼠游泳时间的影响(X±S)

注：与对照组比较，*P＜0.05

综上所述，绞股蓝总皂甙和绞股蓝新组分，在预防治疗脂肪肝、肥胖、降血脂保肝、降酶等方面有较好的作用，且对以慢性疲劳为主要症状的亚健康状态和防治脂肪肝的作用优于常规提取的绞股蓝，且以绞股蓝新组分A和A1疗效为优。